Analize Biochimice Si Genetice la Unele Tulpini de Bacterii Lactice Izolate din Produse Traditionale Romanesti

Cuprins

INTRODUCERE

Bacteriile lactice (LAB) sunt un grup de microorganisme Gram pozitive, imobile, ce nu formează spori, sunt lipsite de activitate catalazică și lanț respirator. Acestea desfășoară o fermentație anaerobă a carbohidraților, în special a glucozei, având drept produs final de metabolism acidul lactic. În ceea ce privește morfologia, bacteriile lactice se găsesc fie sub formă de coci, fie sub formă de bacili sau cocobacili (Lahtinen și colab., 2011).

Acestea se găsesc în medii foarte variate precum: plante, alimente fermentate, sol, dar și în microbiota tractului gastrointestinal uman și animal. Cele mai studiate genuri de bacterii lactice sunt: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus și Leuconostoc, însă acest grup include mai multe genuri dintre care amintim: Oenococcus, Wisella, Vagococcus, Tetragenococcus, Enterococcus, Carnobacterium, Aerococcus (Lahtinen și colab., 2011).

LAB sunt microorganisme cu importanță industrială, fiind utilizate pentru a ȋntȃrzia procesul de alterare și ȋn conservarea alimentelor prin fermentație naturală, dar prezintă, ȋnsă, și aplicații comerciale ca și culturi starter ȋn diferite industrii precum cea a produselor lactate, de panificație, alimentară și cea a băuturilor alcoolice (Phumhkachorn și Rattanachaikunsopon, 2010).

În urma fermentației, bacteriile lactice produc substanțe antimicrobiene precum acizi organici (lactic, acetic, propionic), diacetil, H2O2, acetaldehidă și bacteriocine sau proteine bactericide. Aceste componente sunt utilizate nu doar pentru efectul lor asupra gustului mȃncării, al mirosului, culorii și texturii, dar și pentru potențialul de a inhiba microorganisme patogene (Phumhkachorn și Rattanachaikunsopon, 2010).

Scopul acestei lucrări a fost acela de identificare de noi tulpini de bacterii lactice și de demostrare a activității antimicrobiene a acestora dată de componentele pe care le produc în urma fermentației. Pentru atingerea scopului propus s-au efectuat mai mulți pași, care au constat în: cultivarea de bacterii lactice izolate din diferite medii, efectuarea de teste preliminare de încadrare în grupul bacteriilor lactice precum cultivarea bacteriilor pe mediu MRS+CaCO3, testul catalazei și cel al oxidazei, teste biochimice precum testul API și testul Biolog. Izolarea ADN genomic este primul pas în studierea la nivel molecular al bacteriilor lactice. În acest studiu s-a efectuat și verificarea activității antimicrobiene prin testul difuzimetric pentru a evidenția producerea de componente antimicrobiene precum bacteriocine, acizi organici, care sunt din ce în ce mai utilizate atât în industria produselor lactate cât și în industria farmaceutică și nu numai.

Partea teoretică

Caractere generale ale bacteriilor lactice

I.1 Clasificarea bacteriilor lactice

Ȋn 1919, Orla Jensen a realizat clasificarea bacteriilor lactice (LAB) pe baza mai multor criterii precum morfologia celulară, modul de fermentare al glucozei și utilizarea altor zaharuri, temperatura de creștere. Aceste criterii reprezintă baza clasificării bacteriilor lactice și în prezent. Datorită metodelor moderne de clasicare, cum ar fi cele de biologie moleculară, numărul de genuri care aparțin acestei categorii de bacterii a crescut de la cele 4 genuri identificate de Orla Jensen (Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus) la 12 genuri și anume (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Oenococcus, Wisella, Vagococcus, Tetragenococcus, Enterococcus, Carnobacterium, Aerococcus) (Lahtinen și colab., 2011).

Bacteriile lactice (LAB) sunt asociate fermentației alimentelor și furajelor și sunt ȋn general considerate microorganisme benefice. Totuși, anumite genuri, ca de exemplu Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Carnobacterium prezintă specii și tulpini care sunt recunoscute ca și patogeni ai omului și animalelor (Lahtinen și colab., 2011).

Potrivit clasificării taxonomice actuale bacteriile lactice aparțin Ȋncrengăturii Firmicutes, Clasei Bacili și Ordinului Lactobacillales, avȃnd următoarele Familii: Aerococcaceae, Carnobacteriaceae, Enterococcaceae, Lactobacillaceae, Leuconostocaceae, Streptococcaceae și genuri precum Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Oenococcus, Wisella, Enterococcus, Carnobacterium, Vagococcus, Aerococcus, Tetragenococcus (Lahtinen și colab., 2011).

I.2 Filogenie

Din punct de vedere filogenetic, bacteriile lactice pot fi identificate pe baza criteriilor de biologie moleculară, cum ar fi secvențierea ARNr. Aparent, bacteriile lactice ancestrale au fost microorganisme izolate din sol, ce se asemănau cu bacteriile din genul Bacillus (figura 1). Ulterior, acestea au fost nevoite să se adapteze la diferite medii de viață în vederea supraviețuirii, pierzând astfel mai multe gene și funcții filogenetice specifice bacteriilor din genul Bacillus (Lahtinen și colab., 2011).

Dintr-un studiu comparativ, care includea 10 genomuri noi și cele deja cunoscute ale genurilor Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc și Oenococcus s-a stabilit că aceste bacterii lactice au un strămoș comun cu bacilii, iar genomul complementar este rezultatul combinației dintre pierderea masivă de gene și transferul orizontal de gene în timpul evoluției (Makarova și colab., 2006). În acest studiu s-a descoperit și un set de gene de bază, care se găsește la toate LAB și anume LaCOG format din 567 de gene (Claesson și colab., 2008).

Figura 1. Arbore filogenetic al genurilor ce aparțin grupului de bacterii lactice, cuprinzȃnd și anumite firmicute aerobe facultativ anaerobe ( Lahtinen și colab., 2011).

I.3 Caractere fiziologice și morfologice

Bacteriile lactice constituie un grup de bacterii Gram pozitive ce ȋntrunesc anumite caractere morfologice, metabolice și fiziologice (tabel 1-2). Acestea se găsesc sub formă de coci sau bacili nesporulați, care produc acid lactic drept produs majoritar al fermentației carbohidraților. Sunt lipsite atât de activitate catalazică cât și de activitate oxidazică, dar și de citocromi. Bacteriile lactice au o temperatură de creștere situată ȋntre 20 – 45ºC. În plus, au o toleranță ridicată pentru medii acide (pH<5), ceea ce le conferă un avantaj față de alte bacterii (Lahtinen și colab., 2011).

Tabel 1. Caracterizarea genurilor de LAB în funcție de forma celuară si creșterea la diferite temperaturi

(Lahtinen și colab., 2011)

Tabel 2. Caracterizarea genurilor de LAB în funcție de creșteri la diferite concentrații de NaCl si pH

(Lahtinen și colab., 2011)

I.4 Metabolismul bacteriilor lactice

Datorită faptului că bacteriile lactice nu posedă un aparat respirator funcțional, acestea sunt nevoite să ȋși furnizeze energie prin fosforilare la nivelul substratului. Există două căi fermentative de bază care utilizează hexozele (Figura 2):

a)Calea homofermentativă, care se bazează pe glicoliză (sau calea Embden-Meyerhof-Parnas= EMP) cu producere exclusivă de acid lactic. Această cale de metabolism se realizează ȋn două etape, anume glucoza este transformată ȋn acid piruvic ȋn glicoliză, care este apoi redus la acid lactic, produs unic al fermentației, de către puterea reducătoare produsă anterior sub formă de NADH. Astfel, teoretic, în urma metabolizării unei molecule de glucoză, se formează două molecule de acid lactic și două molecule de ATP, dar practic rapotul este mai mic deoarece o parte din sursa de carbon este utilizată pentru obținerea de biomasă. Bacteriile lactice care manifestă acest tip de fermentație sunt diferite specii din genul Lactobacillus (L. acidophilus, L. amylophilus, L. bulgaricus, L. helveticus, L. salivarius). În condiții de stres, precum pH ridicat, temperaturi scăzute, sursă de carbon limitată sau în prezența unei surse de carbon diferită decât glucoza, bacteriile homofermentative produc acid formic prin fermentare acidă mixtă sub acțiunea piruvat:formiat liazei (Martinez și colab., 2013).

Glucoză 2 Acid lactic + 2ATP

b) Calea heterofermentativă sau fermentația heterolactică, cunoscută de asemenea ca și calea pentozofosfaților, șuntul hexozomonofosfat (HMP) sau calea 6-fosfogluconat, care produce pe lȃngă acid lactic o cantitate mare de CO2 , etanol și acid acetic drept produși finali de metabolism. Acest tip de fermentație realizează degradarea glucozei ȋn primă fază (calea pentozofosfat) din care va rezulta gliceraldehid 3-fosfat(G3-P), acetil fosfat și CO2. G3-P va intra ȋn glicoliză și va fi tranformat ȋn acid lactic, iar acetil fosfatul va fi convertit la acid acetic și/sau etanol. Microorganismele care utilizează această cale de degradare a carbohidraților sunt Lactobacillus brevis, L. fermentum, L. parabuchneri, L.reuteri (Martinez și colab., 2013).

Glucoză Acid lactic + Etanol + CO2 + ATP

Glucoză Acid lactic + CO2 + Acid acetic + 2ATP + 2NADH

Ȋn afară de glucoză, există și alte surse de carbon care pot fi utilizate de bacteriile lactice cum ar fi fructoza, manoza, galactoza. Pe de altă parte, există microorganisme care pot folosi, ȋn absență de hexoze, pentozele. Acestea sunt bacterii facultativ heterofermentative, care realizează ambele tipuri de fermentație, consumȃnd hexoze pe cale homolactică și pentoze pe cale heterolactică. Însă, catabolismul pentozelor necesită etape suplimentare de conversie prin care acestea sunt transformate în intermediari metabolici ai căii pentozo-fosfat. De exemplu, xiloza este transformată la xiluloză și apoi fosforilată la xilulozo-5-fosfat sau arabinoza trasformată, inițial, în ribuloză și mai apoi fosforilată la ribulozo-5-fosfat. Ȋn această categorie intră specii din genul Lactobacillus (L. plantarum, L. casei, L. rhamnosus, L. lactis, L. pentosus, L. xylosus (Martinez și colab., 2013).

Figura 2. Schema metabolismului glucozei la bacteriile lactice (Lahtinen și colab., 2011).

Principalele genuri de bacterii lactice

În grupul bacteriilor lactice se regăsesc aproximativ 12 genuri bacteriene. Însă, cele mai studiate specii bacteriene aparțin genurilor Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconstoc și Streptococcus.

II.1 Genul Lactococcus

Genul Lactococcus (L.) (anterior denumit „Streptococci de grup N”) cuprinde 7 specii: Lactococcus lactis, ce include subspeciile cremoris, lactis, hordniae; L. garvieae, L. plantarum, L. raffinolactic, L. chungangensis, L. fujiensis, ce au fost identificate pe baza criteriilor morfologice, chemotaxonomice și de biologie moleculară (Lahtinen și colab., 2011). Ȋn tabelele 4 și 5 sunt caracterizate cele 7 specii de lactococci din punct de vedere fiziologic și al tipului de carbohidrat fermentat.

Din punct de vedere morfologic, lactococci sunt coci Gram pozitivi cu dimensiuni ȋntre 0.5 și 1.5 μm, ce formează lanțuri scurte. Sunt microorganisme mezofile, ce utilizează hexozele ȋn procesul de fermentație și au drept produs homofermentativ L(+) acid lactic (Lahtinen și colab., 2011).

Lactococcii au fost izolați din materiale vegetale, lapte sau alte surse animale precum intestinul uman, dar se găsesc și în alte medii, de exemplu Lactococcus chungangensis a fost izolat inițial din nămol (Cho și colab., 2008).

Tabel 4. Caractere fiziologice care diferențiază speciile de Lactococcus (Lahtinen și colab., 2011)

Lactococcus lactis este specia comună din laptele crud, apărută ȋn urma contaminării din foraje. Lactococcus garvieae a fost izolat dintr-un caz de mastită (Collins și colab, 1983), dar este cunoscut mult mai bine ȋmpreună cu Lactococcus piscicum ca și patogen al peștelui. L. garvieae se găsește ȋn ape calde, ȋn timp ce L. pisicum apare la temperaturi sub 15ºC. Lactococcus garvieae s-a găsit recent și ȋn produse lactate unde produce fermentația lactozei, ȋn timp ce tulpinile izolate din pește nu descompune lactoza (Fortina și colab., 2003).

Tabel 5. Caracterizarea speciilor de Lactococcus în funcție de tipul de carbohidrat fermentat (Lahtinen și colab., 2011)

Genul Lactococcus poate fi confundat cu genul Enterococcus, diferă ȋnsă de acesta prin reacția sa antigenică și capacitatea redusă de a crește la 45ºC. Ȋn ceea ce privește materialul genetic, conținutul lactococcilor in G+C este de 38% – 40% (Lahtinen și colab., 2011).

Acest gen de bacterii lactice formează un grup compact alcătuit din șapte specii bacteriene, izolate din variate surse precum plante, alimente crude, om. Lactococcii au o gamă largă de utilizări, de la culturi starter în produsele lactate până la conservarea produselor non-lactate.

II.2 Genul Lactobacillus

Lactobacilii sunt bacterii Gram pozitive microaerofile, care se găsesc ȋntr-o diversitate de medii precum: medii lactate bogate ȋn nutrienți, habitate gazdă cu conținut microbian precum suprafața mucoasei intestinale umane, dar și în nișe ecologice (plante, sol) (Lahtinen și colab., 2011).

Lactobacillus (L.) este un gen extrem de eterogen, cuprinzând bacterii cu o gamă largă de proprietăți biochimice și fiziologice. Inițial, lactobacillii au fost împărțiți în 3 grupe filogenetice anume: L.casei-Pediococcus, Leuconostoc și L.acidophilus. Ulterior, după studii mai amănunțite la nivel molecular aceste trei grupe au fost redenumite astfel: grupul L.casei, clusterul salivarius și complexul acidophilus. Acest gen cuprinde cele mai multe specii bacteriene dintre toate genurile ce aparțin grupului de bacterii lactice, având peste o sută de specii diferite, ȋn afară de cele bine cunoscute din punct de vedere biologic, tehnologic și comercial precum L. acidophilus, L. casei, L. delbrueckii subspecia bulgaricus, L. plantarum, L. rhamnosus, L. salivarius (Lahtinen și colab., 2011).

În 1919, Orla-Jensen a împărțit lactobacillii în trei grupe: Thermobacterium, Streptobacterium, Betabacterium. În tabelul 6. este realizată o caracterizare a celor trei clase de lactobacilli precum și specii cunoscute care aparțin fiecărui grup.

Tabel 6. Caracterizarea grupelor de lactobacilii (Sharpe și colab., 1973).

În ceea ce privește morfologia, lactobacillii au formă de bacili sau cocobacili (formă intermediară ȋntre coc și bacil), se găsesc fie izolați, fie sub formă de lanțuri scurte sau lungi. Lactobacilii prezintă metabolism atȃt homofermentativ, cȃt și heterofermentativ, dar și homofermentativ facultativ-heterofermentativ. Speciile acestui gen nu necesită condiții de creștere preferențiale dar, fiind microaerofile, acestea cresc ȋntr-un mediu sărac ȋn oxigen (Lahtinen și colab., 2011). Alte caractere fiziologice sunt prezentate în tabelul 7. Cu toate acestea, s-au găsit specii care prezintă, în formă rudimentară, catene transportoare de electroni care, în prezență de cofactori exogeni, pot folosi oxigen molecular și azotat în respirație (Brooijmans și colab., 2009).

Acest gen de bacterii lactice prezintă un conținut în GC (guanină+citozină) cuprins între 33% – 51%, reprezentând un procent de două ori mai mare în comparație cu alte genuri bacteriene cunoscute (Fujisawa și colab., 1992).

Tabel 7. Caractere fiziologice ale lactobacililor (Shah, 2007; Rhee și colab, 1980; Sullivan și colab., 1939).

Lactobacilli se găsesc ȋn diverse medii. Lactobacillus plantarum este o specie care apare ȋn mod normal și ȋn cantitate dominantă ȋn legume precum varza și lăptuca (Yang și colab., 2010). Anumite specii ale acestui gen se găsesc și ȋn alimente non-lactate fermentate precum carnea, dar și ȋn sol (L. plantarum, L. paracasei subs paracasei, L. brevis) (Chen și colab., 2005). La om, lactobacillii se găsesc de-a lungul tractului gastrointestinal, de la nivelul cavității bucale pȃnă în materiile fecale, constituind microbiota normală. Ȋn cavitatea bucală, aceștia sunt prezenți ȋn salivă și ȋn placa dentară (L. rhamnosus, L. gasseri, L. casei), avȃnd efect protector ȋmpotriva patogenilor, însă, ca producători de acizi, duc la eroziune dentară ( Lahtinen și colab. 2011).

II.3 Genul Pediococcus

Genul Pediococcus (P.) cuprinde bacterii Gram pozitive, imobile, ce nu prezintă acțiune catalazică, dar nici oxidazică. Aceste bacterii se găsesc sub formă sferică, ce se grupează în tetrade prin diviziune alternativă în două direcții perpendiculare sau forme diploide (Günther și White, 1961). Unele tulpini pot prezenta activitate pseudocatalazică pe medii sărace în carbohidrați. Spre deosebire de ceilalți coci LAB, membrii acestui gen nu formează lanțuri de celule (Weiss, 1992).

În acest gen sunt incluse specii precum: P. acidilactici, P. claussenii, P. cellicola, P. damnosus, P. dextrinicus, P. ethanolidurans, P. inopinatus, P. parvulus, P. pentosaceus, P. stilesii, P. cerevisiae (Franz și colab., 2006).

Pediococcii prezintă un metabolism homofermentativ facultativ aerobic, ce produc LD-acid lactic cu excepția P. claussenii și P. argentinicus, care produc L(+)-acid lactic ca produs major final de metabolism, dar nu și CO2. Acești au capacitatea de a fermenta mai multe tipuri de carbohidrați în afară de glucoză (tabel 8-9) și se pot dezvolta în concentrații de etanol cuprinse între 6% – 7,5% (tabel 9). Aceștia pot crește la un pH 5, dar nu și la un pH alcalin de 9. De asemenea, nu pot reduce nitratul și nu formează indol din triptofan (Dobson și colab., 2002).

Tabel 8. Caracterizarea pediococcilor în funcție de tipul de carbohidrat fermentat și al tipului de acid format (De Bruyne și colab., 2008)

Tabel 9. Caracterizarea pediococcilor în funcție de tipul de carbohidrat fermentat și de concentrația de etanol acceptată (Liu și colab., 2006).

Pediococcii au o temperatură de creștere între 5 – 50°C, iar la concentrații de NaCl mai mari de 10% creșterea este oprită (tabelul 10). Pediococcii prezintă un conținut în GC cuprins între 37% – 40% (Nakagawa și Kitahara, 1959).

Pediococcii, asemeni celorlalte specii de bacterii lactice, se găsesc atât în tractul gastrointestinal uman sau animal cât și în alimente crude sau procesate. Cele mai studiate specii de pediococci sunt P. acidilactici și P. pentosaceus deoarece prezintă importanță ecologică și potențial biotehnologic. Aceste două specii se găsesc atât în materiale vegetale crude cât și în materiale în proces de fermentație, unde se găsesc împreună cu lactobacilli, leuconostoci și alte specii de bacterii lactice (Holzapfel și colab., 2006).

Tabel 10. Condiții de creștere a pediococcilor (Nakagawa și Kitahara, 1959)

II.4 Genul Leuconostoc

Genul Leuconostoc (L.) cuprinde cocci Gram pozitivi, imobili, care nu produc spori, de formă elipsoidală spre sferică, uneori elongată (adesea confundați cu bacilii), ce formează perechi sau lanțuri. Acest gen cuprinde specii precum: Leuconostoc mesenteroides (cu trei subspecii, mesenteroides, dextranicum și cremoris) și alte 13 specii: L. citreum, L. carnosum, L. durionis, L. fallax, L. ficulneum, L. pseudoficulneum, L. fructosum, L. gasicomitatum, L. gelidum, L. inhae, L. kimchii, L. lactis, L. pseudomesenteroides (Lahtinen și colab., 2011).

Leuconostocii nu formează capsule celulare adevărate. Însă, multe dintre ele produc dextran extracelular ce formează un înveliș dens de electroni. În ceea ce privește metabolismul, acestea sunt bacterii heterofermentative facultativ anaerobe și nu au activitate catalazică (Johansson și colab., 2011). În urma fermentației glucozei se produc cantități egale de D(-)-acid lactic, CO2, etanol sau acetat. Membrii acestui gen nu pot hidroliza arginina și nu reduc nitratul. De asemenea, nu au activitate proteolitică și nici hemolitică precum nici capacitatea de a forma indol. Leuconostocii au un pH de creștere de 6.5, dar au fost cazuri în care s-a evidențiat creștere și la un pH al mediului de 4.5. Temperatura optimă de creștere a acestor bacterii este de 20 – 30°C, dar specii precum L. carnosum, L. gasicomitatum, L. gelidum, L. inhae cresc la frigider (4°C), iar unele tulpini chiar la temperaturi de 1°C ( Lahtinen și colab., 2011). În tabelele 11-12 sunt evidențiate mai multe caractere fiziologice ale leuconostocilor precum și conținutul în GC%.

Tabel 11. Caracterizarea speciilor de Leuconostoc după tipul de zahar fermentat (Shaw și Harding, 1989; Farrow și colab., 1989; Bjőkroth și colab., 2000).

Tabel 12. Caractere fiziologice și conținutul în GC al leuconostocilor (Shaw și Harding, 1989; Farrow și colab., 1989; Bjőkroth și colab., 2000).

Un criteriu de identificare al acestor bacterii este acela că leuconostocii sunt rezistenți la vancomicină. Spre deosebire de alte bacterii rezistente la acest antibiotic cum ar fi lactobacillii, leuconostocii au o formă mai circulară decât lactobacillii. În ceea ce privește toleranța la NaCl, Leuconostoc mesenteroides manifestă toleranță la concentrații de 6.5% NaCl, spre deosebire de Leuconostoc pseudomesenteroides care nu tolerează această concentrație (Stiles și Holzapfel, 1997).

Leuconostocii se găsesc în special în material vegetal în descompunere și în plante verzi, dar și la nivelul rădăcinilor acestora, precum și în diverse materiale vegetale fermentate ca varza, măslinele, castraveții (Kim și Chun, 2005). În plus, aceștia se găsesc frecvent în produse de origine animală inclusiv în lapte crud și produse lactate (Borch și Molin, 1989). Cu toate acestea, foarte rar s-a raportat existența acestui gen bacterian la nivelul tractului gastrointestinal sau mucoasei animale sau umane, însă au fost descoperiți în intestinul peștilor. Specii precum Leuconostoc carnosum, L.gasicomitatum și L.gelidum au fost adesea asociate cu alterarea alimentelor ( Williams și Collins, 1900).

II.5 Genul Streptococcus

Membrii genului Streptococcus (S.) sunt bacterii Gram pozitive, lipsite de activitate catalazică, sunt citocrom-negative, prezintă un conținut relativ scăzut de GC cuprins între 34% – 46% și sunt facultativ anaerobe. Acestea nu au capacitatea de a reduce nitratul, iar în urma fermentației glucozei se formează predominant L(+)acid lactic, dar nu și CO2. (Lahtinen și colab., 2011).

Acest gen cuprinde numeroase specii, cele mai studiate fiind S. pyogenes, S. mutans, S. agalactiae, S. pneumoniae, S. sanguis, S.thermophilus, S. salivarius, S. uber (Lahtinen și colab., 2011).

Streptococcii formează lanțuri, care pot conține 50 sau chiar mai multe unități celulare. Această dispunere se datorează diviziunii, care se realizează de-a lungul unei singure axe (Ekstedt și Stollerman, 1960). Pereții transversali formează un unghi drept cu axul lanțului și, după diviziune, se evidențiază, uneori, perechi de celule strâns unite în cadrul lanțului. Uneori, pe medii solide, steptococcii se pot dezvolta sub formă de tije alungite (bacili). În general, sunt bacterii imobile, însă S. sanguis manifestă o anumită motilitate prin utilizarea fimbrilelor polare de tip IV, care desfășoară o translocare de tip cârlig de-a lungul suprafețelor (Henriksen și Henrichsen, 1975). Aceste fibre proteice de suprafață se găsesc la nivelul mai multor streptococci și au un rol important în aderența bacteriilor pe suprafețe și la protejarea acestora de acțiunea fagocitară. Cele mai multe bacterii streptococcice cresc în aer, însă există unele, cum ar fi S. pneumoniae, care preferă o cantitate suplimentară de CO2, aceasta fiind o adaptare la medii precum cavitatea bucală (Lahtinen și colab., 2011).

Majoritatea streptococcilor cresc la o temperatură de 37°C, însă anumite specii precum S. uberis și S. thermophilus cresc la temperaturi scăzute de 10°C sau la temperaturi crescute de 45°C. Anumite specii de streptococci dau reacții de culoare, cum ar fi S. agalactiae (roșu-portocaliu) (De la Rosa și colab., 1992) sau S. mutans (galben) (Woltjes și colab, 1982).

Pe medii de cultură geloză-sânge, streptococcii manifestă diferite tipuri de hemoliză. Astfel, anumiți strepococci realizează o β-hemoliză, care se caracterizează prin formarea unor zone complete de hemoliză, alți streptococci produc în jurul coloniei un halou, o decolorare, de obicei verzuie, ce caracterizează α-hemoliza, în timp ce anumite specii nu produc hemoliza hematiilor, acest ”fenomen” fiind denumit γ-hemoliză. Cu toate acestea, anumite specii, precum S. pyohenes sunt deficitare în hemoliză, iar unele specii comensale de Streptococcus salivarius, manifestă o hemoliză-β asupra anumitor medii de geloză-sânge (Tompkins și Tagg, 1987).

Streptococcii sunt împărțiți în 6 grupe filogenetice, iar membrii ce aparțin fiecărui grup sunt listați în tabelul 13.

Grupul Piogenic

Streptococcii acestui grup sunt paraziți animali și pot cauza septicemie sau infecții ale tractului respirator. Cei mai mulți desfășoară o β-hemoliză. Multe dintre aceste specii sunt puternic adaptate la anumite gazde animale, iar unele pot cauza infecții zoonotice. Niciunul dintre streptococcii piogeni nu manifestă rezistență la căldură sau creștere la temperaturi extreme, pH sau concentrații de NaCl și nici nu au capacitate de reducere (Lahtinen și colab., 2011).

Grupul Anginosus

Acest grup cuprinde specii comensale de streptococci din cavitatea bucală, tractul gastrointestinal și urogenital feminin. Au importanță clinică, aceștia sunt cunoscuți drept agenți ai faringitei, produc infecții în diferite țesuturi și organe și sunt asociate cu formarea de abces (Lahtinen și colab., 2011).

Streptococcii acestui grup sunt specii care formează colonii mici și, deși unele manifestă β-hemoliză, cele mai multe nu au activitate hemolitică sau realizează α-hemoliză. Pe mediu de geloză-sânge, unele specii produc un miros caracteristic de caramel, datorat producerii de diacetil (Chew și Smith, 1992).

Grupul Mitis

Acest grup cuprinde multe dintre speciile streptococcice considerate în mod tradițional ”viridans” datorită α-hemolizei pe care o manifestă. Streptococcus parasanguis este o cauză a mastitei asimptomatice la oi (Fernandez-Garayzabal și colab., 1998), iar Streptococcus lactarius a fost descoperit în laptele matern de la femei sănătoase ( Lahtinen și colab., 2011).

Streptococcus pneumonie face parte din această categoria de streptococci piogeni datorită asemănării cu speciile definitorii ale acestui grup. Această specie este responsabilă de pneumonia comunitară, precum și de otită medie, sinuzită, meningită și endocardită. Se găsește, de obicei, la nivelul tractului respirator superior, unde nu provoacă nicio infecție (Henriquez-Normark și Normark, 2010).

Grupul Salivarius

Cuprinde trei specii comensale: Streptococcus salivarius și S. vestibularis, ce colonizează mucoasa bucală umană și S. thermophilus, un streptococc relativ termofil utilizat în producția de iaurt și de brânzeturi fierte italiene sau franceze (Schleifer și colab., 1991). Pe medii de geloză-sânge, S. salivarius produce colonii mucoide distincte datorită producerii de polizaharide extracelulare solubile în apă cum ar fi levanul. Această specie de strepctococc prezintă potențial probiotic și intră în competiție cu alte bacterii din cavitatea bucală datorită capacității sale de a sintetiza bacteriocine. S. vestibularis nu produce exopolizaharide, dar este urează-pozitiv ( Lahtinen și colab., 2011).

Grupul Bovis

Acest grup cuprinde specii care se găsesc în tractul intestinal al mai multor specii de animale. Streptococcus bovis este un colonizant normal al intestinului rumegătoarelor și al celui uman și este considerat a fi agentul cauzator al meningitei la om, dar și al septicemiei și endocarditei, însă este asociat și cu infecțiile gastrointestinale umane. Tulpinile izolate din infecțiile umane au fost împărțite în biotipuri: I, II.1 și II.2. Tulpinile ce aparțin biotipului I sunt asociate cu endocardita umană precum și cu tumorile de colon (Lahtinen și colab., 2011).

Grupul Mutans

Speciile acestui grup sunt bacterii relativ acidogene cu caracteristici similare, printre care și tendința de a se lega la suprafața dintelui, unde sunt asociate cu apariția cariilor dentare. Specia prototip, Streptococcus mutans, manifestă o dezvoltare dimorfă în cultură și anume: sub formă de cocci într-un mediu lichid optim și sub formă de tije scurte pe agar sau în culturi lichide acide. Majoritatea au activitate α-hemolitică, dar sunt și specii ce manifestă β-hemoliză (Lahtinen și colab., 2011)

Tabel 13. Grupuri filogenetice de streptococci (Kawarmura și colab., 1995; Hardie și Whiley, 1995; Schlegel și colab., 2003)

Importanța bacteriilor lactice

Bacteriile lactice (LAB) cuprind un grup larg de bacterii benefice, care au proprietăți similare și formează acid lactic drept produs final major ȋn procesul de fermentație (Ibourahema și colab., 2007). Sunt microorganisme cu importanță industrială, fiind folosite în fabricarea produselor lactate ca iaurtul, brânza, kefir-ul, în fermentarea alimentelor precum legume, carne, pește sau cereale, dar și în producerea băuturilor alcoolice (Derkx și colab., 2014). Speciile cu importanță industrială aparțin, de regulă, genurilor principale de bacterii lactice precum Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc și Oenococcus, ce au fost izolate din plante, produse lactate sau din carne ( El-Shafei și colab., 2000).

Bacteriile lactice sunt utilizate pentru o mare varietate de produse lactate fermentate, inclusiv băuturi cum ar fi kefirul și iaurtul sau produse solide precum brȃnza pentru a le ȋmbunătăți calitatea. Fabricarea acestor produse implică un proces microbian, prin care zaharul din lapte, lactoza, este convertit la acid lactic. Pe măsură ce acidul se acumulează, proteinele din lapte ȋși schimbă structura, se coagulează și astfel se schimbă și textura produsului. Ȋn plus, acidul lactic conferă gustul puțin acrișor al laptelui fermentat. Mai mult, bacteriile lactice produc anumiți compuși, care dau arome caracteristice produselor lactate (Paneri și colab., 2013).

Produsele lactate fermentate prezintă o gamă largă de arome, care au rezultat în urma conversiei biochimice a compușilor din lapte precum cazeina, grăsimile și lactoza. Mai ales în brânză, specia bacteriană lactică, Lactobacillus lactis, contribuie semnificativ la degradarea cazeinei, iar diferitele arome ale brânzeturilor se formează ca rezultat al proteolizei enzimatice. Astfel, L.lactis importă peptide mici provenite din proteoliza extracelulară, iar cu ajutorul peptidazelor intracelulare le convertește la aminoacizi, care ulterior vor fi transformați în compuși de aromă (van de Bunt și colab., 2014).

De exemplu, acetaldehida asigură gustul caracteristic iaurtului, ȋn timp ce diacetilul conferă o textură untoasă produselor lactate fermentate. Adesea, pentru a da un gust unic lactatelor, ȋn culturi se adaugă și alte microorganisme precum drojdiile. De exemplu, alcoolul și dioxidul de carbon produs de drojdii conferă kefirului și koumiss-ului gustul răcoritor (Paneri și colab., 2013).

Folosirea îndelungată a acestor bacterii în procesul de fermentație a produselor lactate s-a datorat încadrării majorității speciilor de LAB în categoria de microorganisme GRAS (Generally Regarded As Safe) în Statele Unite de către FDA (Food and Drug Administration) Office of Premarket Approval. Un concept similar este folosit și în Uniunea Europeană și anume statutul de QPS (Qualified Presumption of Safety) acordat de EFSA (Autoritatea Europeană pentru Siguranța Alimentară). În această categorie se regăsesc specii ale genurilor Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc. Cu toate acestea, anumite tulpini de bacterii lactice, în urma metabolismului, pot produce compuși toxici cum ar fi aminele endogene (Linares și colab., 2011).

Prin polimerizarea chimică a acidului lactic, produs de bacteriile lactice, este sintetizat industrial poliacidul lactic (PLA), un material biodegradabil si biocompatibil, care este folosit ca o alternativă mai bună a plasticului sintetic. Acidul lactic poate fi produs fie prin sinteză chimică, ca un subprodus ȋn industria petrochimică, fie prin fermentație microbiană. Procesul de fermentație a devenit din ce ȋn ce mai utilizat datorită materialelor biologice folosite, care pot fi regenerabile ȋn comparație cu petrochimicalele (Kharras și colab., 1993). Mai mult, procesul de fermentație poate fi folosit ȋn producerea de izomeri optici puri ai acidului lactic. Izomerii puri, L si D, ai acidului lactic sunt mai întrebuințabili decȃt forma racemică DL deoarece fiecare izomer își are propriile aplicații ȋn industria farmaceutică și cosmetică. Ȋn componența poliacidului lactic (PLA) raportul dintre izomerii L(-) și D(+) ai acidului lactic influențează degradarea polimerilor (Kharras și colab., 1993).

Bacteriile lactice sunt foarte importante ȋn industria alimentară și mai ales ȋn cea a produselor lactate datorită acidului lactic și ai altor acizi organici pe care ȋi produc și care acționează drept conservanți naturali precum și ca ameliatori de aromă. Însă, acestea sunt folosite din ce ȋn ce mai mult ca și probiotice, care ajută la stimularea răspunsului imun, previne infecția cu bacterii enteropatogene (Reid, 1999).

Ȋn ultimii ani au fost efectuate numeroase studii asupra probioticelor, prebioticelor, dar și sinbioticelor, privind ȋmbunătățirea sănătății prin utilizarea surselor naturale. Probioticele au fost definite de către FAO/WHO (Food and Agricultural Organization/World Health Organization) ca și ”microorganime vii care, atunci când sunt administrate ȋn cantități adecvate, conferă beneficii pentru sănătate gazdei” (Saarela, 2000). Cele mai bune surse naturale de probiotice sunt reprezentate de iaurt si produse fermentate din lapte. Ȋn prezent, probioticele au devenit subiectul major de cercetat ȋn studiile efectuate asupra bacteriilor lactice, ȋn special genurile Lactobacillus și Bifidobacterium. Aceste microorganisme exercită numeroase efecte benefice ȋn ceea ce privește stimularea sistemului imunitar, prevenirea creșterii celulelor canceroase, menținerea integrității mucoasei intestinale și păstrarea unui mediu nefavorabil patogenilor ( Chassard și colab., 2011).

Probioticele au fost utilizate de asemenea ȋn ȋmbunătățirea florei urogenitale. Studii efectuate asupra infecțiilor tractului urogenital, datorate scăderii protecției oferite de genul Lactobacillus, au evidențiat faptul că administrarea capsulelor ce conțin o combinație de probiotice, Lactobacillus rhamnosus GR-1 și Lactobacillus fermentum RC-14, a refăcut flora vaginală ȋn proporție de 90%. Microflora nazofaringiană a copiilor ce suferă de otită medie recurentă a fost, de asemenea, atenuată prin aplicarea unui spray nazal ce conține probiotice (Reid și colab., 2001).

Dintre tulpinile de bacterii lactice cu efect probiotic, Lactobacillus rhamnosus GG și Lactobacillus casei Shirota au cea mai mare eficacitate în sănătatea umană ȋn tratarea intoleranței la lactoză, diaree rotavirală și cea asociată consumului de antibiotice (Shah N.P., 2007). Ȋn tabelul 14. sunt enumerate cȃteva dintre efectele probioticelor asupra sănătății umane.

Tabel 14. Efecte ale probioticelor asupra sănătății ( Shea Beasley, 2004)

Alte beneficii aduse de consumul de probiotice (Gilliland, 2001) sunt:

prevenirea cancerului de colon

sindromul intestinului iritabil

boala numită diareea călătorului

tratarea constipației

controlul infecțiilor intestinale

inhibă creșterea bacteriei Helicobacter pylori

reduce pH-ul intestinului și inhibă dezvoltarea patogenilor de genul Echerichia coli, Salmonella sp.

ameliorează simptomele colitei ulcerative și a dermatitei atopice

Ȋn prezent, bacteriile lactice (LAB) sunt utilizate ȋn mai multe domenii precum industria alimentară, medicină, industria de sinteză a produselor chimice, farmaceutice, cosmetice și alte produse (figura 3).

Figura 3. Utilizări ale bacteriilor lactice (Paneri și colab., 2011).

Probioticele au fost mult timp utilizate ca tratament alternativ, tradițional ȋn scopul menținerii homeostaziei enterice și prevenirii bolilor. Totuși eficacitatea acestui tratament este și astăzi dezbătută. Studiile clinice au arătat că tratamentul cu probiotice poate reduce riscul apariției unor boli, mai ales diareea asociată tratamentului cu antibiotice, dar dovezi concludente nu pot fi aduse datorită gamei largi de dozaj și de tulpini bacteriene utilizate. Ȋn plus, se pare că acțiunea probioticelor este specifică in funcție de specia și tulpina bacteriană (Ohland și MacNaughton, 2010).

Prebioticele au fost definite pentru prima dată de către Gibson și Robertfroid ca fiind ”ingrediente alimentare nedigerabile ce influențează în mod benefic gazda prin stimularea selectivă a creșterii și/sau activității unui număr limitat de bacterii din colon”. Însă, această definiție se suprapune cu cea a fibrelor alimentare, deosebindu-se de aceasta doar prin selectivitatea pentru anumite specii (Jürgen și de Vrese, 2001). Prebioticele sunt oligo- și polizaharide ce prezintă rezistență la aciditatea gastrică, hidroliza enzimelor mamaliene și absorbției gastrointestinale (Gibson, 2004).

De asemenea, prebioticele pot fi fermentate de microflora intestinală, ducând la o creștere selectivă și o activitate crescută a microflorei benefice (Jürgen și de Vrese, 2001). Prebioticele acționează ca substrate nutritive, care stimulează creșterea și metabolismul bacteriilor endogene enterice benefice (Ghouri și colab., 2014).

Prebioticele includ substanțe precum inulina, galacto-oligozaharidele (GOS), fructo-oligozaharidele (FOS), xilo-oligozaharidele (XOS), β-glucanul, lactoza și derivații săi, polidextroza, palatinoza, α-ciclodextrine.

Inulina (Figura 4.) este prebioticul cel mai utilizat datorită ușurinței de procurare a acesteia în ceea ce privește costul și sursele. Aceasta se găsește sub mai multe forme, anume inulină, oligofructoză și fructo-oligozaharide (FOS). Inulina și diferitele sale forme se găsesc într-o varietate mare de plante. Din punct de vedere chimic, inulinele sunt un grup de oligozaharide ce prezintă drept unitate funcțională fructoza, fiind astfel denumite și fructani. Unitățile de fructoză sunt legate glicozidic β-(2-1), având o moleculă terminală de glucoză (Samanta și colab., 2013).

Inulinele se găsesc, în general, la nivelul rădăcinilor și rizomilor și sunt utilizate pentru stocarea energiei. Anumite plante, care sintetizează și acumulează inulina, nu mai sunt capabile să depoziteze și alți carbohidrați de acest tip, de exemplu amidoanele (Samanta și colab., 2013).

Figura 4. Structura chimică a inulinei (André și colab., 1996).

Alături de palatinoză (Figura 5.) și α-ciclodextrine (Figura 6.), inulina este recunoscută drept un aditiv alimentar sigur (GRAS). Palatinoza este un zahar reducător alcătuit din fragmente de glucoză și fructoză legate glicozidic α-(1-6). Comercial, palatinoza este obținută din unități de sucroză prin rearanjarea enzimatică a legăturilor glicozidice. Ciclodextrinele (CD) sunt oligozaharide circulare alcătuite din resturi de glucoză legate glicozidic α-(1-4). Partea hidrofilică a inelului este dispusă la suprafață, în timp ce partea hidrofobică este dispusă la interior (Pranckute și colab., 2014).

Figura 5. Structura chimică a palatinozei (Zhang și colab., 2003).

Aceste prebiotice (inulina, palatinoza și CD), prin acțiunea lor, ajută la îmbunătățirea sănătății. Astfel, ele pot stimula sistemul imunitar prin reducerea patogenilor de tipul Bacillus sp, E. coli, Campylobacter jejuni, Salmonella enteridis. De asemenea, reduc riscul apariției cancerului de colon, dar și cantitățile de trigliceride, acizi grași și colesterol din sânge, prevenind astfel bolile cardiovasculare, scade riscul la obezitate și diabet de tip II (Pranckute și colab., 2014).

Figura 6. Structura chimică a α-ciclodextrinelor (pubchem database).

Xilo-oligozaharidele (Figura 7.), denumite și XOS, sunt alcătuite din unități de xiloză legate glicozidic β-(1-4). Datorită configurației-β aceste nu sunt degradate de enzimele digestive și ajung la nivelul intestinului intacte, funcționând ca substrat pentru microbiota endogenă (Christophersen și colab., 2013). Acestea se obțin prin hidroliza enzimatică a xilanului, component major al hemicelulozei din plante. În anumite cazuri, prezintă substituenți precum acizi uronici, grupări acetil și resturi de arabinoză. În urma studiilor in vitro și in vivo efectuate asupra animalelor și omului s-a constatat ca XOS prezintă proprietăți bifidogene. Acestea reduc nivelul glucozei, al colesterolului total și LDL la pacienți cu diabet de tip II, dar prezintă și activitate antimicrobiană și imunomodulatoare (Corzo și colab., 2015).

Figura 7. Structura chimică a xilo-oligozagaridelor/XOS (Aachary și Prapulla, 2010).

Lactoza (Figura 8.) este principalul glucid din lapte. Acest dizaharid este format dintr-o moleculă de galactoză și una de glucoză. Lactoza nedigerată, folosită ca prebiotic, crește conținutul de apă din scaun și reduce timpul de tranzit la subiecții constipați. Mai mult, aceasta acționează ca substrat pentru flora intestinală, sporește activitățile zaharolitice și favorizează ceșterea bifidobacteriilor și lactobacilillor (Schaafsma, 2008).

Figura 8. Structura chimică a lactozei (Hirotsu și Shimada, 1974).

Lactosucroza (Figura 9) este un trizaharid format din D-galactoză, D-glucoză și D-fructoză. Aceasta este produsă sub acțiunea enzimelor β-fructofuranozidază sau levansucrază, care transferă restul galactozil de la lactoză la sucroză. Lactosucroza nu este digerată și favorizează, la nivelul intestinului, dezvoltarea bacteriilor din genul Bifidobacterium (Lifran și colab., 2009).

Figura 9. Structura chimică a lactosucrozei (Lifran și colab., 2009).

Lactuloza (Figura 10) și lactitolul (Figura 11) sunt derivați sintetici ai lactozei. Lactuloza se obține prin izomerizarea lactozei catalizată de hidroxidul de sodiu sau acidul boric, iar într-o cantitate mică aceasta se formează în produsele lactate tratate termic (Lifran și colab., 2009), iar lactitolul rezultă din hidrogenarea lactozei. Acești doi derivați se utilizează în encefalopatia hepatică și constipația cronică. Lactuloza și lactitolul trec nedigerați în intestinul subțire unde sunt fermentați de coloniile din floră. La nivelul intestinului subțire cei doi derivați cresc capacitatea de absorbție a calciului și magneziului, de asemenea, reduc formarea amoniacului de către flora intestinală (Schaafsma, 2008).

Figura 10. Structura chimică a lactulozei (Díez-Municio și colab., 2014).

Figura 11. Structura chimică a lactitolului (Pubchem database).

Sinbioticele au fost definite ca ”un amestec de probiotice și prebiotice, care au efecte benefice asupra gazdei precum îmbunătățirea supraviețuirii și activarea metabolismului anumitor bacterii de la nivelul intestinului”. Datorită faptului că termenul de sinbiotic trimite la noțiunea de sinergism, acesta ar trebui utilizat pentru produsele, în care compusul prebiotic favorizează, în mod selectiv, compusul probiotic (Jürgen și de Vrese, 2001).

Astfel la nivelul intestinului gros, prin acțiunea sinergică, prebioticele sunt scindate de probiotice la omega acizi grași, care stabilizează bariera intestinală. De asemenea, acestea conduc la o creștere a masei scaunului, reduc presiunea la nivelul intestinului gros și au un efect trofic pozitiv prin creșterea sintezei ADN a enterocitelor și a capacității de absorbție (Sapidis și colab., 2014).

De asemenea, LAB produc componente antimicrobiene precum peroxid de hidrogen, dioxid de carbon, diacetil, acetaldehidă, izomeri dextrogiri ai aminoacizilor, reuterină și bacteriocine. Bacteriocinele sunt peptide antimicrobiene ribozomale sintetizate, care acționează ȋmpotriva altor bacterii, fie din aceeași specie (spectru ȋngust), fie din alt gen de bacterii (spectru larg). Ȋn ultimii ani, bacteriocinele produse de LAB au atras atenția datorită potențialului lor de a fi folosiți ȋn condiții de siguranță ca aditivi pentru conservarea alimentelor (Phumhkachorn și Rattanachaikunsopon, 2010).

Activitatea antimicrobiană a bacteriilor lactice

Bacteriile lactice sunt microorganisme industriale importante, ce sunt recunoscute pentru abilitatea lor fermentativă, pentru beneficiile nutriționale și ȋn sănătate (Gilliland, 1990). Aceste microorganisme au fost izolate din plante, grăunțe, produse lactate și carne, legume fermentate și din suprafața mucoaselor animalelor (Lindgren și Dobrogosz, 1990). LAB au fost utilizate pentru a ȋntȃrzia procesul de alterare și ȋn conservarea alimentelor prin fermentație naturală, dar prezintă, ȋnsă, și aplicații comerciale ca și culturi starter ȋn diferite industrii precum cea a produselor lactate, de panificație, alimentară și cea a băuturilor alcoolice (Phumhkachorn și Rattanachaikunsopon, 2010).

Bacteriile lactice produc diferite componente cu activitate antimicrobiană precum acizi organici (lactic, acetic, propionic), diacetil, peroxid de hidrogen și bacteriocine sau proteine bactericide ȋn cursul fermentației (Lindgren și Dobrogosz, 1990), acetaldehidă. Aceste componente sunt utilizate nu doar pentru efectul lor asupra gustului mȃncării, al mirosului, culorii și texturii, dar și pentru potențialul de a inhiba microorganisme patogene (Figura 12) (Phumhkachorn și Rattanachaikunsopon, 2010).

Figura 12. Aplicații ale componentelor antimicrobiene produse de LAB ( deVuyst și Leroy , 2007).

Acțiunea/ capacitatea de conservare a culturii starter se datorează acțiunii cumulate a mai multor metaboliți antimicrobieni produși ȋn urma fermentației, ce include mai multe tipuri de acizi organici precum cel lactic, acetic și propionic Aceștia conferă un mediu acid nefavorabil creșterii mai multor patogeni și a microorganismelor care produc alterări. Efectul antimicrobian al acizilor organici este corelat cu implicarea acestora în dereglarea potențialului de membrană prin inhibarea transportului activ, reducerea pH-ului intracelular și inhibarea diferitelor funcții metabolice. Un asemenea exemplu este acidul propionic produs de bacteriile propionice, care constituie baza unor produse bioconservative care au acțiunie antimicrobiană împotriva microorganismelor inclusiv drojdii și mucegaiuri. În America, acidul propionic produs de Propionibacterium freudenreichii subsp. Shermanii este utilizat în fabricarea a aproximativ 30% din totalul de brânzeturi. În afară de acizi, culturile starter pot produce o gamă de alți produși antimicrobieni precum etanolul din calea heterofermentativă, peroxidul de hidrogen produs în timpul creșterii aerobe și diacetilul produs în urma excesului de piruvat provenit din citrat (Phumhkachorn și Rattanachaikunsopon, 2010).

Peroxidul de hidrogen (H2O2) poate avea un efect oxidant puternic asupra lipidelor membranare și proteinelor celulare și este produs în urma utilizării enzimelor precum cele flavonice oxidoreducătoare, NADH peroxidaze, NADH oxidaze și α-glicerofosfat oxidaze. Aceste componente antimicrobiene conferă un obstacol suplimentar microorganismelor patogene, nepermițându-le să supraviețuiască sau să prolifereze din momentul fabricării până la consumul produselor. Din moment ce orice microorganism poate produce substanțe inhibitoare, potențialul antimicrobian este definit de acțiunea colectivă a produșilor metabolici asupra microorganismelor nedorite (Phumhkachorn și Rattanachaikunsopon, 2010).

Un alt exemplu de produs metabolic cu acțiune antimicrobiană este reuterina (Figura 13) precum și antibioticul reuterociclina, ambele produse de Lactobacillus reuteri. Reuterina este un amestec echilibrat de forme monomerice, monomeri hidratați și dimeri ciclici ai β-hidroxipropionilaldehidei. Prezintă un spectru larg de activitate și inhibă fungi, protozoare și o gamă largă de bacterii Gram pozitive și Gram negative. Acest component este produs în faza staționară de creștere anaerobă a culturii în prezența unui amestec de glucoză și glicerol sau gliceraldehide (Phumhkachorn și Rattanachaikunsopon, 2010).

Reuterociclina (Figura 14.) este un antagonist încărcat negativ, foarte hidrofob, ce prezintă structura unui acid tetrameric. Acest antibiotic acționează exclusiv asupra bacteriilor Gram pozitive precum Lactobacillus sp, Bacillus subtilis, B. cereus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Listeria innocua. Inhibarea bacteriei Echerichia coli și a speciilor de Salmonella se observă în condițiile în care se produce ruperea membranei interne, inclusiv lipopolizaharidele trunchiate (LPS), la pH scăzut și concentrații mari de sare (Phumhkachorn și Rattanachaikunsopon, 2010).

Figura 13. Structura chimică a reuterinei (Pubchem database).

Figura 14. Structura chimică a reuterociclinei (Pubchem database).

Bacteriocinele cuprind o familie largă de peptide ribozomale, care prezintă activitate antibacteriană pentru tulpini înrudite (De Vuyst și Leroy, 2007), deși s-a raportat un număr tot mai mare de bacteriocine cu spectru larg de acțiune antimicrobiană. Bacteriocinele produse de LAB prezintă o toleranță ridicată la stresul termic și sunt cunoscute pentru acțiunea lor în cadrul unei game largi de pH. De asemenea, acestea sunt fără culoare, miros sau gust (Perez și colab., 2014).

Pe parcursul descoperirii acțiunii bacteriocinelor nu s-a evidențiat nicio bacterie rezistentă la acțiunea lor. Un motiv ar fi acela că bacteriocinele au o acțiune rapidă, formând pori în membrana bacteriei țintă chiar și la concentrații mici în mediu. Acestea sunt sensibile la acțiunea enzimelor proteolitice datorită naturii lor proteice. Mai mult, fragmentele de bacteriocine nu supraviețuiesc prea mult în corpul uman sau în mediu, ceea ce minimizează oportunitatea tulpinilor țintă să interacționeze cu fragmente degadate de antibiotic. Cel mai important avantaj al bacteriocinelor față de antibioticele convenționale este acela că sunt produși metabolici primari și nu secundari cum sunt antibioticele. Acest lucru le face maleabile în procese de biotehnologie, în care se crește fie activitatea fie specificitatea față de microorganismele țintă (Perez și colab., 2014).

Bacteriocinele au fost împărțite de către Klaenhammer (1993) în patru mari clase (tabel 15).

Tabel 15. Clasificarea bacteriocinelor (Klaenhammer, 1993)

Cercetări mai recente au dus la o reclasificare a acestora în numai doua clase (tabel 16). Această nouă clasificare a condus la denumirea bacteriocinelor din clasa III, bacteriolizine, din moment ce acestea sunt mai degrabă enzime litice decât peptide (Perez și colab., 2014).

Tabel 16. Reclasificarea bacteriocinelor (Perez și colab., 2014)

Clasa I de bacteriocine

Bacteriocinele clasei I sau lantibioticele sunt un grup de antibiotice peptidice de dimensiuni mici (<5kDa), la nivelul cărora se găsesc resturi de aminoacizi neobișnuit modificați post-translațional ca lantionina sau 3-metil-lantionina. Aceste resturi de aminoacizi formează legături covalente între aminoacizi, ceea ce duce la obținerea structurii caracteristice acestora, anume structură inel (Perez și colab., 2014).

Clasa II de bacteriocine

Bacteriocinele de clasa II sunt non-lantibiotice, care apar cel mai frecvent. Sunt peptide de dimensiuni mici (<10kDa), termostabile, care nu conțin lantionină. Spre deosebire de lantibiotice, acestea nu prezintă modificări post-traslaționale. Acestea pot fi împărțite în 4 subclase: clasa IIa, IIb, IIc, IId (tabel 14) (Perez și colab., 2014).

Astfel, pe lângă rolul important pe care îl au în diferite industrii precum cea alimentară, de panificație, a produselor lactate, datorită capacității fermentative pe care o manifestă prin producerea de acizi organici, bacteriile lactice sunt implicate și în sănătate. Prin producerea de componente antimicrobiene, acestea inhibă creșterea bacteriilor patogene.

Nizina (Figura 15), produsă de Lactococcus lactis, este singura bacteriocină considerată GRAS (Generally Regarded as Safe) utilizată ca aditiv sigur sau în conservarea alimentelor (Chan și colab., 1996).

Figura 15. Structura chimică a nizinei ( Chan și colab., 1996).

Partea experimentală

Materiale și metode

Izolarea și purificarea de noi tulpini de bacterii lactice

În această etapă, pentru atingerea scopului propus și anume caracterizarea microbiologică, biochimică și moleculară a unor tulpini de baterii lactice s-au prelevat probe din produse lactate tradiționale precum:

lapte fermentat, smântână, iaurt, chefir

Lactatele fermentate sunt cunoscute pentru conținutul în Ca2+, element mineral important cu multe implicații în organism: intră în structura oaselor și a dinților, rol enzimatic, neuromuscular, dar și hormonal, fiind un mesager secund intracelular. Pe lângă conținutul în Ca2+, produsele lactate prezintă și bacterii benefice tractului intestinal, unde se găsesc atât ”bacterii bune” cât și ”bacterii rele”. Astfel, consumul de produse lactate fermentate este recomandat după tratamentul cu antibiotice pentru a restabili echilibrul florei intestinale. Mai mult, în chefir se găsește și triptofan, un aminoacid esențial ce nu poate fi sintetizat de organism, având rol de precursor al serotoninei, melatoninei și vitaminei PP.

Din produsele lactate se ia 1 ml probă, care s-a omogenizat în 9 ml soluție de NaCl 0,85%. După omogenizare, se realizează diluții seriale zecimale, iar din aceste diluții se însămânțează câte 0.1 ml pe medii MRS și MRS cu CaCO3 și s-au selectat acele colonii care au prezentat o zonă clară.

Zonele clarificate din jurul coloniilor se formează datorită difuziei acidului lactic în mediu și interacției acestuia cu carbonatul de calciu, în urma careia se formează lactatul de calciu.

CH3CHOHCOOH + CaCO3 = (CH3CHOHCOO)2Ca + H2O + CO2

Mediu MRS (Man-Rogosa-Sharpe) g/l, care conține: peptonă 10.0; extract de carne 5.0; extract de drojdie 5.0; glucoză 20.0; K2HPO4 20.0; Tween 80-1 ml; citrat de amoniu dibazic 2.0; acetat de sodiu 5.0; MgSO4 X 7H2O 1.0; MnSO4 x H2O 0.5; pH=6.5 și 5.5 (De Man J.C., 1960).

Alături de cultivarea pe mediu MRS+CaCO3, prezența sau absența catalazei reprezintă teste preliminare de încadrare a tulpinilor nou izolate în genurile reprezentative ale bacteriilor lactice. Producerea de catalază se pune în evidență prin adăugarea de soluție de peroxid de hidrogen 3% peste o cultură bacteriană dezvoltată de 24h pe un mediu solid MRS. O reacție pozitivă se caracterizează prin apariția efervescenței ca urmare a oxigenului degajat, iar în cazul de față reacția specifică este cea negativă, în care nu se evidențiază efervescența

H2O2 catalaza H2O + ½ O2

Un alt test efectuat a fost testul oxidazei, care se realizează folosind benzi impregnate cu N, N, N´, N´-tetrametil-p-fenilendiamină 1%. O reacție pozitivă este aceea în care microorganismele testate formează albastru de indofenol și spunem că acestea sunt oxidazo pozitive.

După testele preliminare de determinare a apartenenței tulpinilor bacteriene obținute în cadrul grupului de bacterii lactice, se realizează o caracterizarea în ceea ce privește morfologia coloniei de bacterii prin observarea aspectului microscopic în urma obținerii unei colorații Gram cu albastru de metilen.

Identificarea și caracterizarea biochimică a tulpinilor de bacterii lactice selectate utilizând kitul API 50 CHL

Una dintre metodele rapide de identificare a microorganismelor o reprezintă kiturile de tip API, care se bazează pe determinarea caracteristicilor biochimice ale microorganismelor. Pentru identificarea tulpinilor de bacterii lactice a fost utilizat kitul API 50 CHL (bioMérieux), care conține 50 microtuburi cu diferite substraturi. Fiecare microtub prezintă două zone separate: o zona anaerobă reprezentată de zona superioară, în care are loc procesul de fermentație și cea aerobă reprezentată de zona inferioară, în care se desfașoară procesele oxidative și de asimilație. Primul microtub este reprezentat de controlul negativ, iar restul microtuburilor conțin următoarele surse de carbon în ordinea: glicerol, eritritol, D-arabinozǎ, L-arabinozǎ, riboză, D-xilozǎ, L-xilozǎ, adonitol, α-metilxilozid, galactoză, D-glucozǎ, D-fructozǎ, D-manozǎ, L-sorbozǎ, ramnozǎ, dulcitol, inozitol, mantiol, sorbitol, α-metil D-manozid, α-metil D-glucozid, N-acetilglucozaminǎ, amigdalină, arbutină, esculină, salicină, celobioză, maltoză, lactoză, melibiozǎ, sucroză, trehalozǎ, inulină, melezitozǎ, rafinoză, amidon, glicogen, xilitol, gențiobiozǎ, D-turanozǎ, D-tagatozǎ, D-fucozǎ, L-fucozǎ, D-arabitol, L-arabitol, gluconat, 2-cetogluconat și 5-cetogluconat. Mediul utilizat este un mediu standard care conține: g/l: polipeptonǎ 10, extract de drojdie 5, Tween 80 1ml, fosfat dipotasic 2, acetat de sodiu 5, citrat biamoniacal 2, sulfat de magneziu 0.2, sulfat de mangan 0.05, roșu de bromcrezol 0,17.

Cultura proaspătă (dezvoltată pe mediu MRS lichid, timp de 18h la 370C) a fost centrifugată 5 min la 6000 rpm, iar sedimentul celular resuspendat în 5 ml de mediu menționat mai sus și repartizat uniform în microtuburi. Interpretarea rezultatelor se realizează după 24h și 48h de incubare a galeriilor API la 370C pe baza virării culorii mediului de la nivelul microtuburilor.

Rezultatele obținute au fost interpretate utilizând programul informatic API web (bioMérieux).

Identificarea și caracterizarea biochimică a tulpinilor de bacterii lactice selectate utilizând sistemul Biolog.

Sistemul Biolog reprezintă un sistem de identificare mai complex decât API conținând 95 de teste de utilizare a diferitelor surse de carbon. Baza de date conține peste 2500 specii de bacterii, fungi și drojdii. Identificarea se face pe baza profilelor metabolice, softul putând recunoaște peste 4×1028 profiluri metabolice. Pentru obținerea unor rezultate bune producătorii au selectat sursele de C care pot oferi o discriminare mare între specii. În cazul sistemului Biolog reacția pozitivă se observă prin colorarea mediului de cultură la violet ca urmare a reducerii sării de tetrazoliu. Mediul utilizat pentru cultivarea bacteriilor lactice selectate în scopul identificării, utilizând sistemul Biolog, a fost BUA. După însămânțarea tulpinilor de bacterii lactice pe plăci cu BUA, acestea au fost incubate la 370C în condiții de anaerobioză timp de 24h. După dezvoltare au fost raclate câteva colonii și s-a realizat o suspensie cu turbiditatea de 65% și apoi s-au inoculat câte 100μl în fiecare godeu. Plăcile au fost incubate timp de 24h-48h la 370C în condiții anaerobe (folosind plicuri anaerobe (AnaeroGen de la firma OXOID). După 24h si respectiv 48h s-a realizat citirea automată cu ajutorul sistemul MicroLog 4.2., iar rezultatele obținute au fost comparate cu baza de date.

Izolarea și purificarea ADN genomic

Protocolul de izolare și purificare ADN genomic (Vassu, 2001) utilizat este derivat din tehnica Johnson, 1991. Acesta a fost optimizat în Laboratorul de Genetica microorganismelor din cadrul Facultății de Biologie, Universitatea din București.

Etapele de izolare și purificare ADN genomic

1.Obținerea sedimentului celular. Într-un tub Eppendorf se adaugă 3 ml cultură bacteriană, care se centrifughează 5 minute la 10.000 rpm la 4°C pentru obținerea sedimentului celular dorit.

2.Distrugerea peretelui celular. În această etapă se realizează o distrugere mecanică a peretelui celular și anume agitarea cu perle de sticlă. Astfel, sedimentul celular obținut se resuspendă în 500 µl TEG (Tris – 25 mM, EDTA – 10 Mm, glucoză – 50 mM, pH 8.0), peste care se adaugă 0,3 g perle de sticlă și se vortexează 4 minute.

3.Distrugerea membranei celulare. Având în vedere ca membrana celulară prezintă un bistrat lipidic în constituție, care este hidrofob, se utilizează un detergent și anume SDS (dodecil-sulfat-de sodiu). Astfel, se adaugă 30 µl SDS 20% și se incubează 10 minute la 37°C. Pentru anumite tulpini a fost necesar să se prelungească timpul de incubare cu 10 minute deoarece nu se produsese distrugerea membranei celulare.

4.Deproteinizare enzimatică. Îndepărtarea proteinelor citoplasmatice s-a realizat prin tratament cu proteaze nespecifice și anume proteinaza K sau pronaza E. S-a utilizat un volum de 4 µl de proteinază K de concentrație 50 µg/ml și s-a incubat la 37°C timp de o oră.

5.Deproteinizare prin precipitare proteinelor cu soluție salină. Precipitarea proteinelor s-a realizat prin adăugarea unui volum de 20 µl soluție KCl 2,5 M, urmată de o centrifugare timp de 15 minute la 14.000 rpm.

6.Deproteinizare cu solvenți organici. Pentru a realiza o extracție ADN cât mai pură se realizează și o deproteinizare cu solvenți organici, având în vedere concentrația mare de proteine. Astfel, peste supernatant se adaugă CIA (cloroform:alcool izoamilic 24:1 v/v) până la atingerea volumului de 1,5 ml în tubul Eppendorf și se amestecă timp de 5 minute la temperatura camerei prin inversarea energică a tubului, urmată de o centrifugare timp de 10 minute la 10.000 rpm, pentru o separare rapidă a celor două lichide.

7.Îndepărtarea moleculelor de ARN. În vederea îndepărtării moleculelor de ARN s-a efectuat un tratament cu RNază A de concentrație 100 µg/ml, timp de o oră la 37°C. Apoi lizatul celular a fost tratat cu un amestec de cloroform:alcool izoamilic (CIA 24:1 v/v) și centrifugat timp de 10 minute la 10.000 rpm.

8.Precipitarea acizilor nucleici. Precipitarea acizilor nucleici s-a realizat prin adăugarea peste supernatant a izopropanolului până la atingerea unui volum de 1 ml în tubul Eppendorf, urmată de o centrifugare timp de 15 minute la 14.000 rpm.

9.Uscarea sedimentului ADN. După îndepărtarea supernatantului, tuburile cu sediment se lasă la uscat sub hotă sau sub baie de apă 20 – 30 minute cu capacele ridicate pentru a se evapora alcoolul rămas, care ar dăuna moleculelor de ADN.

10.Hidratarea sedimentului de ADN. După uscarea completă a sedimentului, acesta se resuspendă în 20 µl tampon TE (Tris – 10 mM, EDTA – 1 mM, pH 8.0). Tuburile se țin aproximativ 10h la 4°C pentru a se realiza o dizolvare completă a ADN în tampon, apoi se stochează la – 20°C.

Verificarea purității și determinarea concentrației probelor de ADN

Verificarea purității probelor de ADN s-a realizat prin metode spectrofotometrice, utilizând un spectrofotometru UV-VIS ULTROSPEC 3000 la care s-a citit absorbanța probelor într-un domeniu de undă cuprins între 200 – 350 nm și s-au realizat rapoartele A260/A280, A260/A230, în vederea determinării unei contaminări cu proteine, ARN sau polizaharide. Concentrația probelor a fost determinată prin folosirea corelației:

A260 = 1 corespunde la o concentrație de 50 µg ADN d.c./ml

Separarea moleculelor de ADN prin electroforeză

Electroforeza în gel de agaroză reprezintă metoda standard de analiză a acizilor nucleici. Deplasarea acizilor nucleici se face în prezența unui câmp electric. Migrarea acestora se realizează de la catod spre anod deoarece acizii nucleici sunt încărcați negativ datorită prezenței grupărilor fosfat.

Migrarea electroforetică s-a realizat într-un gel de agaroză de concentrație 0,8%, utilizând un tampon de electroforeză TBE 1X (Tris 0,089 M, acid boric 0,089 M, EDTA 0.002 M, pH 8.0 – 8.5) (Vassu, 2001).

Verificarea activității antimicrobiene

Tulpinile de bacterii lactice nou izolate notate P8, P35 și P126 au fost testate în vederea determinării activității antimicrobiene față de tulpinile microbiene patogene E.coli ATCC și Bacillus cereus ATCC.

Într-o primă etapă, bateriile lactice au fost cultivate pe un mediu MRS lichid timp de 18h la 37°C. Ulterior, acestea au fost centrifugate timp de 3 minute la 12.000 rpm, iar în supernatantul obținut s-a adăugat NaOH 40% pentru a-i ajusta pH-ul la 6,5. La această valoare a pH-ului, activitatea antimicrobiană a acizilor organici este inactivată. După neutralizarea acizilor organici, se testează activitatea antimicrobină a tulpinilor din studiu față de tulpinile patogene prin metoda difuzimetrică (de Vuyst și colab., 1994).

În ceea ce privește tulpinile patogene, acestea au fost cultivate pe mediu BHI (Brain Heart Infusion) timp de 18h la 37°C până la atingerea unei DO600nm de 0,5. Ulterior, acestea au fost însămânțate cu ajutorul unui bețișor steril pe plăci cu mediu BHI solid. Plăcile au fost lăsate la uscat, apoi au fost adăugați câte 10 µl supernatant de baterii lactice sub formă de spot și incubate timp de 24 – 48h la 37°C. O reacție pozitivă se observă dacă, după incubare, în jurul spotului de bacterii lactice se formează o zonă de inhibiție.

Rezultate și discuții

În studiile efectuate de izolare de noi tulpini de bacterii lactice au fost izolate, inițial, 10 tulpini, dar comparându-le cu tulpina de referință, Lactobacillus plantarum ATCC 8014, doar trei dintre cele 10 au prezentat caracteristicile genului Lactobacillus. Astfel, în ceea ce privește aspectul macroscopic, bacteriile lactice se dezvoltă sub formă de colonii rotunde, lucioase, de culoare alb-crem care, în urma însămânțării pe un mediu MRS cu carbonat de calciu formează zone clare (Figura 16), iar din punct de vedere al aspectului microscopic sunt celule sub formă de cocobacili sau bacili în lanțuri (Figura 17).

Pentru izolarea și selectarea tulpinilor, ce prezintă morfologia coloniei specifică bacteriilor lactice, s-a folosit metoda diluțiilor seriale zecimale și apoi dispersia acestora pe mediu MRS. Următorul pas a fost acela de însămânțare pe mediu MRS cu carbonat de calciu pentru a stabili dacă tulpinile selectate au capacitatea de a biosintetiza acizi organici (formarea zonei clare). În cele din urmă au fost selecționate coloniile ce prezentau următoarele caracteristici: colonii de culoare alb-crem, cu aspect bombat și rotund, lucioase, care în urma cultivării pe mediu MRS cu carbonat de calciu formează o zonă clară în jurul coloniilor (Figura 16).

Pentru a se evidenția aspectul microscopic s-a efectual o colorație Gram (Figura 17), care împreună cu testul catalazei și cel al oxidazei au constituit teste preliminare de selecție a tulpinilor ce aparțin grupului de bacterii lactice. În ceea ce privește activitatea catalazică, care se evaluează prin adăugarea unei soluții de peroxid de hidrogen 3% peste cultura bacteriană, tulpinile testate nu au evidențiat efervescența caracteristică unei reacții pozitive, iar prin efectuarea testului oxidazei, tulpinile în studiu nu au format albastru de indofenol. În urma efectuării acestor teste preliminare s-a ajuns la concluzia ca cele 3 tulpini nou izolate sunt Gram pozitive și catalazo-oxidazo-negative.

În colncluzie, tulpinile noi izolate sau fost identificate preliminar ca aparținând genului Lactobacillus.

În cazul folosirii kitului API 50 CHL am urmărit cum substratul (reprezentat de cele 49 surse de carbon) este metabolizat prin diferite căi metabolice și anume:

► asimilație – al cărui indiciu îl reprezintă creșterea microorganismului, acest lucru evidențiindu-se prin apariția turbidității;

► oxidare – al cărui indiciu îl reprezintă virarea culorii în partea superioară a microtubului, fapt care se datorează producerii de acid în condiții de aerobioză;

► fermentație – al cărui indiciu îl reprezintă virarea culorii în partea inferioară a microtubului, datorită producerii de acid în condiții de anaerobioză.

Figura 18. Profilul biochimic al bacteriilor lactice testate, utilizând kitul API 50 CHL.

Astfel, în figura 18 sunt prezentate profilele metabolice ale tulpinilor de bacterii lactice testate, anume Lb. plantarum ATCC 8014, P8, P35 și P126.

Cu ajutorul softului API Web am putut compara și interpreta rezultatele obținute. Astfel, tulpinile analizate au prezentat variații în ceea ce privește capacitatea de a metaboliza diferitele surse de carbon. Sursele cele mai accesibile au fost: D-xilaza, glucoza, fructoza, manoza, sorboza, sorbitol, α-metil D-manozid, amigdalina, lactoza, melibioza, inulina, rafinoza, D-lixoza. Nici una din tulpini nu a metabolizat următoarele surse de carbon: glicerol, eritritol, D-arabinozǎ, galactoza, inozitol, mantiol, sucroza, trehaloza, amidon, L-fucoza, gluconat, 2-cetogluconat și 5-cetogluconat.

În urma realizării testului API, folosind kitul API 50 CHL, prin care s-au evaluat tulpinile selectate la nivel de metabolism, putem vedea faptul că tulpinile din studiu prezintă similarități de metabolizare a carbohidraților cu specia de referință și anume Lactobacillus plantarum ATCC 8014, ceea ce demostrează că acestea aparțin genului bacterian Lactobacillus.

Prin efectuarea testului Biolog realizat cu ajutorul sistemului Biolog (figura 19), tulpinile de bacterii lactice analizate au putut fi încadrate preliminar ca aparținând speciei Lactobacillus plantarum.

Figura 19. Profilul biochimic al tulpinilor de bacterii lactice testate (Lb. plantarum ATCC 8014, P8, P35, P126), utilizând sistemul Biolog.

Pentru o încadrare cât mai acurată a tulpinilor de bacterii lactice izolate din produse tradiționale românești, acestea trebuie caracterizate și la nivel molecular, și de aceea am început cu un protocol de izolare a ADN genomic, desfășurat în cadrul Departamentului de Genetică.

Pentru identificarea de la nivel molecular s-a realizat o izolare de ADN cromozomal, urmărind protocolul optimizat anterior. Spre deosebire de tehnica Johnson, protocolul utilizat în izolarea ADN din bacterii lactice prezintă anumite modificări, anume:

distrugerea membranei celulare prin agitare cu perle de sticlă

mărirea timpului de incubare

În pasul următor s-a realizat analiza spetrofotometrică a ADN obținut și electroforetică. Analiza spectrofotometrică s-a realizat într-un domeniu de undă cuprins între 200 nm și 350 nm și a permis obținerea spectrelor de absorbție și estimarea purității și concentrației probelor de ADN. Prin rezultatele obținute în urma examinării spectrofotometrice s-a putut evalua rapoartele de puritate A260/A230, A260/A280 și concentrația de ADN (tabel 17.).

Tabel 17. Valorile rapoartelor A260/A230, A260/A280 și concentrația ADN

Urmărind datele din tabelul 1 se poate observa faptul că extractele de ADN prezintă un grad minim de impurificare cu proteine, raportul A260/A280 variind între 1.853 și 1.991. În ceea ce privește raportul A260/A230 s-a evidențiat lipsa impurificării probelor ADN cu polizaharide printr-o valoare a acestuia mai mare decât 2, iar concentrația de ADN din probele analizate a fost cuprinsă între 3.18 și 6.86 µg/µl.

În urma obținerii acestor rezultate se poate confirma eficiența protocolului de izolare a ADN cromozomal prin faptul că probele prezintă un grad minim de impurificare și o concentrație optimă, ceea ce va oferi siguranța efectuării cu succes a analizelor ulterioare.

Analiza profilului electroforetic în gel de agaroză (figura 20) a probelor analizate confirmă faptul că acestea nu prezintă împurificare cu ARN și nici fragmentarea ADN cromozomal în timpul proceselor de izolare și purificare.

Figura 20. Electroforeză în gel de agaroză pentru extracția ADN cromozomal din tulpinile analizate: 1- Lb. plantarum, 2- P8, 3-P35 și 4-P126.

În acest studiu s-a realizat și verificarea activității antimicrobiene a tulpinilor nou izolate de bacterii lactice. Astfel, în urma testului difuzimetric (figura 21-22), după încubarea peste noapte, în jurul spoturilor de tulpini bacteriene lactice, în studiul de față fiind vorba de Lb. plantarum ATCC 8014, P8, P35 și P126, s-a format haloul specific reacției pozitive.

Având în vedere că în urma incubării peste noapte tulpinile au dezvoltat halou în jurul spotului putem afirma că acestea prezintă activitate antimicrobiană prin producerea de compuși antimicrobieni în mediul de cultură, care au inhibat creșterea bacteriilor patogene.

Concluzii

Datorită importanței practice pe care o au bacteriile lactice, acestea fiind utilizate din ce în ce mai mult în diferite industrii precum cea a produselor lactate, farmaceutică, alimentară și nu numai, scopul acestei lucrării a fost acela de a identifica noi tulpini de bacterii lactice prin diferite metode, pe baza diferitelor caracteristici și de a le testa potențialul antibacterian.

În acest studiu au fost testate 10 tulpini bacteriene izolate din produse tradiționale lactate fermentate, însă numai 3 dintre acestea au putut fi încadrare în grupul bacteriilor lactice.

Tulpinile nou izolate și anume P8, P35 și P126 au fost identificate ca aparținând genului Lactobacillus, utilizând ca specie de referință Lactobacillus plantarum ATCC 8014. Inițial, s-a realizat o selecție a coloniilor ce prezentau aspectul caracteristic bacteriilor lactice, urmată de un studiu microscopic al celulelor din coloniile selectate. Următorul pas a fost acela de efectuare a unor teste preliminare de identificare precum cultivarea pe mediu MRS+CaCO3, testatea activității catalazice și oxidazice. Pentru o identificare cât mai precisă s-au efectuat și teste biochimice prin utilizarea kitului API 50 CHL și efectuarea testului Biolog, ce urmăresc metabolizarea mai multor tipuri de carbohidrați.

Ulterior, s-a efectuat izolarea ADN genomic al bacteriilor ce au trecut de testele preliminare și biochimice. Extracția ADN genomic este primul pas în studierea la nivel molecular a tulpinilor de bacterii lactice deja izolate prin metode clasice, identificarea la nivel molecular având o precizie mult mai mare de diferențiere a tulpinilor.

După efectuarea testelor de identificare taxonomică s-a realizat și un test de verificare a activității antimicrobiene și anume testul difuzimetric, în urma căruia s-a dovedit prezența acestui potențial prin apariția unei zone de inhibiție pe mediul inoculat cu diferite tulpini patogene. Astfel, tulpinile nou izolate au evidențiat potențial antimicrobian prin inhibarea creșterii tulpinilor patogene de Escherichia coli ATCC și Bacillus cereus ATCC.

Bibliografie

Aachary A. A. și Prapulla S.G., 2011. Xylooligosaccharides (XOS) as an emerging prebiotic: Microbial synthesis, utilisation, structural characterization, bioactive properties and applications. Compr. Rev. Food Sci. F. 10, 4.

André I., Mazeau K., Tvaroska I., Putaux J-L., Winters W.T., Taravel F.R. și Chanzy H., 1996. Molecular and crystal structures of inulin from electron diffration data. Macromolecules. 29. 4626.

Bjőkroth J., Geisen R., Schillingen U., Weiss N., De Vos P., Holzapfel W.H., Korkeala H.J. și Vandamme P., 2000. Characterization of Leuconostoc gasicomitatum sp. nov. associeted with spoiled raw tomato-marinated broiler meat strips packaged under modified atmosphere. Appl. Envirol. Microbiol. 66, 3769-3772.

Bolton E, Wang Y, Thiessen PA, Bryant SH. PubChem: Integrated Platform of Small Molecules and Biological Activities. Chapter 12 IN Wheeler RA and Spellmeyer DC, eds. Annual Reports in Computational Chemistry, Volume 4. Oxford, UK: Elsevier, 2008, pp. 217-241. doi:10.1016/S1574-1400(08)00012-1.

Borch, E. și Molin G., 1989. The aerobic growth and product formation of Lactobacillus, Leuconostoc, Brochothrix and Carnobacterium in batch cultures. Appl. Microbiol. Biotechnol. 30, 86–88.

Brooijmans, R.J., de Vos, W.M. și Hugenholtz, J., 2009. Lactobacillus plantarum WCFS1 electron transport chains. Appl. Environ. Microbiol. 11, 3583–3585.

Chan C.W., Dodd H.M., Horn N., Maclean K., Lian L.-Y., Bycroft B.W., Gasson M.J. și Roberts G.C.K., 1996. Structure-activity relationships in the peptide antibiotic nisin: Role of dehydroalanine 5. Appl. Environ. Microb. 62, 2966-2967.

Chassard C, Grattepanche F. și Lacroix C., 2011. Challenges for tailoring their efficacy. Probiotics and health claims. Kneifel W. și Salminen S. John Wiley and Sons. 49–74.

Chen, Y.S., Yanagida F. și Shinohara T., 2005. Isolation and identification of lactic acid bacteria from soil using an enrichment procedure. Lett. Appl. Microbiol. 40, 197–200.

Chew, T.A. și Smith J.M., 1992. Detection of diacetyl (caramel odor) in presumptive identification of the “Streptococcus milleri” group. J. Clin. Microbiol. 30, 3026–3029.

Cho S.L., Nam S.W., Yoon J.H., Lee J.S., Sukhoom A. și Kim W., 2008. Lactococcus chungangensis sp. nov., a lactic acid bacterium isolated from activated sludge foam. Int. J. Syst. Evol. Micr. 58, 1847–1849.

Christophersen C.T., Peterson A., Licht T.R. și Conlon M.A., 2013. Xylo-oligosaccharides and inulin affect genotoxicity and bacterial population diferently in a human colonic simulator challenged with soy protein. Nutrients. 5, 3741

Claesson, M.J., van Sinderen, D. și O’Toole, P.W., 2008. Lactobacillus phylogenomics –towards a reclassification of the genus. Int. J. Syst. Evol. Micr. 58, 2945–2954.

Collins, M.D., FarrowJ.A.E., Phillips B.A. și Kandler O., 1983. Streptococcus garvieae sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 36, 9–12.

Corzo N., Alonso J.L., Azpiroz F., Calvo M.A., Cirici M., Leis R., Lombo F., Aparicio M.I., Plou F.J., Madiedo P.R., Rúperez P., Cuenca A.R., Sanz M.L. și Clemente A., 2015. Prebióticos:concepto, propriedades y efectos beneficiosos. Nutr. Hosp. 31, 104-106.

De Bruyne K., Franz C.M.A.P., Vancanneyt M., Schillinger U., Mozzi F., Font de Valdez G., de Vuyst L. și Vandamme P., 2008. Pediococcus argentinicus sp. nov. from Argentinean fermented wheat flour and identification of Pediococcus species by pheS, rpoA and atpA sequence analysis. Int. J. Syst. Evol. Micr. 58, 2915.

De Vuyst L. și Leroy F., 2007. Bacteriocins from lactic acid bacteria: Production, purification and food applications. J. Mol. Microb. Biotech.13, 194-196.

De Vuyst L. și Vandamme E.J., 1994. Antimicrobial potential of lactic acid bacteria. Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. De Vuyst L. și Vandamme E.J. Blackie Academic and Professional. 95-100.

Derkx P.M.F., Janzen T., Sørensen K.I., Christensen J.E., Stuer-Lauridsen B. și Johansen E., 2014. The art of strain improvement of industrial lactic acid bacteria without fthe use of recombinant DNA technology. Microbial. Cell Fact.13, 1-4.

Dobson, C.M., H. Deneer, S. Lee, S. Hemmingsen, S. Glaze și B. Ziola., 2002. Phylogenetic analysis of the genus Pediococcus, including Pediococcus claussenii sp. nov., a novel lactic acid bacterium isolated from beer. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52, 2007–2010.

Ekstedt, R.D. și Stollerman G.H., 1960. Factors affecting the chain length of group A streptococci. II. Quantitative M-anti-M relationships in the long chain test. Jpn. J. Exp. Med. 112, 695–698.

El-Shafei HA, Abd-El-Sabour H, Ibrahim N. și Mostafa YA., 2000. Isolation, screening and characterization of bacteriocin-producing lactic acid bacteria isolated from traditional fermented food. Microbiol. Res.154, 321-324.

Farrow J.A.E., Facklam R.R. și Collins M.D., 1989. Nucleic acid homologies of some vancomycin-resistent leuconostocs and description of Leuconostoc citreum sp nov. and Leuconostoc pseudomesenteroides. Int. J. Syst. Bacterial. 39. 279-282.

Fortina, M.G., Ricci G., Acquati A., Zeppa G., Gandini A. și Manachini P., 2003. Genetic characterization of some lactic acid bacteria occurring in an artisanal protected denomination origin (PDO) Italian cheese, the Toma Piemontese. Food Microbiol. 20, 399–404.

Franz C.M., Vancanneyt M., Vandemeulebroecke K., De Wachter M., Cleenwerck I., Hoste B., Schillinger U., Holzapfel W.H. și Swings J., 2006. Pediococcus stilesii sp. nov., isolated from maize grains. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56, 330–333.

Fujisawa, T., Benno, Y., Yaeshima, T., and Mitsuoka, T., 1992. Taxonomic study of the Lactobacillus acidophilus group, with recognition of Lactobacillus gallinarum sp. nov. and Lactobacillus johnsonii sp. nov. and synonymy of Lactobacillus acidophilus group A3 (Johnson et al. 1980) with the type strain of Lactobacillus amylovorus (Nakamura 1981). Int. J. Syst. Bacteriol. 42, 487–491

Ghouri Y.A., Richards D.M, Rahimi E.F, Krill J.T, Jelinek K.A. și DuPont A.W., 2014. Systematic review of randomized controlled trials of probiotics, prebiotics and synbiotics in inflammatory bowel disease. Clinical Exp. Gastroenterol.7, 474.

Gibson, G. R., 2004. From probiotics to prebiotics and a healthy digestive system. J. Food Sci. 69, M142–M143.

Gilliland, S.E., 1990. Health and nutritional benefits from lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 87, 174-180.

Günther, H.L. și White H.R., 1961. The cultural and physiological characters of the pediococci. J. Gen. Microbiol. 26, 189–197.

Hardie, J.M. și Whiley, R.A., 1995. The genus Streptococcus. The Genera of Lactic Acid Bacteria. Wood, B.J.B. și Holzapfel, W.H. Vol. 2, 55–124.

Henriksen, S.D. și Henrichsen J., 1975. Twitching motility and possession of polar fimbriae in spreading Streptococcus sanguis isolates from the human throat. Acta Pathol. Mic. Sc. B 83.138–140.

Henriques-Normark, B. și Normark S., 2010. Commensal pathogens, with a focus on Streptococcus pneumoniae, and interactions with the human host. Exp. Cell Res. 316, 1410–1414.

Hirotsu K. și Shimada A., 1874-1879. The crystal and molecular structure of β-lactose. B. Agr. Chem. Soc. Japan. 47, 1872.

Holzapfel W.H., Franz C.M.A.P., Ludwig W., Back W. și Dicks L.M.T., 2006. The genera Pediococcus and Tetragenococcus. The Prokaryotes. Ediția 3. Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.H.și Stackebrandt E. Springer-Verlag. 260–266,

Ibourahema C., Dubois Dauphin R., Destain J. și Thonart Ph., 2007. Characterization of lactic acid bacteria isolated from poultry farms in Senegal. Afr. J. Biotechnol.7. 1-2.

Johansson, P., Paulin L., Vihavainen E., Salovuori N., Edward A., Björkroth K.J. și Auvinen P., 2011. Genome sequence of a food spoilage lactic acid bacterium Leuconostoc gasicomitatum LMG 18811T in association with specific spoilage reactions. Appl. Environ. Microbiol. 77. 4348–4351.

Jürgen S. și de Vrese M., 2001. Probiotics, prebiotics and synbiotics-approaching a definition. Am. J. Clin. Nutr.73. 363S.

Kawamura Y., Hou X., Sultana F., Miura H. și Ezaki T., 1995. Determination of 16S rRNA sequences of Streptococcus mitis and Streptococcus gordonii and phylogenetic relationships among members of the genus Streptococcus. Int. J. Syst. Bacteriol. 45, 406–408.

Kharras G.B., Sanchez-Riera F. și Severson D.K.., 1993. Polymers of lactic acid. Plastics from microbes. Microbial synthesis of polymers and polymer precursors. Mobley D.P. Hanser Publ. 100-112.

Kim M. și Chun J., 2005. Bacterial community structure in Kimchi, a Korean fermented vegetable food, as revealed by 16S rRNA gene analysis. Int. J. Food Microbiol. 103. 93–96.

Lahtinen S, Ouwehand A.C., Salminen S. și von Wright A., 2011. Lactic acid bacteria: Microbiological and functional aspects. Ediția aIVa. Lahtinen S, Ouwehand A.C., Salminen S. și von Wright A. CRC Press. 2-101.

Lifran E.V., Hourigan J.A. și Sleigh R.W., 2009. Lactose derivatives: turning waste into functional food. Aust. J. Dairy Technol. 64, 89-92.

Linares, D. M., Martín M., Ladero V., Alvarez M.A. și Fernández M., 2011. Biogenic amines in dairy products. Crit. Rev. Food. Sci. Nutr. 51. 691– 703.

Lindgren S.E. și Dobrogosz W.J., 1990. Antagonistic activity of lactic acid bacteria in food and feed fermentations. FEMS Microbial. Rev. 87, 149-167.

Liu L., Zhang B., Tong H. și Dong X., 2006. Pediococcus ethanolidurans sp. nov., isolated from the wall of a distilled-spirit-fermenting cellar. Int. J. Syst. Evol. Micr. 56, 2046.

Makarova K., Slesarev A., Wolf Y., Sorokin A., Mirkin B. și Koonin E., 2006. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103. 15613-15616.

Martinez F.A.C., Balciunas E.M., Salgado J.M., Domínguez-González J.M., Converti A. și de Souza Oliveira R.P., 2013. Lactic acid properties, applications and production: A review. Trends Food Sci. Tech. 30. 72-75.

Nakagawa A. și Kitahara K., 1959. Taxonomic studies on the genus Pediococcus. J. Gen. Appl. Microbial. 5. 99-108.

Ohland C.L. și MacNaughton., 2010. Probiotic bacteria and intestinal epithelial barrier function. Am J Physiol.298. G807-G810.

Ouwehand A.C. și Salminen S., 2002. Probiotics: an overview of benefical effects.. 279–89.

Paneri P.F, Christaki E. și Bonos E., 2013. Lactic acid bacteria as source of functional ingredients. Lactic acid bacteria- R & D for Food, Health and Livestock Purposes. Marcelino Kongo. InTech. 590-597

Perez R.H., Zendo T. și Sonomoto K., 2014. Novel bacteriocins from lactic acid bacteria (LAB): various structures and applications. Microbial. Cell Fact. 13, 2-4.

Phumkhachorn P. și Rattanachaikunsopon P., 2010. Lactic acid bacteria: their antimicrobial compounds and their uses in food production. Ann. Biol. Res. 1, 218-220.

Pranckute R., Kaunietis A., Kuisieǹe N. și Čitavičius D., 2014. Developement of synbiotics with inulin, palatinose, α-ciclodextrins and probiotic bacteria. Pol. J. Microbiol. 63, 33-34.

Reid G, Bruce A.W, Fraser N, Heinemann C, Owen J și Henning B., 2001.Oral Probiotics Can Resolve Urogenital Infections. FEMS Immunol. Med. Mic. 30, 48-51.

Reid G., 1999. The scientific basis for probiotic strains of Lactobacillus. Appl. Environ. Microb. 65, 3763-3768.

Rhee S. K. și Peck M.Y., 1980. Effect of environmental pH on chain length of Lactobacillus bulgaricus. J. Bacteriol. 144, 865-868.

Saarela M., 2000. Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. J. Biotechnol. 84, 97–215.

Samanta A.K., Jayapal N., Senani S., Kolte A.P. și Sridhar M., 2013. Prebiotic inulin.Useful dietary adjuncts to manipulate the livestock gut microflora. Braz J. Microbiol. 44, 4-6.

Sapidis N., Tziouvaras C., Ioannidis O., Kalaitsidou I. și Botsios D., 2014. The effect of glutamine and synbiotics on the healing of colonic anastomosis. Rev. Esp. Enferm. Dig. 106, 256.

Schaafsma G., 2008. Lactose and lactose derivatives as bioactive ingredients in human nutrition. Int. Dairy J. 18, 462-465.

Schlegel, L., Grimont F., Ageron E., Grimont P.A. și Bouvet A., 2003. Reappraisal of the taxonomy of the Streptococcus bovis/Streptococcus equinus complex and related species: Description of Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus subsp. nov., S. gallolyticus subsp. macedonicus subsp. nov. and S. gallolyticus subsp. pasteurianus subsp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53, 640–645.

Shah N.P., 2007. Functional cultures and health benefits. Int. Dairy J. 17, 1261–1277.

Sharpe M. E., Latham M. J., Garvie E. I., Zirngibl J. și Kandler O., 1973. Two new species of Lactobacillus isolated from the bovine rumen, Lactobacillus ruminis sp. nov. and Lactobacillus vitulinus sp. nov. J. Gen. Microbiol. 77, 37–49.

Shaw B.G și Harding C.D., 1989. Leuconostoc gelidum sp nov. și Leuconostoc gelidom from chill-stored meat. Int. J. Syst. Bacterial. 39, 217-220.

Shea Beasley., 2004. Isolation, identification and exploitation of lactic acid bacteria from human and animal microbiota.

Simpson, W.J. și Taguchi H., 1995. The genus Pediococcus, with notes on the genera Tetragenococcus and Aerococcus. The Genera of Lactic Acid Bacteria. Wood B.J.B și Holzapfel W.H. Blackie Academic and Professional, 140-156.

Stiles, M.E. și Holzapfel, W.H., 1997. Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. Int. J. Food Microbiol. 36, 25-29.

Tompkins, G.R. și Tagg J.R., 1987. Bacteriocin-like inhibitory activity associated with beta-hemolytic strains of Streptococcus salivarius. J. Dent. Res. 66, 1322–1325.

Van de Bunt B., Bron P.A., Sijtsma L., de Vos M. W. și Hugenholtz J., 2014. Use of non-growing Lactobacillus lactis cell suspensionsfor production of volatile metabolites with direct relevance for flavour formation during dairy fermentations. Microbial. Cell Fact. 13, 2-3.

Weiss, N., 1992. The genera Pediococcus and Aerococcus. The Prokaryotes, Ediția aIIa. Balows A., Trüper H.G., Dworkin M., Harder W. și Schleifer K.H., Springer-Verlag, 1500-1507.

Williams A.M. și Collins M.D., 1990. Molecular taxonomic studies on Streptococcus uberis types I and II. Description of Streptococcus parauberis sp. nov. J. Appl. Bacteriol. 68, 487–490.

Woltjes, J., Legdeur-Velthuis H., Eggink C.O. și de Graaff J., 1982. Beta-haemolysis and pigment production by the oral bacterium Streptococcus mutans. Arch. Oral. Biol. 27, 279–282.

Yang R., Argimon, S., Li Y., Zhou X. și Caufield P.W., 2010. Determining the genetic diversity of lactobacilli from the oral cavity. J. Microbiol. Meth. 82, 165–169.

Zhang D., Li N., Lok S.-M., Zhang L.-H. și Swaminathan K., 2003. Isomaltulose synthase (Pal I) of Klebsiella sp. LX3. J. of Biol. Chem. 278, 35429.