Analiza Modificarilor Aparute In Modul de Organizare al Lipopolizaharidelor Investigate Prin Spectroscopie de Thz Si Ftir

CUPRINS

Scopul studiului……………………………………………………… 3

Introducere……………………………………………………………

Învelișurile celulare……………………………………………

Membrana citoplasmatică……………………………………….. 5

Peretele celular………………………………………………….

Spațiul periplasmatic…………………………………………….

Membrana externă……………………………………………….

Lipopolizaharide (LPS)………………………………………

Structura lipopolizaharidelor……………………………….

Scopul studiului

Pentru modelarea moleculelor de lipopoliaharide (LPS) prin simulare moleculară, este necesară obținerea parametriilor acestora (parametrizarea) pentru câmpuri de forța uzuale (CHARMM, etc).

Moleculele de lipopolizaharide includ structuri neuzuale cum ar fi heptazaharidele, ceea ce le face dificil de parametrizat.

Lucrarea mea a contribuit la un studiu mai larg privind lipopolizaharidele care a avut ca scop obținerea și validare parametriilor câmpului de forța de simulare moleculară CHARMM (parametrizarea) pentru molecula de LPS corespunzătoare tulpinii Escherichia coli B4: O111.

În acest scop am măsurat spectrele THz a unor monostraturi din aceste molecule obținute prin evaporarea a unor soluții de LPS-cloroform-metanol în prezența sau în absența clorurii de calciu CaCl2.

Aceste spectre au permis validarea parametriilor CHARMM pentru lipopolizaharidele corespunzatoare tulpinii Escherichia coli B4: O111.

Introducere

Bacteriile Gram negative conține anumite structuri speciale care sunt alcătuite din variate complexe de lipopolizaharide (LPS) numite și endotoxine și lipoproteine.

Lipopolizaharidele (LPS) sau endotoxinele sunt substanțe toxice legate de peretele celular al bacteriilor Gram negative, sub forma unui complex macromolecular compus din lipide, polizaharide si proteine. Sunt eliberate din mediu numai după dezintegrarea bacteriilor sau după liza lor.

Extrase inițial Centanni (1883) care le-a numit pirotoxine au fost denumite ulterior antigene Boivin, pirogeni, lipopolizaharide bacteriene, complexe endotoxice.

Sunt produse de o mare varietate de bacterii, Enterobacteriaceae, Proteus, Pseudomona. Endotoxina a fost izolată inițial prin extracție cu acid tricloracetic de Boivin si Mesrobeanu (1935). S-a demonstrat ca este un complex glucido-lipido-polipeptidic, care induce la animale simptome asemănătoare infecțiilor naturale.

Luderity si Westphal (1952) au realizat extractia cu amestecul fenol/apă la cald. Complexul endotoxic a fost izolat din soluția apoasă, după răcire, sub forma unui complex lipopolizaharidic macromolecular.

S-a demonstrat că proporția de lipide și polizaharide variază de la o specie la alta și chiar la tulpinile aceleași specii.

Shands, Graham și Nath (1967) au demonstrat că lipopolizaharidul derivat din tulpinile S de Salmonella typhimurium după extracție prin tehnica fenol/apă și colorate cu acetat de uranil apare la microscopul electronic sub forma unor panglici cu structura trilaminară, două straturi fine, dense, electronopace, delimitează o regiune centrală clară.

2.1 Invelisurile celulare. Membrana citoplasmatica.

Membrana citoplasmatică mai este denumită și membrana celulara în alcătuirea careia intră fosfolipide și proteine, aceasta fiind structura care mărginește citoplasma separând-o de peretele celular.

Pentru bacteriile Gram negative structura este mai complexă, membrana citoplasmatică care mai poartă numele și de membrană internă, urmând un singur strat de peptidoglican, membrană externă și la exterior capsulă. Între membrana internă și cea externă se gasește spațiul periplasmatic.

Membrana internă este formată dintr-un bistrat fosfolipidic care regleaza transportul transmembranar în peretele bacterian.

Peretele celular

Peretele celular este o structură rigidă care asigură menținerea formei celulei bacteriene. Straturile din învelisul celular situate între membrana citoplasmatică (internă) și capsulă sunt denumite “perete celular”(Bîlbîe V., et al., 1985).

La bacteriile Gram pozitive peretele celular este constituit din peptidoglican și acizi teichoici, iar la bacteriile Gram negative constă din peptidoglican, lipoproteină, membrană externă și stratul lipopolizaharidic.

Peretele bacterian al bacteriilor Gram negative conține un element suplimentar, membrana externa care învelește peptidoglicanul. Peretele acestor bacterii este mult mai fin și mai complex. De la exterior spre interior, se disting succesiv membrana externă, peptidoglicanul care este mult mai subțire decât la bacteriile Gram pozitive (2,5 nm), spațiul periplasmatic și membrana citoplasmatică (Dorobăț O.M., 2006.)

Structura peretelui bacteriilor Gram pozitive si Gram negative (Jehl F., et al., 2003)

Spatiul periplasmatic

Spațiul periplasmatic reprezintă spațiul situat între membrana internă (citoplasmatică) și membrana externă. În spațiul periplamatic se găsesc: un strat subțire de peptidoglican, părțile proteice ale unor molecule de lipoproteine legate covalent de peptidoglican, enzime și pigmenți. Membrana internă este formată dintr-un bistrat fosfolipidic care regleaza transportul transmembranar în peretele bacterian.

În fiziologia bacteriilor Gram negative, elementul foarte important îl reprezintă membrana externă, fiind structura de rezistență la factorii de aparare ai gazdei (Duca E. et al., 1979).

Membrana externa

Membrana externă care se gasește doar la bacteriile Gram negative conține fosfolipide, proteine și lipopolizaharide. Doua dintre proteine fac legatura cu peptidoglicanul, o lipoproteină care are partea lipidica în stratul intern al membranei externe și partea proteică în spațiul periplasmatic legată covalent de peptidoglican și proteina matrice cu masa moleculară mare care rămâne atașată de peptidoglican și după îndepărtarea fosfolipidelor. Doua straturi de molecule lipidice cu lanțurile hidrofobe fața în fața, cele hidrofile distal, sunt dublate cu molecule proteice hidrofile, realizând pe secțiune aspectul tristratificat (Jakubs K. et al., 2011).

Toate proteinele cu excepția lipoproteinelor au o porțiune expusă la suprafața exterioară a membranei externe. În comparație cu membrana citoplasmatică, conținutul în proteine al membranei externe este mai mare aproximativ 40% din masă totală (Dorobăț O.M., 2006.)

Raporturile macromoleculelor componente ale peretelui celular (Todar, 2004).

Lipopolizaharide (LPS). Structura.

Cele mai multe date se referă la lipopolizaharide (LPS) izolate din Enterobacteriaceae în structura cărora au fost descrise trei regiuni distincte chimic, biologic și genetic:

– catena specifică laterală O;

– regiunea centrală (core) oligozaharidică ;

– lipidul A reprezinta partea hidrofoba.

Catena specifica O este un heteropolizharid, care poartă determinanții antigenici de specie, răspunzători pentru specificitatea anticorpilor produși în cursul imunizării omului și animalelor cu bacterii vii sau omorâte sau cu extracte polizharidice.

Antigenul polizaharidic somatic este numit antigenul O și poartă în structura mai mulți determinanți antigenici O sau factori O. Pe baza lor Kauffmann (1957) a întocmit o schemă de clasificare serologică a genului Salmonella.

Lipopolizaharidul (LPS) bacteriilor Gram negative este alcătuit dintr-un lipid A, reprezentând partea hidrofobă, care se gasește în membrana citoplasmatică și un polizaharid situat la suprafața membranei. Polizaharidul este constituit dintr-o parte centrală (core) atașata lipidului A și o serie de unități polizaharidice repetitive terminale.

Aceasta poartă specificitațile antigenice O ale bacteriilor din care provine. Specificitatea antigenica derivă din natura glucidelor terminale.

Structura chimică a polizaharidului O a sugerat existența unor unitați oligozaharidice repetitive formate din mai multe resturi monozaharidice. Specificitatea polizaharidelor O rezidă în natura oligozaharidelor, în modul lor de legare etc. Modificări minime ca, de exemplu, acetilarea sau deacetilarea glucozei, datorită prezenței sau deficitului unei enzime bacteriene specifice poate determina apariția sau dispariția unui factor serologic specific. Din aceasta decurge o mare diversitate structurală și antigenică a catenei specifice O.

Regiunea oligozaharidică centrală (core region) este un heterozaharid care poate fi subdivizat în raport cu lipidul A, într-o regiune internă proximală și o regiune distală externă.

Regiune internă (proximală) este formată din două glucide neobișnuite și anume din heptoză, în principal în configurația L-glicero-D-mano sau D-glicero-D-mano și acid 2-keto-3-deoxi-D-mano-octonic (KDO).

Regiunea distală este alcătuită din glucide prezente obișnuit, ca de exemplu, D-glucoza, D-galactoza și N-acetil-D-glucozaamină.

Variabilitatea structiurală a regiunii oligozaharidice centrale este foarte limitată comparativ cu cea a catenei specifice O.

Lipidul A este partea cea mai conservată a lipopolizaharidului. Structura sa de bază formată dintr-un schelet hidrofil și patru moli de acizi grași 3-hidroxi, cuprinzând cel puțin două resturi aciloxiacil, este prezentă în toate lipopolizaharidele cu activități endotoxice.

Diferențele privesc:

numărul atomilor de carbon în lanțurile hidrocarbonate;

distribuția și tipul resturilor aciloxiacil;

substituția adițională a resturilor fosfat.

Dizaharidul glucozamină-bifosforilată, numit scheletul hidrofil al lipidului A este substituit în pozițiile 2,2’3 și 3’ cu 4 moli echivalenți de acid (R)-3-hidroximiristic, în legături amidă și ester. Grupările hidroxil aparținând resturilor acil ale glucozaminei nereducătoare sunt esterificate în pozițiile 2 și 3 cu acid lauric și respectiv miristic. Resturile aciloxiacil sunt markeri structurali tipici ai lipopolizaharidelor și par să fie asociate cu anumite activități biologice.

Lipidul A sintetizat chimic sau izolat prin hidroliză acidă din lipopolizaharide nu interacționează cu sistemele biologice și este netoxic. El este biodisponibil prin solubilizarea în apă și biologic activ prin complexarea cu purtători de natură proteică sau cu dextran, ca o precondiție a exprimării activității endotoxice.

Lipidul A activează complementul, granulocitele, macrofagele și activitatea procoagulantă, este mitogen pentru limfocitele B și induce sinteza și eliberarea în organism a unui număr important de mediatori chimici ca:

interleukina-1 (IL-1);

interferonii;

prostaglandinele;

Factorul necrozant al tumorilor este un mediator central al evenimentelor endotoxice.

Au fost decelate: un spectru larg de activități biologice, începând cu pirogenitatea pentru om și iepure, toxicitatea letală, unele dăunătoare gazdei. El are și unele acțiuni cu efect benefic, decurgând din inducția unei rezistențe nespecifice la infecție, necroza tumorilor, inducerea toleranței la endotoxine, efectul adjuvant în imunizarea cu antigene bacteriene.

Deși endotoxinele au fost studiate foarte mult în ultimii ani, unele aspecte sunt încă nelămurite sau doar ipotetice.

Astfel unele din efectele benefice descrise ar putea reflecta actvități fiziologice ale endotoxinelor eliberate permanent în doze extrem de mici de bacteriile Gram negative din microbiota normală intestinală, în timp ce efectele dăunătoare sunt rezultatul producției de endotoxina în exces, având drept consecință dereglarea unor funcții de receptor natural, fiziologic. De altfel, nu se știe dacă unele din fenomenele toxice descrise sunt produse de endotoxină, de lipidul A sau de produșii toxici obținuți in vivo prin modificarea lor ca rezultat al interacțiunilor specifice cu factorii din ser.

Un rol important revine macrofagelor activate de lipopolizaharide. Ele produc metaboliți pe calea acidului arahidonic, factori cu rol esențial în șocul endotoxic.

Lipidul A este legat covalent de oligozaharidul regiunii centrale R prin catenele acizilor grasi. Molecula LPS este orientată încat polizaharidul O se proiecteaza la exterior și determină specificitatea antigenică a celulei bacteriene.

LPS este toxic și se eliberează numai prin liza celulei, fiind denumit endotoxină. Toxicitatea LPS se datorează lipidului A, iar polizaharidele reprezinta antigenul major de suprafată denumit antigen O.

Componenta lipidica conferă moleculei LPS calitatea de toxină și sunt responsabile de “șocul endotoxic” în cazul infecțiilor cu Gram-negativi.

La Escherichia coli și la majoritatea bacteriilor Gram negative doar prezența lipidului A (inclusiv a celor 2 glucide KDO) este necesar pentru supraviețuirea bacteriilor. Astfel îndepartarea ( prin metode enzimatice etc) a antigenului O sau a nucleului oligozaharidic nu afectează viabilitatea acestor bacterii. Lipidul A are proprietăți endotoxice, puse în evidență la mutantele R care sintetizează LPS incomplet și la care lipsește polizaharidul O și alte componente ale oligozaharidului părții intermediare R.

Endotoxina este prezentă la orice tulpina și se eliberează în cantități mari în mucoase infectate în care bacteria se suprainmulțește, în sange și în alte țesuturi, putând genera fenomene locale și sistemice descrise pentru toate endotoxinele indiferent de bacteria producătoare.

Bacteriilor sintetizează polizaharidul O formând colonii S, iar cele care nu sintetizează polizaharidul O formează colonii R, aceasta nu reprezintă factorul determinant al patogenitații.

Modelul membranelor internă și externă pentru tulpina K-12 la Escherichia coli

S-a observat că moleculele de LPS corespunzătoare unor specii bacteriene variate interacționeaza cu afinități asemănatoare și foarte ridicate (nanomolare) cu cristale de alantoină (molecula organică).

Interacțiunile inițiale constau în formarea de legături de hidrogen între alantoină și antigenul O hidrofil din cadrul moleculelor de LPS.

S-a observat că și interacțiunile hidrofobe între lanțurile lipidului A au o contribuție importantă la formarea și stabilitatea ridicată a monostratelor sau bistratelor de LPS absorbite pe cristale de alantoină. Aceste rezultatele sugerează ca alantoină și compuși similari ei pot fi utilizați pentru generarea de membrane pe suport solid ce mimează membranele bacteriene externe .

Reprezentarea moleculelor LPS autoasamblate în monostrat și bistrat pe cristale de alantoină (Vagenende V., et al., 2014)

a) Regiunile hidrofile ale lps (antigenul O) interacționează cu cristalul de alantoină prin legături de hidrogen.

b) Alantoina formează un support solid ce interacționează cu molecule de LPS și duce la autoasamblarea acestora în bistrate lipidice.

Reprezentare a diferitelor mărimi de domenii bogate în LPS observate în experimente (Jakubs K. et al., 2011).

A) Moleculele de LPS neted (cel care conține antigenul O) formează microdomenii dar nu poate forma domenii membranare extinse din cauza împiedicărilor sterice induse de antigenul O.

B) Molecule de LPS rugos nu prezintă împiedicări sterice și se pot organiza în platforme membranare de dimensiuni mari, PE- fosfoetanolamina, PG-fosfoglicerol

Fenomene experimentale:

Inocularea de bacilli Gram negativi omorâti, de pereți celulari sau de endotoxine purificate, la animalele de experințe, este urmată de o suită de simptome caracteristice. În raport cu doza și calea de administrare, acestea se pot manifesta ca simple reacții pirogene, leucopenii, manifeastări cutanate, sau ca reacții generale grave, șoc, moarte.

Faptul că o astfel de reacție, caracteristica fenomenului de sensibilizare dupa injecția “declanșantă”, poate avea loc după o unică injecție cu endotoxină, demonstrează că apariția Ac are loc în mod ocult pentru orice organism animal, datorat microinfecțiilor cu bacilli Gram negativi aparținând florei normale a intestinului și absorbției de antigene lipido-glucido-polipeptidice eliberate în intestine prin liza bacteriilor.

Efectele produse de primo-inocularea experimentală de endotoxine seamana cu efectele produse de inocularea altor antigene la animalul deja sensibilizat, iar efectele produse de toate endotoxinele sunt calitativ aceleași.

Această explicație patogenică dată reacțiilor la endotoxină este întărită de rezultatele experiențelor pe animale germ-free: deși germ-free nu înseamnă și antigen-free, totuși șoarecii crescuți în condiții de sterilitate, ale căror intestine nu sunt populate de bacterii, cel mai adesea nu fac fenomene patologice când sunt injectați cu endotoxină, spre deosebire de animalele crescute în condiții normale.

Pe de altă parte, popularea intestinului șoareciilor germ-free cu bacterii Gram negative le conferă prompt susceptibilitatea la endotoxină. Se poate concluziona că sindroamele declanșate de endotoxine sunt mediate de Ac care apar ocult, așa-numiții “anticorpii naturali”.

Numite inițial endotoxine, mulți cercetători sunt de acord ca aceste structuri sunt lipsite de toxicitate intrinsecă primară, ele fiind toxice pentru organismul deja sensibilizat, care a mai venit în contact cu endotoxina, toxicitatea lor fiind secundară (prin contact cu anticorpii specifici).

Endotoxina reprezintă lipopolizaharidul membranei externe a bacteriilor Gram negative. Endotoxina produce o mulțime de schimbări în funcție de concentrație, jucând un rol important în evoluția boliilor produse de bacteriile Gram negative.

În cantitați mici lipopolizaharidul determină febră, activarea complementului pe cale alternă, activarea macrofagelor și stimularea limfocitelor B. În cantitate mare lipopolizaharidul poate duce la apariția șocului și chiar la moarte. Acțiunea endotoxinei se exercită asupra a patru tipuri de celule: fagocitele mononucleare, neutrofilele, trombocitele și limfocitele B.

Complexitatea fenomenelor nu este determinată de acțiunea directă toxinei ci de substanțe biologic active produse de aceste celule.

Endotoxina produce febra prin eliberarea de către macrofage și de catre alte celule a interleukinei 1, care purtată de sânge, acționează la nivelul centrului termoreglator de la nivelul hipotalamusului.

Activarea complementului pe cale alternă duce la raspuns inflamator: chemotoxie și opsonizare, creșterea permeabilitați capilare și la eliberarea de enzime lizozomale din neutrofile. Endotoxina activează macrofagele, care cresc producția de enzime lizozomale, rata fagocitozei și secreția de hidrolaze. Daca endotoxina este eliberată în cantitate mare, așa cum se întampla în septicemiile cu bacterii Gram negative (Pseudomonas aeruginosa) se produce șocul endotoxic manifestat prin scăderea presiunii sanguine și coagularea intravasculara diseminată.

Relația antigenelor O și R cu endotoxina

Lipopolizaharidul din punct de vedere immunologic se comportă ca un hapten. Din LPS fac parte antigenul O reprezentat de catenle distale ale polizahridului, cu mare specificitate imunologica, si antigenul R, format din lipidul A si miezul (core) polizaharidic, profound, omolgat cu endotoxina, putin diferentiat de la specie la specie.

Lipidul A este un hapten, lipsit de antigenitate proprie, dar responsabil de fenomenele imunpotaologice ale complexului LPS in organismul imunizat de complexe cu proteina.

El este o structura comuna la numerosi bacili Gram negativi, aspect asupra caruia majoritatea cercetatorilor sunt de accord.

Se accepta ca polizaharidul din LPS are o zona comuna nespecifica, cea mai profunda, miezul (core) care se leaga de lipidul A prin intermediu KDO (acid 2-keto-3-dexoioctanoic), si o zona superficiala specifica fiecarui serotip. Monozaharurile care alcatuiesc zona specifica sunt cu atat mai diferentiate cu cat sunt mai distale ai au monozaharurile lateral atasate in aceasta portiune.

Antigenul O este identificat cu aceasta zona distala cea mai specifica si variabila a lantului polizaharidic; el face diferenta intre sutele de serogrupe O; este antigenul de mare specificitate, prezent numai la tulpini in faza smooth. Complexul LPS este, deci alcatuit din lipidul A si polizaharid; el include atat antigenul O, superficial, cu toate proprietatile de specificitate ale acestuia, cat si antigenul R profound.

Antigenul R corespunde structurilor profunde si comune ale polizaharidului legate de lipidul A, prin KDO. El este prezent atat la variante rough cat si smooth, explica cele mai multe din reactiile serologice incrucisate care au loc intre aceste bacterii. Prin rough-izare are loc pierderea treptata a monozaharurilor incepand cu cele mai superficiale ramand complexul R. Se descriu astfel grade de rough-izare (Ra, Rb etc). Mutantii lipsiti de specificitate O sunt numiti variante R. De aceasta structura profunda a complexului LPS este legata activitatea endotoxinica a bacteriilor Gram negative.

Structura miezului (core) si a R-mutantilor Ra-Re (Duca E., et al., 1979)

Calea de transport si biosinteza moleculelor de LPS duce la deschiderea a trei compartimente pentru bacteriile Gram negative. La tulpina de Escherichia coli, domeniul lipidului A cu KDO2 este sintetizat in interiorul citoplasmei, dupa aditia secventiala a zaharurilor in scopul producerii nucleului A oligozaharidic in membrana citoplasmatica. Aceasta molecula este pozitionata pe suprafata periplasmei a membranei interne de catre transportorul ABC inainte ca antigenul O sa fie adaugat.

Biosinteza antigenului O in cazul tulpinii de E.coli incepe in citoplasma cu aditia secventiala a 3-5 monozaharide pe transportorul lipidic undecaprenil monofosfat care sa duca la repetarea subunitatilor antigenice (Zhang G., 2013).

Subunitatea oligozaharidica este transportata pe suprafata periplasmei a membranei interne de Wzx si polimerizata en bloc de Wzy pentru a forma un lant O antigenic polizaharidic care sa contina intre 40-200 subunitati.

Ulterior polizaharidul este transferat acceptorului cu nucleul A lipidic prin intermediul O antigen ligazei Waal anterior tranzitiei prin periplasma catre suprafata celulara prin calea Lpt. Calea Lpt este constituita din 7 proteine care formeaza o structura trans care contine un complex al membranei interne (Lpt/B/F/G/C) referitor la extractia LPS din membrana interna, o legatura intre membrana interna si membrana externa care permite tranzitia de-al lungul compartimentului periplasmatic si translocon al membranei externe (LptD/E) care permite ca molecula lipopolizaharidica detergent-like sa treaca prin membrana externa catre destinatia finala de pe suprafata celulara (Zhang G., 2013).

Imposibilitatea biosintezei a moleculelor de LPS dintr-un organism dat conduce la consecintele privind asamblarea celorlalte componente ale invelisului celular. Sinteza antigenului O, peptidoglicanul, polimerii din compozitia peretelui celular si a proteinelor membranei externe este influentata de absenta LPS.

Functiile principale ale invelisului celular sunt compromise de imposibilitatea sintezei LPS conducand la concluzia ca LPS joaca un rol foarte important pentru o tulpina bacteriana.

Calea de transport si biosinteza moleculelor (Zhang G., 2013)

Concluzii:

Presupunem că mai probabil ca molecula de LPS să se organizeze într-un monostrat în cazul pretratării cristalului ATR cu o soluție de clorura de calciu CaCl2.

Mulțumiri

Adresez mulțumiri speciale pentru contribuția și sprijinul acordat din partea coordonatorului științific profesor doctor Dan Florin Mihailescu și a îndumătorului științific doctorului Octavian Calborean fără de care nu aș fi reușit să duc la bun sfârșit această lucrare.

Mi s-a oferit oportunitatea de a folosi instrumentele proprii de investigare și nu m-a privat de susținere și orientare. De asemenea țin să mulțumesc asistentului doctor Maria Mernea care a avut o contribuție deosebită în vederea obținerii datelor experimentale.

Bibliografie:

Bîlbîe V., Poysgi N.: Bacteriologie Medicală, Editura Medicală, București, vol. I-1984, vol. II-1985.

Chifiriuc M.C., Mihaesc G., Lazăr V., Microbiologie si Virlogie Medicală, Editura Universității București, 2011.

Dorobăț O.M., Bacteriologie Medicală, Universitatea Titu Maiorescu, 2006.

Kaufmann S., Characterisation of supported membrane model systems exposing polzmer chains for proteomics and glycomics platforms, 2010.

Urban E., A. Bota and B. Kocsis, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2006, 48, 106–111.

Anton P. Le Brun, Luke A. Clifton, Candice E. Halbert, Binhua Lin, Mati Meron,

Peter J. Holden, Jeremy H. Lakey, Stephen A. Holt, Structural Characterization of a Model Gram-Negative Bacterial Surface Using Lipopolysaccharides from Rough Strains of Escherichia coli, Biomacromolecules 2013, 2014−2022.

Abu-Lail, N. I., T. A. Camesano, Role of lipopolysaccharides in the adhesion, retention, and transport of Escherichia coli JM109 Environ Sci. Technol. 37:2173–2183, 2003.

Amro, N. A., L. P. Kotra, K. Wadu-Mesthrige, A. Bulychev, S. Mobashery, G. Liu., High-resolution atomic force microscopy studies of the Escherichia coli outer membrane: structural basis for permeability. Langmuir. 16:2789–2796, 2000.

Zhang, L., C. A. Booth, P. Stroeve, Phosphatidylserine/cholesterol bilayers supported on a polycation/alkylthiol layer pair, J. Colloid Interface Sci. 228:82–89, 2000.

Alexander, C., E. T. Rietschel, Bacterial lipopolysaccharides ans innate immunity, J. Endotoxin Res. 7:167–202, 2001.

Caroff, M., D. Karibian, Structure of bacterial lipopolysaccharides, Carbohydr. Res. 338:2431–2447, 2003.

Jakubs Kubiak, Jonathan Brewer, Søren Hansen, Luis A. Bagatolli, Lipid Lateral Organization on Giant Unilamellar Vesicles Containing Lipopolysaccharides, Biophysical Journal Volume 100,978–986, 2011.

Zhang G., Meredith T.C., Kahne D., On the Essentiality of Lipopolysaccharide to Gam Negative Bacteria, HHC Public Access, 2013.

Duca E., Duca M., Furtunescu G., Microbiologie medicala, Editura didactica si pedagogica Bucuresti, 1979.

Jehl F., Chomarat M., Weber M., Gerard A., De l’antibiogramme ἁ la prescription, Edition francaise, 2003.

Vagenende V., Ching T.J., Chua R. J., Jiang Q. Z., Gagnon., Self assembly of lipoloysaccharide layers on allantoin crystals, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 120 (2014) 8–14.

Zarnea G., Tratat de Microbiologie generala, Editura Academiei Romane, 1994.