Biomateriale PE Bază DE Mătase Naturală Bombyx Mori Pentru Ingineria Tisulară

UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCUREȘTI

Facultatea de Chimie Aplicată și Știința Materialelor

Protecția Consumatorului. Controlul Calității Produselor

BIOMATERIALE PE BAZĂ DE MĂTASE NATURALĂ BOMBYX MORI PENTRU INGINERIA TISULARĂ

COORDONATOR: Conf.dr.ing CĂTĂLIN ZAHARIA

MASTERAND: RALUCA AGIU-ȚĂPURICĂ

București

-iulie 2016-

Cuprins

Memoriu justificativ…………………………………………………………. 1

Partea de literatură………………………………………………………..… 3

Introducere Biomateriale………………………………………………………………………………..4

Clasificarea biomaterialelor…………………………………………………………………………….6

Proprietățile biomaterialelor…………………………………………………………………………….7

Polimeri pentru medicină………………………………………………………………………………..9

Mătase naturală Bombyx mori…………………………………………………………………………11

5.1 Noțiuni generale……………………………………………………………………………………..11

Nanoparticule de magnetită……………………………………………………………………………14

Aplicații ale mătăsii naturale Bombyx mori……………………………………………………..16

Concluzii……………………………………………………………………………………………………..23

Partea de cercetare……………………………………………………………………………..25

Introducere………………………………………………………………………………………………….26

Materiale și metode……………………………………………………………………………………..26

2.1 Materiale…………………………………………………………………………………………………26

2.2 Metode……………………………………………………………………………………………………27

2.2.1 Obținerea fibroinei din coconi de mătase………………………………………………….27

2.2.2 Obținerea soluției de fibroină…………………………………………………………………. 28

2.2.3 Sinteza gelurilor pe bază de fibroină, poliacrilamidă și nanoparticule de magnetită

……………………………………………………………………………………………………………………28

2.2.4 Evaluarea comportamentului la gonflare a hidrogelurilor obținute………………….30

2.2.5 Caracterizarea morfologică a hidrogelurilor obținute ( analiza AFM și SEM)….31

2.2.6 Evaluarea capacității de biomineralizare a hidrogelurilor obținute………………….32

Caracterizare biologică a hidrogelurilor pe bază de fibroină/poliacrilamidă și fibroină/poliacrilamidă/nanoparticule magnetice (teste de biocompatibilitate pe linii celulare specifice)……………………………………………………………………………34

Rezultare și discuții………………………………………………………………………………………..37

3.1 Evaluarea comportamentului la gonflare a hidrogelurilor pe bază de fibroină și poliacrilamidă cu diverse compoziții………………………………………………………………..37

3.2 Evaluarea comportamentului la gonflare a hidrogelurilor pe bază de fibroină, poliacrilamidă și nanoparticule de magnetită cu diverse compoziții……………………..38

3.3 Caracterizarea morfo-structurală a hidrogelurilor prin analiza AFM………………38

3.4 Caracterizarea morfo-structurala a hidrogelurilor obtinute prin analiza SEM…..40

3.5 Evaluarea capacității de biomineralizare a hidrogelurilor obținute…………..…42

3.6 Caracterizare biologică a hidrogelurilor prin teste de biocompatibilitate pe linii celulare specifice…………………………………………………………………………………………..44

Concluzii……………………………………………………………………………………………………..48

Referințe bibliografice…………………………………………………………………………………..49

MEMORIU JUSTIFICATIV

Dezvoltarea continuă a tehnologiei din ultimii ani a atras după sine o schimbare de direcție în domeniul cercetării științifice. Dacă în urmă cu două decenii activitatea de cercetare avea ca punct de interes materialele sintetice, de origine fosilă, în prezent grija pentru mediu și pentru sănătatea umană orientează cercetătorii spre materiale naturale, care prezintă o toxicitate scazută, sau chiar absentă, în funcție de domeniul de utilizare. În același timp, nevoia de aplicații din ce în ce mai numeroase ale materialelor necesită proprietăți complexe ale acestora și o performanță ridicată, iar în acest caz s-a demonstrat că originea acestora are un rol important: materialele de origine naturală posedă proprietăți fizice și chimice greu, sau imposibil de reprodus prin sinteză.

Mătasea naturală este una dintre cele mai vechi fibre cunoscute, folosite în domenii diferite. Versatilitatea acesteia a transformat-o într-un candidat excelent în domeniul medical, începand cu suturile chirurgicale. Fiind compusă din fibroină și sericină, două proteine cu proprietăți pe cât de diferite, pe atât de complementare, mătasea prezintă un interes deosebit pentru cerectatori în prezent, într-o continuă ascensiune. Fibroina reprezintă un material ce se pretează foarte bine domeniului biomedical datorită rezistenței mecanice superioare în stare umedă, bicompatibilității acesteia, permeabilității pentru oxigen și vaporii de apă, precum și rezistenței ridicate la degradarea enzimatică. Datorită acestor beneficii, aplicațiile în domeniul medical au fost sugerate pentru suturi chirurgicale, cosmetică, imobilizarea enzimelor, acoperirea rănilor, substrat pentru culura celulară, medicamente cu eliberare controlată și schelet pentru ingineria țesuturilor.

Fibroina poate fi utilizată la realizarea diferitelor tipuri de pansamente în chirurgie, deoarece accelerează procesul de vindecare a rănilor și arsurilor și pot fi ușor îndepartate fără a deteriora țesutul nou format. Fibroina simplă sau modificată chimic cu funcțiuni COOH sau OH servește la obținerea unor compozite hidroxiapatită-fibroină folosite ca os artificial. Prin dizolvare în anumiți solvenți și reconstituire prin precipitare, fibroina poate fi prelucrată în filme: geluri, pudre, spume sau chiar tuburi, având pereții poroși pentru înlocuirea vaselor de sânge. Din soluție se pot obține microparticule pentru eliberarea controlată de principii active sau suporturi de diferite forme pentru culturi de celule pentru studii ori în vederea reconstrucției diferitelor țesuturi.

Studiul de față „Biomateriale pe bază de mătase naturală Bombyx mori pentru ingineria tisulară” are ca scop utilizarea acestor proprietăți ale fibroinei, ce accentuează rolul important al acesteia în medicină. O importantă direcție de studiu o constituie mineralizarea hidrogelurilor pe bază de fibroină pentru obținerea de hidroxiapatită osoasă pe suprafața acestora. Aceasta se bazează pe proprietatea fibroinei simple, sau modificată chimic, de a servi la obținerea unor compozite hidroxiapatită-fibroină folosite ca os artificial, în patologia osoasă. După datele generale despre mătase, privind istoria, modul de obținere, proprietăți și aplicații, se va vorbi despre modul de lucru și materialele implicate în prezentul studiu, precum și rezultatele obtinute.

Evidentierea rezultatelor se va face cu aparate de analiză moderne, precum Microscopul electronic de baleiaj (SEM – en. Scanning Electron Microscopy) și Microscopie cu forță atomică (AFM – en. Atomic Force Microscopy).

Alinierea la modul de viată, precum și nevoia de a ameliora modul de tratare a afecțiunilor în medicină, plasează biomaterialele de origine naturală în interesul științei medicale. Cerecetarea în acest domeniu atât de vast, deși datează de câteva decenii, se poate considera abia la început.

Obiectivele lucrării pe care le-am pacurs sunt:

Purificarea coconilor din mătase din specia Bombyx mori în vederea obținerii fibroinei (componenta proteică biocompatibilă)

Obținerea soluțiilor de fibroină prin dizolvare în solvent adecvat

Obținerea hidrogelurilor pe bază de fibroină, poliacrilamidă și nanoparticule magnetice

Evaluarea comportamentului la gonflare a hidrogelurilor sintetizate

Caracterizare morfologică a hidrogelurilor (analiza SEM și AFM)

Evaluarea capacității de biomineralizare a hidrogelurilor obținute

Caracterizare biologică a hidrogelurilor (teste de biocompatibilitate pe linii celulare specifice)

Partea de literatură

1. Introducere-Biomateriale

Știința biomaterialelor este “știința care se ocupă cu interacțiunile dintre organismele vii și materiale”, iar biomaterialele fiind “orice substanțe sintetice (metale și aliaje, materiale ceramice, polimeri, materiale compozite, etc.) sau natural (colagen, chitosan, celuloză) care pot fi folosite pe o perioadă de timp bine determinată, ca un întreg sau ca o parte componentă a unui sistem, capabil să interacționeze cu sistemele biologice în scopul tratării, creșterii sau înlocuirii oricărui țesut, organ sau funcție a corpului” [1].

Biomaterialele au o capacitate sporită de a se integra și de a fi tolerate de către organismul în care sunt implantate, fiind capabile să intre în contact cu fluidele biologice naturale și cu țesuturile umane fără a provoca reacții adverse și având foarte puține efecte nedorite. Biomaterialele trebuie să aibă un grad ridicat de inerție chimică [2].

Odată cu dezvoltarea biomaterialelor au apărut și probleme legate de tipul și designul materialului folosit pentru implanturi, care au condus la pierderea prematură a funcțiilor implantului din cauza deteriorărilor mecanice, coroziunii sau biocompatibilității insuficiente. Biocompatibilitatea, biofuncționalitatea și îndeplinirea unui anumit rol, specific țesutului și locației în care va fi implantat materialul suntfactorii decisivi pentru utilizarea lor în dispozitive medicale și implanturi [1].

Inițial biomaterialele au fost utilizate pentru înlocuirea fizică a țesuturilor dure sau moi, degradate sau distruse în urma unor procese patologice. Deși țesuturile și structurile corpului uman funcționează pentru perioade foarte mari de timp, acestea pot suferii diferite procese distructive precum fracturi, infecții, cancer, care cauzează durere, desfigurare sau pierderea funcțiilor organismului. În aceste condiții, țesutul bolnav poate fi îndepărtat și înlocuit cu un material sintetic adecvat [1].

Domeniile de aplicații ale biomaterialelor sunt vaste: ortopedia, chirurgia estetică, oftalmologia, chirurgia maxio-facială, cardiologia, urologia și practic toate specialitățile medicale care nu numără mai puțin de 400 de produse diferite și 10% din activitățile medicale necesită utilizarea de biomateriale în diferite scopuri de diagnosticare, prevenție și terapie [3].

Din categoria biomaterialelor folosite pentru realizarea implanturilor și a dispozitivelor medicale fac parte următoarele materiale: polimerii, metalele, ceramicele și compozitele. O gamă largă de polimeri se folosesc în aplicațiile medicale, aceasta datorându-se faptului că aceștia se găsesc sub forme complexe și compoziții (solide, fibre, fabricate, filme și geluri). Metalele sunt folosite în cazul implnaturilor ortopedice, fiind cunostute pentru rezistența mare la uzură, ductibilitate și duritate ridicată.

Principalele dezavantaje al acestor metale sunt rigiditatea ridicată pe care o au în comparativ cu țesuturile gazdă, precum și tendința acestora de a creea artefacte în cazul procedeelor de diagnosticare avansate (investigarea cu computerul tomograf și rezontanță magnetică) [3].

Ceramicele sunt, de asemenea, foarte des întalnite în aplicațiile medicale datorită unei biocompatibilități bune cu țesutul gazdă, o rezistență ridicată la compresiune și coroziune.

Figura 1. Aplicații ale biomaterialelor în medicină [3]

2. Clasificarea biomaterialelor

Biomaterialele pot fi împărțite în mai multe categorii, în funcție de diferite criterii.

După natura chimică:

biomaterialele metalice sunt folosite pentru aplicații în care implantul este supus unor solicitări mecanice importante și trebuie să aibă o rezistență mărită la oboseală pentru a face față activităților zilnice la care este supus: mers, mestecat, etc.

biomaterialele cermice sunt utilizate în general pentru duritatea lor și rezistența ridicată la uzură în aplicații, precum suprafețe de articulație pentru șold sau dinte dar și pentru proprietăți de inițiatori de refacere osoasă, ca suprafețe de legare cu osul în implanturi.

biomaterialele polimerice se folosesc datorită stabilității și elasticității lor pentru tendoane și ligament, fiind utilizate de asemenea în suprafețe de articulație cu frecare scăzută datorită proprietăților antifrecțiune și anticoagulante.

biomaterialele composite(metaloceramice, polimerceramice, metalopolimerice, ceramice) se utilizează datorită combinațiilor neobișnuite de rezistență mecanică, duritate, greutate, stabilitate la temperaturi înalte și la coroziune sau conductivitate termică și electrică [3].

După gradul de tolerare în organism:

temporare- fibre de sutură, proteze esofagiene, unele atele ortopedice, sonde-diagostic, etc;

permanente- sârme de sutură și bypass, proteze cardice, proteze ortopedice, opto-lentile orculare, etc;

După funcția de realizat:

înlocuire de țesut dur- în ortopedie (atele, capace), dentistică (implanturi, coronane);

înlocuire de țesut moale- în cardiologie (artere), oftalmologie (lentile);

biomateriale cu funcții specifice- membrane pentru industria farmaceutică, membrane de dializă, stimulare cardiac, plămân artificial, biomateriale de diagnostic, terapie, instrumentație;

După localizare biomaterialele pot fi:

intracorporale- realizate sub formă de dispositive complexe de stimulare a proceselor fiziologice (rinichi artificiali pentru dializa sângelui, plămân artificial de oxigenare a sângelui, inima artificială, pancreas artificial pentru eliberarea de insulină), sub formă de dispositive semipermanente sau pentru dispozitive temporare;

paracorporale- utilizate la interfața cu mediul biologic;

extracorporale- utilizate pentru transportul sângelui și a lichidelor transfuzabile, containere farmaceutice, tuburi, seringi, instrumente chirurgicale, material de împachetare (sterile și nesterile);

După interacția cu organismul, se cunosc materiale:

bioinerte- care nu provoacă răspuns (sau provoacă răspuns minim) din partea gazdei, deci nu interacționează cu țesutul viu cum ar fi porțelanul dentar sau unele biosticle;

bioactive- care presupun interacțiuni fizico-chimice cu țesutul viu și dau răspunsuri benefice, refacerea în zona de contact;

biotolerate- separate de organism printr-o interfață suficient de groasă încât nu apar perturbări importante de compatibilitate cu acestea;

bioresorbabile- supuse unui proces de dizolvare/ resorbție după introducere în organism, sunt treptat înlocuite prin avansul țesutului viu;

hibride- care presupun asocierea unui material inert cu celule vii [4].

3. Proprietățile biomaterialelor

Un biomaterial poate să aibă toate caracteristicile mecanice, fizice și chimice cerute de o aplicație medicală, dar la contactul cu mediile biologice, inclusiv cu organismul uman, el găsește condiții fiziologice particulare cu care interaționează prin procese specifice, precum difuzia de ioni și fluide, drenaj limfatic, circulația sângelui, dar și prin mecanisme fiziologice (locale și sistematice) mai puțin previzibile. Aceste reacții specifice fac ca materialul să fie sau nu tolerat de mediul respectiv. Mai mult, în același organism uman, aceste condiții mecanice, fizico-chimice și fiziologice variază într-un domeniu destul de larg.

Un material care îndeplinește la început toate cerințele de biocompatibilitate poate șă piardă în timp aceste calități nu numai datorită unor procese de uzură, oboseală, degradare, dar și pentru că țesuturile înconjurătoare,inițial sănătoase, se îmbolnăvesc sau pur și simplu îmbătrânesc [4].

Indiferent de aplicația medicală, un material biocompatibil trebuie să îndeplinească următoarele cerințe:

să nu fie toxic și să nu conțină produși filtranți;

să nu provoace fenomene de respingere de către organism;

să nu provoace efecte alergice, cancerigene, teratogene (generate de anomalii morfologice);

să nu provoace fenomene de respingere de către organism;

să nu modifice compoziția sângelui și să nu perturbe mecanismul coagulării (să fie hemocompatibil);

să nu modifice pH-ul biologic;

să nu provoace sedimentari în țesururi și biodegradări;

să nu conțină site hidrofile sau hidrofobe care să favorizeze pătrunderea și aderența celulară [4].

Teste de biocompatibilitate, după recomandări din ISO-10993 și EN-30993, cu următoarele precizări:

biocompatibilitatea materialelor în contact cu organismul viu se stabilește prin teste de laborator ( in vitro și ex vivo), teste preclinice ( in vivo) pe animale, iar în final prin teste clinice ( in vivo) pe organisme umane;

testele se realizează într-o ordine foarte precisă, în aceleași condiții de pH (bazicitate). temperatură, ca în organismul viu;

anumite teste se pot realiza atât in vivo cât și vitro, ele se numesc complementare;

testele sunt diferite, după cum materialele sunt în contact cu organismul viu pe durată limitată (24 h), prelungită (24 h-20 zile) și permanentă (peste 30 zile);

testele se fac cu materiale de referință (de control), procesate în aceeași manieră, cu aceeși compoziție chimică, sterilizate prin aceeași tehnică; este indicat ca materialul să nu fie nici cel mai performant; dar nici cel mai modest din punct de vedere al proprietăților de biocompatibilitate [3].

4. Polimeri pentru medicină

Polimerii sunt cele mai folosite materiale în cardul aplicațiile medicale. Aceste materiale pot fi folosite în realizarea de dispositive cardiovasculare (grefe vasculare, valve artificiale ale inimii), implanturi mamare, lentile de contact, lentile intraoculare, învelișuri pentru medicamente, ațe chirurgicale, adezivi și substituenți pentru sânge.

Tabelul 1. Exemple de polimeri utilizați în aplicații medicale [1,2]

Tabelul 2. Principalele domenii medicale de utilizare a polimerilor [1,2].

Comportamentul mecanic și termic al polimerilor este influențat de câțiva factori, incluzând compoziția chimică, structura lanțurilor polimerice, precum și masa atomică a moleculelor.

Mecanismul de degradare a polimerilor cu o structură semicristalină se împarte în trei mari etape. În prima etapă, părțile amorfe sunt dizolvate de apă. Acestă dizolvare nu afecteză rezistența mecanică a polimerilor. În cea de-a doua fază au loc atacuri ale enzimelor asupra polimerrului, iar cea de-a treia fază constă în eroziunea materialului. Factorii ce accelerează fenomenul de degradare a polimerilor sunt:

hidrofilia,

cristalinitatea,

masa moleculară.

Polimerii pot conține o mare varietate de aditivi, urme de catalizatori, inhibitori și alte componente chimice necesare pentru sintezele lor. Ca și în cazul coroziunii materialelor metalice, în timp, într-un mediu fiziologic, aceste componente chimice ale polimerilor sunt eliberate în organism, și pot produce reacții adverse din partea organismului uman.

Proprietățile mecanice ale materialelor polimerice depind de câțiva factori și anume compoziția și structura lanțurilor macromoleculare precum și masa atomică a acestora.

În comparație cu metalele și ceramicele, polimerii au o rezistență mecanică mai mică precum și un modul de elasticitate mai mic, dar pot fi deformați până la o valoare mai mare înainte de rupere [1].

5. Mătase naturală Bombyx mori

5. 1 Noțiuni generale

Mătasea naturală este produsă sub forma unui filament de către larva viermelui de mătase, care aparține ordinului Lepidoptera. Cea mai mare cantitate de mătase este produsă de specia Bombyx mori, o insectă care se hrănește cu frunze de dud.

Există și alte insecte care produc filamente dar, în afară de  Bombyx mori, numai larvele fluturelui Tussah și Anaphae produc gogoși care pot fi utilizate pentru fibre. 

Rasa Bombyx mori este considerată a fi o rasă domestică, sericicultura fiind ramura economică al cărui obiect este creșterea viermelui de mătase. 

Se deosebesc următoarele rase de viermi de mătase domestici (de dud) din specia Bombyx mori: 

rase europene; 

rase asiatice; 

rase din Orientul Apropiat.

Figura 2. Coconi de mătase Bombyx mori, poză din laborator

Firul de mătase se obține dintr-un lichid vâscos, produs în corpul larvei. Glanda care produce soluția de proteine constă dintr-o parte posterioară, sub formă de tub, lung de circa , un rezervor scurt, cu un diametru de 3–4 mm și o secțiune anterioară foarte subțire, care duce la orificiul sau filiera din capul larvei. Prin acest orificiu este extras filamentul de mătase. Imediat înainte de acest orificiu, cele două ramificații ale glandei se unesc, și în acest punct are loc secreția unei glande speciale.

Fibra, așa cum este produsă de insectă, se compune din două filamente de proteine, reunite la nivelul sistemului de filare al insectei, și anume fibroina, cimentată și înconjurată de o altă proteină, denumită sericină. Sericina formează o rețea în jurul fibroinei [5].

Figura 3. Structura mătăsii naturale [5].

Firul produs de vierme este format din două filamente cu un diametru de circa 6,5 µ, are finețe de la 1,75 la 4,0 denieri și este de culoare albă, galbenă sau gri, datorită pigmenților care se găsesc în majoritate în sericină. 

Conținutul de sericină și fibroină variază, după cum fibra este la începutul, mijlocul sau sfârșitul gogoșii. Proprietățile fizico-mecanice ale mătăsii sunt determinate de prezența sau absența sericinei.

Compoziția gogoșilor de mătase este următoarea: 

apă: 63,4%; 

fibră continuă de mătase: 14 %; 

puf exterior de mătase: 0,7%; 

crisalidă și strat interior de protecție: 22 %.

Pentru siguranță în conservare, trebuie să se distrugă crisalidele, prin uscarea gogoșilor în utilaje speciale, cu un curent de aer fierbinte de circa , timp de 90 min.

Proprietățile fizico-mecanice ale mătăsii

Proprietățile fizico-mecanice ale mătăsii plasează această fibră, pe lângă lână și bumbac, ca etalon între alte materiale fibroase. Proprietățile sunt determinate atât de structură, cât și de rasa viermilor. Rezistența mătăsii degomate este mai mică cu circa 25% față de rezistența dinainte de degomare [5].

Culoarea mătăsii naturale

Culoarea mătăsii brute este dată de pigmenții din sericină (galben, galben-verzui sau albă); după degomare, mătasea este alb strălucitoare.

Densitatea matăsii

Densitatea este variabilă, în funcție de zona de pe gogoașă; astfel:

fibra din zona exterioară: 1,442 g/cm3

la mijloc: 40 g/cm3

în interior: 1,32 g/cm3

iar mătasea degomată : 1,34 g/cm3

Diametrul fibrelor este:

20–30 µm la partea exterioară,

30–40 µm la mijloc

17–25 µm la partea inferioară.

Mătasea are rezistența la rupere cea mai mare dintre fibrele naturale, ajungând până la 46 daN/mm2; în stare de imersie aceasta scade cu circa 13%, iar prin degomare pierderea de rezistență este de 30%. Deformația la rupere variază de la 12 la 25%, iar în mediu umed crește până la 30%. Modulul de elasticitate variază între 700 și 864 daN/mm2.

Conductibilitatea electrică și termicăeste scăzută [5].

Higroscopicitatea mătăsii

Higroscopicitatea mătăsii este determinată de prezența, în general, a acelorași grupe funcționale ca la lână, dar fibrele având o cristalinitate mult mai mare (cuprinsă între 50 și 60%), higroscopicitatea va fi mai mică decât la lână. Rezistența mătăsii este de 11%.

Proprietățile chimice ale mătăsii sunt asemănătoare cu ale lânii, cu excepția celor legate de punțile cistinice. Față de agenții alcalini, mătasea, ca și celelalte proteine, prezintă o sensibilitate accentuată, dar este mai stabilă decât lâna; la concentrații mari ale acestora mătasea se dizolvă, ca de altfel și în soluții amoniacale ale oxidului de cupru sau nichel. Acidul peracetic degradează mai repede fibroina.

Ținând cont de faptul că mătasea are o pondere mai mare de catene laterale cu caracter acid decât lâna, punctul izoelectric va fi mai acid și anume 3,6. Având multe grupe funcționale, fibroina, ca și keratina, poate lua parte la numeroase reacții, printre care: acilare, alchilare, condensare și reticulare, grefare [5].

6. Nanoparticule de magnetită

Materiale magnetice din interiorul schelelor osoase sunt cunoscute ca fiind un factor de promovare a vindecării osoase mai ales atunci când tratamentul este însoțit de aplicarea stimulării magnetice externe. S-a sintetizat nanoparticule de oxid de fier în interiorul hidroxiapatită/schele osoase de chitosan. Hidroxiapatită și chitosanul sunt ambii compuși naturali și au fost preparate din os cortical bovin și coajă de creveți. Morfologia și compoziția materialelor sintetizate au fost caracterizate folosind microscopia electronică de baleiaj și spectroscopie FTIR. Mărimea medie a particulelor de oxid de fier în interiorul matricei schelă a fost estimată ca fiind în intervalul 10-40 nm, în funcție de mărimea particulelor analizor și microscopie electronică de transmisie.

Rezultatele au arătat magnetita ca fiind un material super paramagnetic. Cu toate că există anumite dezavantaje asociate de partea metalică și anume implanturi, inclusiv stresul de protecție în timpul post-vindecare, inflamația cronică provocată de coroziune, oboseală și slăbirea, acestea au fost încă utilizată pe scară largă pentru tratamentele osoase [6].

Poli(2-hidroxietil metacrilat) (PHEMA) și nanoparticule magnetice (Fe3O4) nanocompozit hibrid a fost sintetizat prin polimerizare în dispersie de dioxid de carbon supercritic folosind un stabilizator copolimeric, poli [(2-dimetilamino) etil metacrilat-co-1H, 1H-perfluorooctyl metacrilat] (PDMAEMA-co-PFOMA).

Agentul metacriloxipropiltrimetoxisilan (MPTMS), care asigură o legătură reactivă și, copolimerizează cu 2-hidroxietil metacrilat (HEMA). După imobilizarea agentului, lanțurile de polimer au fost grefate cu succes pe suprafața Fe3O4, având ca rezultat formarea de nanostructuri core-shell. Fotografie FE-TEM a arătat că nanoparticulele au fost bine dispersate în matrice polimerică. Încorporarea Fe3O4 în nanocompozit a fost confirmată prin spectroscopie FT-IR, XRD și XPS.

Această nouă cale de sinteză verde pot oferi avantaje ecologice, ușor de separat și de îndepărtat solventul [7].

Figura 4. Microfotografie: FE-TEM (a) nanocompozit cu Fe3O4, (b) MPTMS- cu Fe3O4 modificată, (c) cu 40% Fe3O4 și (d) reliefarea nanoparticulelor în compozit [7].

Membrane magnetice flexibile cu un procent mare de magnetită au fost preparate cu succes de către precedent de impregnare a peliculei de celuloză bacteriană care nu se usucă cu clorură ferică, urmată de reducere cu bisulfit de sodiu și tratament alcalin pentru precipitarea magnetitei. Membranele au fost caracterizate prin spectroscopia Raman, spectroscopie cu transformare Fourier în infraroșu (FTIR), difracție de raze X (XRD), vibratoare magnetometre, microscopie cu emisie în câmp electronic de scanare (SEM-FEG) și spectroscopie de impedanță.

Proprietățile de microunde ale acestor membrane au fost investigate în banda X (8.2-12.4 GHz). SEM-FEG arată o acoperire eficientă a nanofibrelor BC prin nanoparticule de Fe3O4. Membranele cu până la 75% în greutate din particule au fost preparate după 60 min de reacție. Nanoparticule de magnetită sub formă de agregate bine aderate la fibrele BC au fost observate prin SEM.

Dimensiunile medii cristaline ale particulele magnetice au fost în intervalul de la 10 ± 1 la 13 ± 1 nm (estimat prin XRD). Particulele magnetice în peliculele BC au prezentat un comportament superparamagnetic [8].

Nanoparticule de magnetită superparamagnetice au fost obținute pornind de la un amestec de fier (II) și fier (III), soluții într-o concentrație prestabilită de fier total de la 0,04 până la 0,8 mol-1 cu amoniac de 25% și 70°C. Regenerarea celulozei din vâscoză produce granule de celuloză micrometrice sferice în care magnetita sintetică a fost încorporată.

Caracterizarea perlelor de celuloză-magnetită s-a efecturat prin difracție raze X, scanare și transmisie electronică de baleiaj dar și prin măsurare magnetică.

Difractogramele indică faptul că, cu cât concentrația totală de fier și temperatura sunt

mai mari cu atât dimensiunea cristalului de magnetită este mai mare. Studii de transmisie electronică au arătat că perle de celuloză-magnetită au relevat distribuția nanoparticulelor de magnetită în interiorul sutelor de pori nanometrici. Magnetita precum compozitelor de celuloză-magnetită prezintă caracteristici super paramagnetice [9].

7. Aplicatii ale mătăsii naturale Bombyx mori

Timp de secole, fibroină de mătase Bombyx mori din viermi de mătase a fost folosită ca o fibră textilă. Dincolo de textile, fibroină de mătase a fost de asemenea folosită ca material de sutură chirurgicală de zeci de ani, și este în continuare dezvoltată pentru diverse aplicații biomedicale emergente. Procesabilitatea și versatil de facilă, fibroină de mătase în forme native și regenerate face atrăgătoare într-o serie de aplicații care necesită un material mecanic superioar, biocompatibil, biodegradabil și funcționalizat [10].

Mătasea are un mare potențial ca și polimeri comerciali durabili, ecologic. S-a discuta acest fascinant biomaterial prin combinarea perspectivelor în caracterizarea și înțelegerea structurii evoluate, proprietatea și funcția de proteină ​​din mătase naturală, cu sfera largă de discipline aplicate variând de la modelare moleculară la reologia și încercări mecanice.

S-a tras concluzia că mătasea nu poate fi definită, e pur și simplu doar prin originea sa sau compoziția materialului, dar orice denumire semnificativă trebuie să includă caracteristica esențială a formării de extrudare filară [11].

Cu speranța de a creea noi clase de biomateriale pe bază de mătase, mătase bombyx mori reconstruită în soluții apoase stabile, poate fi reasamblată în materiale funcționale. Reasamblare constă în electrogelare, folosind elecroliza cu mici câmpuri de electricitate.

Coconii de mătase care sunt reconstituiți într-o soluție de proteină de mătase apoasă similară mătăsii native, pot fi transformați în forme specific funcționale pentru utilizare în biomedicină cum ar fi: geluri, filme și bureți [12].

Pentru degomarea fibroinei de mătasea Bombyx mori s-au folosit metode de prelucrare care au fost analizate comparativ pentru a determina efecte diferite asupra proprietăților proteice de mătase, inclusiv structura cristalină și activitate. Mătasea a fost degomată în patru soluții de calciu-alcool și s-a efecturat masurători de structură și testul activității enzimatice pentru a distinge diferențele dintre regenerați de fibre și fibroina de mătase [13].

Electroforeza cu gel a arătat că Ca(NO3)2 – metanol, Ca(NO3)2 – etanol sau CaCl2 – metanol produce materiale cu greutăți moleculare mai scăzute de fibroină de mătase decât cu CaCl2 – etanol. Testul de activitate enzimatică a indicat că fibroina de mătase degomată în CaCl2 – etanol a avut o activitate mai mare atunci când este legată la un medicament chimioterapeutic, L-asparaginaza, decât fibroina supusă la alte tratamente.

Metoda de prelucrarea a mătăsii cu CaCl2 – etanol produce fibroină cu proprietăți de biomaterial, care sunt potrivite pentru sisteme de eliberare controalată a medicamentelor [13].

Figura 5. Microfotografii SEM pentrufibroina de mătase preparată cu diferiti solventi (A) fibroină degomată, (B) fibroină preparată din soluție Ca (NO3) 2x 4H2O-metanol, (C) fibroină preparată din soluție Ca (NO3)2x 4H2O-etanol,(D) fibroină preparată din soluție de CaCl2-metanol-H2O, (E) fibroină preparată din soluție CaCl2-etanol-H2O [13].

S-a studiat posibilitatea de a aplica fire de mătase naturală în structuri compozite din materiale țesute rezistente-proteză biovas de sânge cu proprietati anti-trombotice, și anti-inflamatorii bune. În timpul fazei inițiale de cercetare, experiența modernă mondială a aplicării mătasei naturală în practica chirurgicală a fost dedicată studiului în continuare a științei moderne și experiența practică de laboratore pre-clinice, o aplicație clinică a fibrelor de mătase narurale în diferite zone ale chirurgie cardiace, inclusiv proiectarea, producerea și implantarea de proteze vasculare ale diferitelor structuri fibroase și desene sau modele geometrice.

În procesul de implementare, partea practică, constă în trei tipuri diferite de urzeală și bătături de fire: poliester, poliuretan și mătase naturală. Fire de mătase naturală necesare în acest scop, sunt realizate din fibroină Bombyx mori. In laborator, autorii articolului au studiat proprietățile mecanice și de deformare ale firelor de mătase naturale necesare pentru fabricarea implanturilor inovatoare ale vaselor de sânge. Proprietățile firelor poliuretanice și poliester au fost examinate anterior, în studiile anterioare. Testele de laborator au confirmat și fabricarea protezei vas de sânge [14].

S-au comparat efectele diferitelor tehnici de sterilizare pe proprietățile mătăsii Bombyx mori, cu vederea utilizăii pentru inigineria țesuturilor corneei. Transparența, proprietățile de tracțiune, atașarea celulelor epiteliale ale corneei și degradarea filmelor au fost utilizate pentru a evalua caracterul adecvat al anumitor tehnici de sterilizare, inclusiv iradierea gama (în aer și azot), tratament cu aburi și imersia în soluție apoasă de etanol [15].

Studii recente asupra fibroinei au demostrat că acesta este una dintre cele mai promițătoare substanțe pentru biotehnologii și materiale biomedicale datorită proprităților unice precum: biocompatibilitate, permeabilitate bună a oxigenului și a vaporilor de apă, biodegradabilitate, reacții inflamatorii minime, rezistență microbiană sau compatibilitate cu sângele.

Fibroina poate fi legată de colagenul recombinant uman, pentru a prepara un nou tip de film biocompatibil, utilizat în aplicații ale țesutului hepatic. Ea mai poate fi folosită pentru vindecarea rănilor, ca fotosenzor pentru analiza peroxidului de hidrogen sau fabricarea pielii artificiale. Fibroina sub formă de gel (hidrogeluri de mătase) au arătat că stabilitatea depinde de concentrația fibroinei, de temperature și pH.

Din coconii bruți, sericină trebuie să fie eliminată. Sericina este un grup de glicoproteine solubile în glanda mătăsii. Odată ce proteina a fost îndepărtată, fibrele fibroinei pot fi procesate în materiale diferite [16]. (figura 6)

Figura 6. Formele materialelor fabricate din fibroină folosind atât solvent organic cât și medii apoase [16].

Gelurile cu fibroină 3D, cu adaos de colagen s-au preparat prin procedeul de liofilizare. Structura compozitelor a fost studiată prin tehnica ATR-FTIR și a fost observată de un microscop electronic de baleiaj. Proprietățile mecanice au fost studiate și comparate cu cele ale unui burete 3D de fibroină de mătase. Mai mult, studiile de miscibilitate ale fibroinei de mătase cu amestecuri de colagen de compoziții diferite au fost investigate utilizând metoda vâscozimetrică înainte de procesul de liofilizare. Studiile vâscozimetrice indică faptul că amestecurile de fibroină-colagen sunt miscibile în orice compoziție, la 25° C. Scanarea de electroni observații, a arătat că, în procesul de liofilizare (fibroină – colagen) poate fi obținut un amestec de material poros. Rezultatele au arătat că adăugarea de colagen la fibroina de mătase a dus la scăderea rezistenței la tracțiune. Cu toate acestea, modulul de elasticitate a crescut cu o cantitate tot mai mare de colagen [17].

Filme cu sericină au atras multă atenție din partea cercetătorilor din domeniile biomedicale și cosmetice, din cauza proprietăților sale unice, inclusiv bicompatibilitea bună și promovarea vindecării rănilor. Cu toate acestea, proprietățile mecanice slabe ale filmelor de sericină au limitat aplicarea sa în aceste domenii. S-a folosit acidul formic pentru a fabrica soluții de sericină și filme. Efectele acidului formic asupra caracteristicilor structurale și a proprietățiile mecanice ale soluțiilor și filmelor de sericină au fost analizate și comparate cu apa.

Soluția sericină/acid formic a arătat mai puține molecule de sericină agregate, rezultând într-o turbiditate mai mică decât cea a soluției sericină/apă. În plus, gelificarea soluției de sericină a fost întârziată în acid formic, comparativ cu cea a apei.

Filme cu sericină turnate din soluția de acid formic au prezentat un indice de cristalinitate mult mai mare decât cea produsă din apă. Rezistența la tracțiune și alungire a filmelor cu sericină turnate din soluția de acid formic au fost mai mult decât dublă față de cea a filmelor cu sericină turnate din apă [18].

Mătasea a fost folosită ca un biomaterial într-o varietate de aplicații biologice de mai mulți ani, în timp ce există mai puține aplicații în stomatologie. S-a realizat un studiu pentru a explora proprietățile potențiale ale mătăsii naturale pentru dentare, prin determinarea structurii și a caracteristicilor care fac din mătase un candidat biocompatibil. Rezultatele au arătat ca mătasea are proprietăți excelente naturale cum ar fi rezistență la temperatură, la lumină, la umiditate și biocompatibilitate [19].

Geluri pe bază de celuloză bacteriană și fibroina au fost aplicate ca mască pentru tratament facial. Acest gel produs la un pH de avut o structură de rețea de fibroină pură. Proprietățile mecanice, absorbția umidității și capacitatea gelului s-au îmbunătățit, în comparație cu cele ale măștilor de celuloză din comerț. S-au făcut teste de exfoliere pe piele de porc, care au arătat că gelul a avut o adeziune mai mică decât masca cu geluloză disponibilă în comerț, care s-ar fi îndepărtat de pe față mai ușor, fără durere.

Testul de citoxicitate a arătat că gelul nu prezintă toxicitate pentru L929 fibroblaste de șoarece și celule kerotinocite umane HaCaT. Mai mult atunci când este implantat subcutanat și evaluat în conformitate cu standardul ISO 10993-6, gelul nu a fost iritant pentru țesut. Gelul a avut proprietăți fizice și bilogice adecvate pentru aplicarea în siguranță a tratamentului facial [20].

Figura 7. Microfotografii SEM pegel celuloză bacteriană-fibroinăși gel cu celuloză din comerț SEM ( scale bar = 50 m) [20].

S-au folosit și nanoparticule Fe3O4 (Fe3O4NPs) / nanoparticule de Ag (AgNPs), fibre dublu acoperite cu mătase, care au fost preparate printr-o simplă tehnologie electrostatică de auto-asamblare. Fibrele de mătase au fost scufundate secvențial în soluții de AgNPs încărcate pozitiv și Fe3O4NPs încărcate negativ. Fibrele de mătase structurate au fost caracterizate prin XRD, FESEM și VSM, XRD și SEM, caracterizările demonstratând că fibrele de mătase au fost acoperite uniform prin AgNPs și Fe3O4NPs. Analiza VSM a indicat că fibrele compozite ternare ca preparat au prezentat proprietăți magnetice excelente [21].

Noi aplicații pentru biotextilele medicale au fost identificate cu dezvoltarea tehnologiilor de fabricație nanotehnologice. Combinație de nanotehnologie și tehnologia biotextilă a rezultat într-un domeniu nou numit bionanotextile. Bionanotextilele sunt folosite în multe domenii care includ pansamente, bandaje și schele de țesuturi. Fibroină mătase (SF) din coconul de Bombyx mori, este una dintre cele mai favorabile materiale pentru pansament datorită proprietăților sale unice, inclusiv biocompatibilitate, permeabilitate, biodegradabilitate, flexibilitate morfologică și proprietăți mecanice corespunzătoare. Modificarea proprietăților antimicrobiene ale SF poate oferi o barieră pentru penetrarea bacteriană. Polietilenimină antibacteriană (PEI) (10, 20 și 30% (g/g)) a ​​fost amestecat cu SF, iar bionanotextilele au fost fabricate cu succes prin electrospinning. În plus, nanofibre de fibroină au fost funcționalizate cu gruparea sulfat, pentru a testa dacă acestea prezintă o activitate antibacteriană sau nu [22].

Bionanotextilele bazate pe fibroină au fost caracterizate prin microscopul electronic (SEM), cu transformare Fourier spectroscopie în infraroșu (ATR-FTIR), calorimetrie cu scanare diferențială (DSC) și analiza termogravimetrică (TGA). Evaluările de citotoxicitate au fost realizate de L929 fibroblaste cu testul MTT. Rezultatele citotoxicitate indirecte demonstrează că nu au nici o citotoxicitate pe linia celulară L929 de cancer. PEI și bionanotextile cu fibroină au prezentat activități antibacteriene puternice împotriva gramului Staphylococcus aureus pozitiv și gram negativ Pseudomonas aeruginosa [23].

Biomaterialele degradabile sunt candidați preferați pentru dezvoltarea de dispozitive terapeutice, cum ar fi schele poroase tridimensionale pentru ingineria tisulară și ca’’vehicule de livrare’’a medicamentului cu eliberare controlată.

Fibroină a atras atenția pentru biocompatibilitate la om. Rata de degradare a schelelor de inginerie de țesuturi și purtători de medicamente ar trebui să reflecte rata de formare a țesutului nou sau să fie adecvată pentru eliberarea controlată a moleculelor bioactive. Pe parcursul ultimului deceniu, comportamentul de biodegradare a fibroinei de mătase a fost pe larg investigat in vitro și in vivo [24].

S-au preparat hidrogeluri prin polimerizarea acrilamidei și N, N'-metilenbisacrilamidă în soluție de fibroină de mătase, cu o pereche redox ca inițiator. Încorporarea fibroinului în matrice poliacrilamidă a fost dovedită prin spectroscopie FTIR-ATR. Măsurători la gonlflare în soluție salină au fost efectuate pentru a evalua comportamentul acestor hidrogelurilor având diferite compoziții. Testul de citotoxicitate prin metoda de extract a arătat că aceste hidrogeluri cu diferite conținuturi în fibroină de mătase nu s-au dezvoltat efecte citotoxice asupra culturilor de fibroblaste umane, ducând creșterea posibilității utilizării lor în aplicații biomedicale. Teste de compresie mecanică a relevat punctele forte bune pentru hidrogelurilor fibroină/poliacrilamidă. În acest fel, hibrizi organici-anorganici analoage structurii osoase pot fi produse în condiții biomimetice și pot fi utilizate în continuare în aplicații biomedicale [25].

8. Concluzii

Din categoria biomaterialelor folosite pentru realizarea implanturilor și a dispozitivelor medicale fac parte următoarele materiale: polimerii, metalele, ceramicele și compozitele.

Un biomaterial poate să aibă toate caracteristicile mecanice, fizice și chimice cerute de o aplicație medicală, dar la contactul cu mediile biologice, inclusiv cu organismul uman, el găsește condiții fiziologice particulare cu care interaționează prin procese specifice, precum difuzia de ioni și fluide, drenaj limfatic, circulația sângelui, dar și prin mecanisme fiziologice (locale și sistematice) mai puțin previzibile.

Dincolo de textile, fibroină de mătase a fost de asemenea folosit ca material de sutură chirurgicală de zeci de ani, și este în continuare dezvoltată pentru diverse aplicații biomedicale emergente. Procesabilitatea și versatil de facilă fibroină de mătase în forme native și regenerate face atrăgătoare într-o serie de aplicații care necesită un material mecanic superioar, biocompatibil, biodegradabil, și funcționalizat. Coconii de mătase care sunt reconstituiți într-o soluție de proteină de mătase apoasă similară mătăsii native, pot fi transformați în forme specific funcționale pentru utilizare în biomedicină cum ar fi: geluri, filme și bureți.

Studii recente asupra fibroinei au demostrat că acesta este una dintre cele mai promițătoare substanțe pentru biotehnologii și materiale biomedicale datorită proprităților unice precum: biocompatibilitate, permeabilitate bună a oxigenului și a vaporilor de apă, biodegradabilitate, reacții inflamatorii minime, rezistență microbiană sau compatibilitate cu sângele.

Filme cu sericină au atras atenția cercetătorilor din domeniile biomedicale și cosmetice, din cauza proprietăților sale unice, inclusiv bicompatibilitea bună și promovarea vindecării rănilor.

S-a realizat un studiu pentru a explora proprietățile potențiale ale mătăsii naturale pentru dentare, prin determinarea structurii și a caracteristicilor, arătând că mătasea are proprietăți excelente naturale cum ar fi rezistență la temperatură, la lumină, la umiditate și biocompatibilitate.

Partea de cercetare

1. Introducere

Mătasea naturală este produsă sub forma unui filament de către larva viermelui de mătase. Cea mai mare cantitate de mătase este produsă de specia Bombyx mori, o insectă care se hrănește cu frunze de dud.

Firul de mătase se obține dintr-un lichid vâscos, produs în corpul larvei. Fibra așa cum este produsă, se descompune din două filamente de proteine, și anume fibroina și sericina. Firul produs de vierme este de culoare albă, galbenă sau gri, datorită pigmenților care se găsesc majoritatea în sericină.

Hidrogelurile sunt rețele polimerice 3D ce utilizează polimeri stabili din punct de vedere fizic și chimic sunt capabili de a absorbi o cantitate mare de apă fără a-și modifica structura. Abilitatea lor de a imita țesutul uman cât și capacitatea de a răspunde la stimulii externi le-au făcut foarte importante asigurându-le aplicații în domeniul ingineriei țesuturilor, eliberarea controlată a dispozitivelor, biosenzori, activatori mecanici ,etc.

Studiile anterioare referitoare la fibroină sub forma de gel au arăta că formarea și stabilitatea acestora depinde de concentrația fibroinei, temperatură și pH [5].

Sinteza nanoparticulelor magnetice compozite organice-anorganice ocupă un loc aparte în cercetarea științică din ultimii ani. Utilizarea nanoparticulelor magnetice într-o gamă foarte mare de aplicații precum: transportul medicamentelor, ferofluide, medii magnetice de înregistrare și stocare a datelor, rezonanța magnetică imagistică cu agenți de contrast și în tratamentul cancerului prin hipertemie, este condiționată de stabilizare, asigurarea biocompatibilității și a posibilității de grefare [25].

2. Materiale și metode

2.1 Materiale

Coconi de mătase au fost furnizați de S.C. SERICAROM S.A. București. Este singura fibră naturală sub formă filamentară. Filamentul continuu obținut după degomarea gogoșilor de mătase produse de larvele fluturilor Bombyx mori conține fibroină de culoare albă (75 %) și sericină (25 %) a cărei culoare depinde de specia viermilor.

Figura 1. Coconi de mătase din laborator

Acrilamida (AA) este un momomer solid de culoare albă, cu o masă moleculară 71,08 g/mol, densitatea 1,13 g/cm3, având o solublilitate bună în apă și un punct de topire de 84,5° C.

Agentul de reticulare, N,N’-metilenbisacrilamidă (MBA) este o pulbere albă, cu o masă moleculară de 154,17 g/mol.

Sistemul de inițiere este format din persulfat de potasiu (K2S2O5) și trietanolamină (TEA), un lichid vâscos limpede, solubil în apă cu o masă moleculară 149,19 g/mol și o densitate de 1,124 g/cm3.

Magnetita este un mineral din grupa oxizilor de fier cu proprietăți feromagnetice, fiind oxidul de fier cel mai rezistent față de acizi și baze, cristalizează în sistemul cubic, cu formula chimică Fe3O4. Este o pulbere neagră cu o densitate de 5.2 g/cm3 și un punct de topire de 1535° C.

Alte substanțe folosite în studiul experimental: apă distilată, etanol, acetonă.

2.2 Metode

2.2.1 Obținerea fibroinei din coconi de mătase

În această etapă coconi de mătase sunt degomați (spălați) pentru a îndepărta sericina, aceasta fiind solubilă în apă. Mătasea a fost spălată cu apă, bicarbonat de sodiu, carbonat de sodiu si un agent tensioactiv (dodecilsulfat de sodiu). După degomare, fibroina este uscată în etuvă la , apoi depozitată în loc întunecat până la utilizare [16].

2.2.2 Obținerea soluției de fibroină

Fibrele uscate de fibroină sunt dizolvate într-o soluție de LiBr la 55- pentru 8 h, rezultând o soluție de concentratie 3%. Apoi soluția obținută este dializată pentru a se îndepărta ionii utilizând saci de dializă din celuloză (MWCO 12400 g/mol) timp de 3 zile (apa schimbându-se frecvent). Solutia astfel obținută este stocată în frigider până la utilizare.

Figura 2. Obținerea soluției de fibroină

Figura 3. Săculeț de celuloză folosit în dializa soluției de fibroina

2.2.3 Sinteza hidrogelurilor pe bază de fibroină, poliacrilamidă și nanoparticule magnetice

Hidrogelurile pe bază de fibroină și poliacriamidă, cât și fibroina/poliacrilamida și nanoparticule magnetice au fost obținute prin polimerizare cu mecanism radicalic. Inițial s-a pregatit o soluție de AA concentratie 15% masic în care s-a adăugat N,N’-MBA concentrație masică 3%, apoi această soluție a fost amestecată cu soluția de fibroină în diferite proporții. Amestecul obținut se trece într-un un vas și se adaugă sistemul de inițiere compus din KPS și TEA (TEA/AA=1/100 și KPS/TEA=1/2). Pentru a avea un control mai bun asupra parametrilor de reacție (pentru a preveni aparitia bulelor de aer în hidrogel) substanțele au fost degazate inainte de utilizare, iar reacția de polimerizare a avut loc în atmosfera de azot. Reactia de polimerizare a avut loc la și a durat 4 zile.

Hidrogelurile au fost purificate prin extracții repetate cu apă distilată timp de 5 zile. În cazul hidrogelurilor cu nanoparticule magnetice, acestea au fost dispersate în apă prin sonicare timp de 60-90 minute. Modul de lucru este apoi similar cu cel prezentat mai sus.Rapoartele de soluție de fibroină și acrilamidă au fost 0/50, 10/90, 20/80, 30/70, 40/60, 50/50. Nanoparticulele de magnetită au fost adaugate în concentrație aproximativ 1% față de volumul solutiei.

Metotologia de lucru a unui gel fără magnetită

Hidrogel pe bază de fibroină/ poliacriamidă 40/60

Volumul soluției= 10 mL

Volumul soluției de fibroină (SF) = 4 mL

Volumul soluției de acrilamidă (AA) = 6 mL

CAA=15% față de apă ↔ mAA= 15/100 x 6 =

CMBA(metilenbisacrilamidă)= 6,25% față de mAA ↔ mMBA= 6,25/100 x 0,9=

Inițiatorul ( Trietanolamina (TEA) + persulfat de potasiu (KP) )

CTEA= 1% față de mAA ↔ mTEA= 1/100 x 0,9 =

CKP= ½ față de TEA ↔ ƒTEA=1,12 g/L ↔VTEA= 0,009/1,12= 0,008 mL

mKP=1/2 x mTEA= 0,009/2=

AA () se dizolvă în 6 mL apă, apoi se adaugă MBA ();

Peste AA+MBA se adaugă 0,0045g de KP;

Amestecul format din SF+AA+MBA+KP se ultrasonează până la omogenizare;

TEA () se adaugă în final și se lasă la polimerizat 2-3 h la temeperatura camerei. Apoi temperatura se ajustează la pentru încă 4 zile.

Gelurile obținute se purifică prin extracție repetate cu apă distilată, apoi se usuca în aer, respectiv etuva la timp de 24 h. Au fost obtinute si hidrogeluri poroase prin iofilizare la și 0,4 mbar.

Figura 4. Hidrogeluri fibroină/PAA (stânga) și fibroină/PAA/magnetită (dreapta)

2.2.4 Evaluarea comportamentului la gonflare a hidrogelurilor obținute

Gonflarea reprezintă capacitatea unui hidrogel de a reține apă, până ajunge la o masă constantă. Strucutra polimerică tridimensională care prezintă o capacitate de a reține cantități mai mari de apă sau alte lichide fără a-și pierde caracterul 3D (fără a se dezintegra).

Gradul de gonflare (GG)= x 100

Figura 5. Gonflarea hidrogelurilor în solutie salină (0,9% NaCl)

hidrogelul se usucă 24 h;

se iau 3 probe după care se cântărește (masa inițială);

se adaugă într-un pahar cu soluție salină, iar la un timp t se scoate proba de hidrogel, se îndepărteză surplusul de soluție și se cântărește (masa la timpul t);

se reprezintă grafic gradul de gonflare în funcție de timp.

2.2.5 Caracterizarea morfologică a hidrogelurilor obținute

Microscopie electronică de baleiaj (SEM)

Funcționarea SEM constă în aplicarea unei tensiuni între o probă și conductoarele de filament, rezultând electroni emisie din filament către probă. Acest lucru are loc într- un mediu vidat variând de la 10-4 la 10-10 Torr. Electronii sunt ghidați la probă printr- o serie de lentile electromagnetice în coloană de electroni.

Rezoluția și profunzimea imaginii de câmp sunt determinate de curentul fasciculului luminos și dimensiunea finală a spotului, care sunt ajustate cu una sau mai multe lentile  și obiectivul final. Lentilele sunt de asemenea folosite pentru forma fasciculului, pentru a minimiza efectele de aberație sferică, aberație cromatică, difracție și astigmatismul.

Electronii interacționează cu probă de la nanometri la câțiva microni de suprafață, în funcție de parametrii  fascicului și tipul de probă. Electronii sunt emiși de probă în principal ca electroni secundari, fiind cel mai frecvent semnal utilizat pentru investigarea morfologică a suprafeței [26].

Analiza a fost efectuată cu un echipament SEM QUANTA INSPECT F cu tun de emisie (FEG) cu rezolutia de 1,2 nm și cu EDS.

Microscopia de forță atomică (AFM)

Microscopia de forță atomică este o tehnică modernă de analiză morfo-structurală a suprafețelor. Această tehnică oferă un profil 3D al suprafețelor la scară nanometrică prin măsurarea forțelor dintre un vârf ascuțit (<10 nm) și suprafața probei la distanțe foarte mici (0.2-10 nm) [26].

Vârful este plasat la capătul cantileverului sub forma unui arc. Forțele dintre sondă și probă sunt dependente de rigiditatea cantileverului și de distanța dintre sondă și suprafață. AFM este esențial pentru măsurarea rugozității la scară nanometrică. Măsurarea rugozității oricărui tip de suprafață depinde de rezoluția spațială și verticală a aparatului deoarece suprafața reala prezintă rugozități nano și micrometrice.

Chiar și o suprafață de dimensiuni atomice are o rugozitate cuntificabilă cu ajutorul unui instrument cu rezoluție subangstron. AFM poate fi utilizată în deferite medii precum vacuum, aer și lichide.

Folosirea lui în cerceterea biologică (celule, membrane, proteine, viruși, bacterii etc.) permite examinarea morfologiei și proprietăților mecanice ale probelor biologice în mediul lor natural, deoarece mediul lichid permite probelor să rămână vii în timpul scanării. Un alt avantaj al realizării scanării în mediu este eliminarea forțelor capilare, reducerea forțelor Van Der Waals de 10 ori și reducerea contaminării probei.

Analiza a fost realizată în modul non-contact cu un aparat Agilent 5500 (Agilrom) echipat cu un controler AC Mode III la temperatura camerei, folosindu-se un cantilever cu o frecvență de rezonanță de 190 kHz și un vârf cu diametrul de 10 nm.

2.2.6 Evaluarea capacității de biomineralizare a hidrogelurilor obținute

Evaluarea comportamentului la biomineralizare în SBF (simulated body fluid)

Capacitatea unui material de a forma țesut osos nou atunci cand este implantat într-un organism viu se poate evalua prin examinarea abilității de a forma hidroxiapatita pe suprafața sa în fluide, mimează plasma umana (SBF- simulated body fluid).

Utilizarea fluidelor sintetice ce mimează plasma umană pentru a reproduce formarea apatitei in vivo a fost introdusă în anul 1990 de catre Kokubo și colaboratorii săi[27-28]. Fluidele ce simulează plasma umană sunt soluții ce mimează doar compoziția anorganică a plasmei umane, ce sunt caracterizate de valori foarte apropiate ale concentrațiilor de ioni de cele din plasma sangvină a cormului uman.

Tabel. 1. Rețeta SBF 1x

Deoarece SBF este supersaturată în ceea ce privește apatita, o metoda de preparare inadecvată poate conduce la precipitarea apatitei în soluție. Întotdeauna trebuie sa ne asigurăm că nu există nici un depozit mineral pe suprafața sticlei, iar soluția preparată este incoloră și transparentă. Dacă apar precipitări, se oprește prepararea SBF, se spală sticlăria și aparatura și se începe o noua preparare.

Examinarea formarii de hidroxiapatită pe suprafața unui material ce a fost imersat în SBF este utilă pentru estimarea potențialei osteoconductivități și/sau osteoinductivități a acestuia și recomandarea pentru testele in vivo.

Evaluarea comportamentului la biomineralizare prin metoda ciclurilor alternante

Tetsushi Taguchi [29] și colaboratorii săi au arătat că se pot forma in vitro în/pe o matrice polimerică de tip hidrogel structuri de tipul os-apatită la temperaturi și presiuni normale folosindu-se metoda ciclurilor alternante.

Metoda ciclurilor alternante este un proces care implică imersarea alternantă a probelor în două soluții, respectiv prima solutie este o soluție apoasă de CaCl2/ tris(hidroximetil)aminometan (Tris) și HCl concentrat (pH=7,4), iar cea de-a doua soluție este o soluție apoasă de Na2HPO4 și este utilizată pentru a obține compozite hidrogel-apatită. Probele de hidrogel cu și fără nanoparticule magnetice au fost imersate pe rând în cele două soluții timp de 2-4 zile. La final, probele au fost spălate cu apă distilată, uscate și supuse investigațiilor prin analiza SEM.

2.2.7 Caracterizare biologică a hidrogelurilor pe bază de fibroină/poliacrilamidă și fibroină/poliacrilamidă/nanoparticule magnetice (teste de biocompatibilitate pe linii celulare specifice)

Aceste teste au fost efectuate de Biologie, Universitatea din București prin amabilitatea dnei As.dr. Bianca Gălățeanu.

Cultura de celule

Fibroblastele umane dermale (linia CCD-1070Sk, American Type Culture Collection, USA) au fost cultivate în MEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin (SFB), și incubate într-o atmosferă umedă de 5% CO2-95% aer, la 37ºC. Mediul a fost schimbat la fiecare trei zile. Pentru studiile propuse, celulele au fost desprinse prin tratament cu tripsina-EDTA de flaskul de cultura și însămânțatela o densitate de 1.2 x 104 celule/cm2 în plăci cu 12 godeuri.

Studii de citotoxicitate

Suporturile au fost sterilizate căte 12h pe fiecare parte și apoi spălate în mediu de cultură timp de 24h la 4ºC. Pentru a evalua citotoxicitatea eventualilor compuși ce pot fi eliberați, probele au fost imersate în mediu de cultură și incubate în condiții standard de cultivare (atmosferă umeda de 5% CO2-95% aer, la 37ºC). După 24h, mediul continând extractele a fost prelevat și adăugat nediluat peste celulele însămanțate la o densitate de 1.2 x 104 celule/cm2 în placi cu 12 godeuri. Controlul este constituit dintr-o cultură de celule în mediu ce nu a intrat în contact cu probele.

Eventualele efecte citotoxice analizate asupra celulelor CCD-1070Skau fost evidențiate prin folosirea a două studii colorimetrice: un studiu de evaluare a viabilității și proliferarii celulare bazat pe determinarea activitatii dehidrogenazelor mitocondriale (testul MTT) și un studiulde citotoxicitate ce are la bază determinarea activității lactat dehidrogenazei (testul LDH) eliberate în mediul de cultură de către celulele ce prezintă leziuni la nivelul membranei celulare. Ambele studii s-au realizat la 72h de la însămanțare.

Tratarea celulelor cu [bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu] MTT permite evaluarea metabolismului oxidativ [Richard și colab. 1992]și a răspunsului unei populații celulare la factori externi ce pot avea un efect pozitiv sau negativ asupra viabilității celulelor în cultură. Din acest motiv testul MTT este folosit ca test pentru studii de viabilitate, citotoxicitate și proliferare celulară [Edmondson si colab.,1988]. La baza aceastei metode colorimetrice cantitative este reducerea unei sări de tetrazoliu galbene MTT la un formazan de culoare albastru-inchis. (Fig.6)

Figura 6. Reducerea sării de tetrazoliu galbene MTT [bromura de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu] la un formazan de culoare albastru-inchis.

Reducerea realizată de enzime mitocondriale (în special succinat dehidrogenaza) este un indice al integrității celulare/mitocondriale. Formazanul insolubil în apă poate fi solubilizat cu izopropanol, dimetil sulfoxid sau alt solvent organic. Densitatea optică a formazanului solubilizat este evaluată spectrofotometric la 550 nm, obțnându-se o funcție absorbantă colorant-număr de celule active metabolic din cultură. Metoda este adaptabilă determinarii unui număr mare de probe utilizând microplaci cu 96 de godeuri și un spectrofotometru TECAN.

Testul LDH constă în determinarea spectrofotometrică a activității exprimate de enzima eliberată în mediul de cultură de către celulele distruse. Metoda se bazează pe reducerea NAD+, H+ de către LDH. NADH+, H+ convertește o sare de tetrazoliu la un derivat colorat, solubil – formazan (Fig7.)

Figura 7. Cuplarea reducerii NAD+ sub acțiunea LDH cu conversia unei sări de tetrazoliu (galben) la un formazan (roșu).

Intensitatea culorii formazanului (roșu), este evaluată spectrofotometric la o lungime de unda de 490 nm. O diminuare a viabilității celulare este asociată cu liza membranei plasmatice, eliberarea LDH în mediul de cultură și cresterea activității sale.

Pentru acest studiu s-a utilizat kitul SIGMA (TOX-7) «In vitro toxicology assay kit lactate dehydrogenase based» care permite evaluarea efectelor citotoxice prin afectarea integrității membranei plasmatice, ce conduce la eliberarea LDH (enzima cu localizare citoplasmatică) in mediul de cultură. Valorile DO490 sunt expresia activității LDH eliberate în mediu. Astfel, cu cat aceste valori sunt mai mari, cu atat citotoxicitatea este mai mare și procentul de celule viabile raportat la control este mai mic.

Pentru dozarea LDH s-au folosit 100 µl din mediul de cultura al fibroblastelor cultivate timp de 72h, care s-au amestecat cu 200 µl soluție mixtă furnizată de kit. Amestecul a fost incubat 30 minute la temperatura camerei, la întuneric. Reacția enzimatică a fost stopată cu 30 µl HCl 1N. Absorbanța a fost măsurată la 490 nm cu ajutorul unui cititor de plăci TECAN.

3. Rezultate și discuții

3.1 Evaluarea comportamentului la gonflare a hidrogelurilor pe bază de fibroină și poliacrilamidă cu diverse compoziții

După cum a fost menționat în partea experimentală, studiul de gonflare a fost realizat pe hidrogelurile de fibroină și poliacrilamidă prin imersarea probelor în soluție salină la temperatura de 37 °C. Echilibrul a fost atins în 24 h (masă constantă a probelor analizate), iar gradele de gonflare pentru toate compozițiile studiate au fost calculate după formula prezentată anterior in partea experimentală.

Rezultatele obținute au fost exprimate grafic ca variație a gradului de gonflare în funcție de timp (figura 8) .

Figura 8. Grad de gonflare în funcție de timp pentru hidrogelurile pe bază de fibroină și poliacrilamidă cu diferite compoziții, 37 ºC, apă distilată.

Din reprezentarea graficăse observă că gradul de gonflarecrește cu cantitatea de fibroină din hidrogel, deoarece fibroina este o proteină hidrofilă, absorbind mai multă cantitate de apă. La concentrații mai mici de fibroină predomină rețeaua reticulată de poliacrilamidă care nu permite apei să pătrundă printre lanțurile polimerice atât de ușor, rezultând o scădere a gradului de gonflare.

3.2 Evaluarea comportamentului la gonflare a hidrogelurilor pe bază de fibroină, poliacrilamidă și nanoparticule de magnetită cu diverse compoziții

Rezultatele obținute au fost exprimate grafic ca variație a gradului de gonflare în funcție de timp (figura 9, similar ca în cazul precedent) .

Gonflarea hidrogelurilor cu magnetită este similară cu cea a celor fără magnetită: gradul de gonflare crește cu creșterea concentrației de fibroină în hidrogel, datorită scăderii densității de reticulare a poliacrilamidei cu metilenbisacrilamidă.

3.3 Caracterizarea morfo-structurală a hidrogelurilor prin analiza AFM

Hidrogelurile pe bază de fibroină, poliacrilamidă și magnetită au fost caracterizate din punct de vedere morfo-structural prin microscopie de forță atomică. Imaginile în modul contact au fost obținute folosind un microscop de forță atomică multimodal Agilent 5500 echipat cu un controller AC Mode III. Analizele au fost realizate în condiții ambientale folosindu-se un scanner piezoelectric calibrat cu o capacitate de scanare de 90 pe 90 µm pe direcția x si y si 7 µm pe direcția z. Imaginile cu topografia suprafeței au fost obținute cu ajutorul unui cantilever triunghiular de nitrură de siliciu cu o lungime de 100 µm, o grosime de 7 µm, o constantă de flexibilitate de 0.08 N/m și un diametru al vârfului de aproximativ 10 nm. Pentru modul de scanare în contact a fost ales modul de Forță Constantă, unde deviația cantileverului este folosită ca semnal de intrare pentru circuitul de feed-back care dă mișcările scannerului pedirectia z în corespondență cu topografia suprafeței. În acest mod de scanare vârful estea dus în contact cu proba și apoi baleiat linie cu linie pe suprafața de analizat dorită. Tipul de scanare necesita un cantilever cu o constanta de flexibilitate foarte mică deoarece în timpul scanării acesta se îndoaie la contactul cu suprafața. La distanțe foarte mici între vârf și probă apar puternice forțe de repulsie Van der Waals care duc la îndoirea cantileverului.

Modul contact a fost ales deoarece poate asigura o înalta rezoluție a imaginilor obținute și o viteză mare de scanare în același timp.Modul de scanare este puternic influențat de forțele de adeziune și de forțele de frecarealaterală ale catileverului, fiind potrivit pentru suprafețe rugoase.

In figura 10 sunt prezentate imagini 2D de deviație a cantileverului și imagini topografice 3D atat pentru hidrogelul cu compoziția SF-PAA 10%-90% cât pentru hidrogelul cu compoziția SF-PAA 50%-50% (ambele cu magnetită). Analizele morfologice au fost realizate pe probe de hidrogel uscate, după ce acestea au fost uscate în prealabil timp de 24 h la temperatura camerei și încă 48 h la 60 °C. Imaginile pun în evidență structura morfologică a suprafețelor probelor analizate precum și diferențele morfologice care apar în urma modificării compoziției chimice. Pentru hidrogelul cu compoziția SF-PAA 10%-90% imaginile 2D și 3D prezintă o structură morfologică a suprafeței relativ netedă și cu o rugozitate medie scăzută. Modificarea compoziției chimice prin creșterea cantității de fibroină și scăderea cantității de poliacrilamidă până la un raport de 50-50% a dus la o modificare semnificativă a morfologiei și topografiei suprafeței. Astfel, pentru hidrogelul cu compoziția chimică SF-PAA 50%-50% are loc o creștere semnificativă a rugozității medii, precum și a modului de aranjare și structurare a trăsăturilor suprafeței.

Topografia suprafeței nu mai prezintă o textură cu un aspect neted, având neregularități structurale ca variații în înălțime a suprafeței. În urma analizei morfologice prin microscopie de forțăatomică nu a fost pusă în evidență prezența magnetitei pe suprafața probelor sau o eventuală influență a acesteia asupra schimbărilor morfologice.

Figura 10. Imagini de deviație pentru hidrogelul SF-PAA 10%-90% (a), SF-PAA 50%-50% (b). Imagini de topografie 3D pentru SF-PAA 10%-90% (c), SF-PAA 50%-50% (d). Concentrație magnetită 1%

3.4 Caracterizarea morfo-structurala a hidrogelurilor obtinute prin analiza SEM

Hidrogelurile cu fibroină si magnetită au fost caracterizate din punct de vedere al morfologiei și prin analiză SEM. În acest fel a putut fi pusă în evidentă prezența nanoparticulelor de magnetită în structura hidrogelurilor sintetizate.

Rezultatele caracterizării prin analiză SEM sunt prezentate în figurile 11-13.

Figura 11. Microfotografii SEM pentru hidrogelurile pe bază de fibroină, poliacrilamidă

(10/90) și magnetită 1% (mărire 200 stânga, mărire 10000 dreapta cu evidențierea nanoparticulelor de magnetită)

Figura 12. Microfotografii SEM pentru hidrogelurile pe bază de fibroină, poliacrilamidă

(30/70) și magnetită 1% (mărire 200 stânga, mărire 10000 dreapta cu evidențierea nanoparticulelor de magnetită)

Figura 13. Microfotografii SEM pentru hidrogelurile pe bază de fibroină, poliacrilamidă

(50/50) și magnetită 1% (mărire 200 stânga, mărire 10000 dreapta cu evidențierea nanoparticulelor de magnetită)

Analiza SEM relevă structura poroasă a hidrogelurilor sintetizate cu dimensiuni cuprinse între 100-250 microni, lucru extrem de important în capacitatea acestora de a permite adeziunea celulelor osteoblaste în porii formați. De asemenea, se observă distribuția uniformă a nanoparticulelor de magnetită atât pe suprafață, dar și în interiorul/peretele porilor.

3.5 Evaluarea capacității de biomineralizare a hidrogelurilor obținute

Evaluarea comportamentului la biomineralizare în SBF 1x (simulated body fluid)

Testele de biomineralizare în soluții de mimează plasma umană au drept scop evidențierea capacității materialelor sintetizate de a forma un strat mineral pe suprafață sau în pori similar cu faza anorganică naturală a osului uman (strat apatitic, HA). Testele au fost efectate conform protocolului descris în capitolul Materiale și Metode în SBF 1x, temperatura 37 °C timp de 40 zile. După terminarea testelor, probele au fost spălate cu apa distilată, uscate și apoi caracterizate prin analize SEM.

Rezultatele sunt exprimate prin microfotografii SEM pentru fiecare compoziție sintetizată în cadrul proiectului (exemplificare compoziție 10-90 cu 1% magnetită, figura 14). Imaginile ne arată formarea unui strat mineral pe suprafața materialului, dar morfologia nu este specifică cristalelor de hidroxiapatită (structura de ace ce cresc din material e suprafață sau în pori). Probabil stratul mineral format este format din fosfat de calciu, dar alta structură diferită de hidroxiapatită (apatită deficitară în calciu, brușită etc).

Figura 14. Microfotografii SEM pentru hidrogelurile pe bază de fibroină, poliacrilamidă

(10/90) și magnetită 1% incubate în SBF 1x (mărire 6000 stânga, mărire 80000 dreapta)

Evaluarea comportamentului la biomineralizare prin metoda ciclurilor alternante

Rezultatele testelor de mineralizare rapidă (metoda ciclurilor alternante) sunt prezentate în figura 15 (a, b, c)

a b

c

Figura 15. Microfotografii SEM pentru hidrogelurile pe bază de fibroină, poliacrilamidă

și magnetită 1% incubate cu metoda rapidă (a-10-90, b-30-70 și c-50-50)

Microfotografiile SEM relevă de această dată prezenta cristalelor minerale de hidroxiapatită pe suprafața hidrogelurilor (dar și în fractură) cu diferite compoziții. Forma aciculară este specifica cristalelor de apatită, iar fenomenul de formare a acesteia este influențat și de prezența magnetitei în structura gelului, dar și de fibroină a cărei capacitate de mineralizare este cunoscută din literatura de specialitate. Capacitatea bună de mineralizare a acestora în soluții alternante poate fi o metoda viabilă de a obține materiale hibride cu apatită pe suprafață sau în structura internă pentru aplicații în ingineria țesutului osos.

3.6 Caracterizare biologică a hidrogelurilor prin teste de biocompatibilitate pe linii celulare specifice

Studiul de testare in vitro a urmărit evidențierea biocompatibilitătii probelor sintetizate pe bază de fibroină, poliacrilamidă și magnetită în termenii eventualului potential citotoxic manifestat de acest suport și al morfologiei fibroblastelor crescute în mediul ce conține extractul lor.

Testul MTT indică o viabilitate crescută pentru probele X si Z, astfel valorile densităților optice obținute în cazul culturii de fibroblaste în mediu cu extractul probelor X, Y, Z si T la 72 h de la însămânțare sunt cu 92%, 64%, 89% și respectiv 74 mai mici decat în control. Rezultatele acestui test sunt prezentate în figura de mai jos.

Figura 16. Evolutia gradului de proliferare a celulelor expuse în condiții standard de cultivare și în prezența extractului

Eventualele efecte citotoxice ale hidrogelurilor au fost investigate prin studiul spectrofotometric al activitatii LDH, eliberată în mediul de cultură de către celulele cu integritatea membranară compromisă. Dupa cum reiese din figura17, viabilitatea celulară nu este afectata considerabil de prezenta gelurilor, indicând că suporturile sunt compatibile.

Figura 17. Evaluarea eliberarii LDH în mediul de cultură în condiții standard de cultivare și în prezența extractului

Statusul fiziologic al CCD-1070Sk crescute în prezența extractului probelor 1, 2, 3 și 4 a fost monitorizat comparativ cu controlul la 24 h, 48 h și 72 h prin microscopie în contrast de fază (figura 18).

Microfotografiile din figura 18 indică faptul că la toți cei 3 timpi de monitorizare, celulele manifestă o morfologie tipică liniei de fibroblaste dermale CCD-1070Sk (celule elongate, fibroblast-like) și o densitate celulară care crește în timp, ca rezultat al proliferării celulare atât în control cât și în probele 1, 2, 3 si 4; astfel gradul de proliferare se corelează cu studiile prezentate anterior.

Figura 18. Morfologia in contrast de faza a fibroblastelor (linia CCD-1070Sk), la 24, 48 si 72 ore de la însamantare, crescute pe suportul de plastic în condiții standard de cultivare și in mediul cu extract (x10)

4. Concluzii

Lucrarea de față a urmărit obținerea unor hidrogeluri pe bază de fibroină din mătase naturală Bombyx mori și nanoparticule magnetice si caracterizarea acestora în vederea unei potențiale utilizări în ingineria tisulară.Aceste hidrogeluri au fost obținute prin polimerizarea acrilamidei și a N,N’-metilenbisarilamidei în soluție de fibroină, în mediul de reacție fiind adăugate și nanoparticule magnetice de magnetită.

Evaluarea comportamentului la gonflare în soluție salină la 37 °C a evidențiat faptul că gradul de gonflare crește odata cu creșterea conținutului de fibroină din hidrogel. Se remarcă un grad mai mare de gonflare în cazul gelurilor cu conținut de magnetită, dar acesta are același trend crescător cu conținutul de fibroină.

Hidrogelurile prezintă o capacitate modestă de biomineralizare prin incubarea in SBF 1x, acestea fiind acoperite de un strat mineral a cărui morfologie nu corespunde hidroxiapatitei.

Analiza SEM pe hidrogelurile mineralizate cu metoda rapidă (cicluri alternanate) a arătat formarea unui strat mineral de apatită uniform distribuit pe suprafața hidrogelurilor. Se poate remarca efectul benefic al fibroinei și nanoparticulelor asupra procesului de mineralizare prin această metodă.

Evaluarea biologică a materialelor sintetizate a evidențiat un potențial citotoxic minim al suporturilor față de celulele fibroblaste utlizate. Rezultatele arată o bună compatibilitate a celulelor cu hidrogelurile testate și susțin idea testărilor viitoare pentru aplicații medicale.

Rezultatele preliminare obținute pe aceste biomateriale de tip hidrogel cu conținut de fibroină, polimer sinteticși magnetită susțin inițiativa dezvoltării de materiale hibride organic-anorganice, analoage structurii osoase, având la bază hidrogeluri cu conținut de fibroină din vierme de mătaseși particule magnetice, ca substrat pentru depunerea cristalelor de hidroxiapatită.

5. Referințe bibliografice

[1]. T.R. Malow, C.C. Koch, Acta Mater. 45 (1997) 2177.

[2]. G.Kickelbick, Hybrid Materials. Synthesis, Charactezization, and Applications, Copyright 2007 Wiley VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim; ISBN: 9783-527312993.

[3]. R. Ciprian, Contribuții la studiul elementelor de protezare obținute prin protoripare rapidă, Teza de doctorat, Universitatea Transilvania din Brașov, (2008), conducător științific Prof. dr. ing. Ileana Constanța Roșca.

[4]. C. Cincu, H. Iovu, C, Zaharia, A. Diaconu, Biomateriale Polimerice și Aplicațiile Biomateriale, Editura Politehnica Pres, (2009) ISBN 978-606-515-068-3.

[5]. Mătase naturală. Proprietăți și caracterizări fizici-mecanice și chimice, disponibil la:http:// http://www.dex-tex.info/fibrele-naturale/matasea-naturala, Accesat: 26.03.2016.

[6]. F. Heidaria , M. E. Bahrololooma , D. Vashaeeb , L. Tayebi, In situ preparation of iron oxide nanoparticles in natural hydroxyapatite/chitosan matrix for bone tissue engineering application, Ceramics International, 41, pg.3094-3100, 2015.

[7]. V. H. Nguyena, Y. Haldorai , Q. L. Phama, J-J. Shima, Supercritical fluid mediated synthesis of poly(2-hydroxyethyl methacrylate)/Fe3O4 hybrid nanocomposite, Materials Science and Engineering B, 176, pg. 773-778, 2011.

[8]. J. A. Marins , B. G. Soares , H S. Barud, S. J.L. Ribeiro, Flexible magnetic membranes based on bacterial cellulose and its evaluation as electromagnetic interference shielding material, Materials Science and Engineering C, 33, pg. 3994-4001, 2013.

[9]. J. R. Correa, E. Bordallo, D. Canetti, V. Leon, L. C. Otero-Diaz, C. Negro, A. Gomez, R. Saez-Puche, Structure and superparamagnetic behaviour of magnetite nanoparticles in cellulose beads, Materials Research Bulletin, 45, pg. 946-953, 2010.

[10]. L-D. Koh, Y. Cheng, C-P. Teng,Y-W. Khin, X-J. Loh, S-Y. Tee, M. Low, E. Ye, H-D. Yu, Y.-W. Zhang, M-Y. Han, Structures, mechanical properties and applications of silk fibroin materials, Progress in Polimer Science, 46, pg. 86-110, 2015.

[11]. F. Vollrath, D. Porter, Silks as ancient models for modern polymers, Polymer, 50, pg. 5623-5632, 2009.

[12]. A. P. Tabatabai, D. L. Kaplan, D.l L.Blair, Rheology of reconstituted silk fibroin protein gels: the epitome of extreme mechanics, Soft Matter, 11, pg.756-761, 2015.

[13]. H. Zhang, L. Li, F.Dai, H. Zhang, B. Ni, W. Zhou, X. Yang, Y. Wu, Preparation and characterization of silk fibroin as a biomaterial with potential for drug delivery, Journal of Translational Medicine, 10:117, pg.1-9, 2012.

[14]. V. Kancevicha, A. Lukyanchikovs, Silk Fibroin Bombyx Mori Yarns for Bio-Resistant Woven Aortic Prostheses, Material Science. Textile and Clothing Technology,7, pg.13-16, 2012.

[15]. K. A. George, A. M. A. Shadforth,T. V. Chirilă, M. J. Laurent,S-A Stephenson, G. A. Edwards, P. W. Madden,D. W. Hutmacher, D. G. Harkin,Effect of the sterilization method on the properties of Bombyx mori silk fibroin films, Materials Science and Engineering, 33, pg. 668-674, 2013.

[16].D. N. Rockwood, R. C. Preda, T. Yücel, X. Wang, M. L. Lovett, D. L. Kaplan, Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin, Nature Protocols, 6, pg.1612-1631, 2011.

[17]. A. Sionkowska , K. Lewandowska, M. Michalska, M. Walczak, Characterization of silk fibroin 3D composites modified by collagen,Journal of Molecular Liquids, 215, pg.323-327, 2016.

[18].Y. N. Jo, I. C. Um, Effects of solvent on the solution properties, structural characteristics and properties of silk sericin, International Journal of Biological Macromolecules, 78, pg. 287-95, 2015.

[19].M. S. Zafar, K. H. Al-Samadani, Potential use of natural silk for bio-dental applications, Journal of Taibah University Medical Sciences, Taibah University, 9, pg.171-177, 2014.

[20].P. Aramwit, N. Bang, The characteristics of bacterial nanocellulose gelreleasing silk sericin for facial treatment, Aramwit and Bang BMC Biothenology, 14:104, 1-12, 2014.

[21].S. Xu, J. Song, H. Morikawa,Y. Chen, H. Lin, Fabrication of hierarchical structured Fe3O4 and Ag nanoparticles dual-coated silk fibers through electrostatic self-assembly, Materials Letters, 164, pg. 274-277, 2016.

[22]. S. Çalamak, C. Erdoğdu, M. Özalp, K. Ulubayram, Silk fibroin based antibacterial bionanotextiles as wound dressing materials, Materials Science and Engineering, 43, pg. 11-20, 2014.

[23]. M. Li, J. Li, Biodegradation behavior of silk biomaterials, Silk Biomaterials for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, ISBN: 978-0-85709-699-9, pg. 330-334, 2014.

[24]. C. Zaharia, M-R. Tudora, I.C. Stancu, B. Gălățeanu, A. Lungu, C. Cincu, Characterization and deposition behavior of silk hydrogels soaked in simulated body fluid, Materials Science and Engineering, 32, pg. 945-952, 2012.

[25]. A. C. Nechifor, L. D. Ghindeanu, C. Orgeci, O. Dorca, E.Eftimie Toru, Nanopaticule reactive magnetită-polietilenglicil-clorură de cianuril, Revista Română de Materiale, 43, pg. 285-292, 2013.

[26]. P. Russell,D. Batchelor, SEM and AFM: Complementary Techniques for Surface Investigations, Microscopy andAnalysis, pg. 9-12, 2001.

[27]. T. Kokubo, Bioactive glass ceramics: properties and applications, Biomaterials, 12, pg. 155–163, 1991.

[28]. T. Kokubo, H. Takadama, How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity?,  Biomaterials, 27, pg. 2907–2915, 2006

[29]. T. Taguchi, Y. Sawabe, H. Kobayashi, Y. Moriyoshi, K. Kataoka, J. Tanaka, Preparation and characterization of osteochondral scaffold, Materials Science and Engineering C, 24, pg. 881–885, 2004.