Acțiunea Surfactanților Asupra Diviziunii Celularedocx

=== Acțiunea surfactanţilor asupra diviziunii celulare ===

UNIVERSITATEA: “DUNĂREA DE JOS” GALAȚI

FACULTATEA : ȘTIINȚA ȘI INGINERIA ALIMENTELOR

SPECIALIZAREA: BIOTEHNOLOGIA RESURSELOR NATURALE

LUCRARE DE DIZERTATIE

Acțiunea surfactanților asupra diviziunii celulare

Coordonator :

Conf. Dr. Biolog VASILICA BARBU

Masterand:

CONDURACHE ROXANA-MARGARETA

Iulie 2014

CUPRINS

INTRODUCERE

STUDIU DOCUMENTAR

1. Diviziunea celulară

1.1. Amitoza

1.2. Mitoza

1.3. Meioza

2. Surfactanții

2.1. Surfactanții utilizați pentru fabricarea detergenților

2.2. Caracterizarea surfactanților

2.2.1. Surfactanți anionici

2.2.2. surfactanți neionici

2.2.3. Surfactanți cationici

2.2.4. Surfactanți amfoterici

2.3. Materii prime utilizate în obținerea surfactanților

2.4. Legislația Uniunii Europene privind detergenții

2.5. Biodegradarea

3. Mutageneza

3.1. Agenti mutageni chimici

3.2. Mecanisme de mutageneza induse de surfactanți

STUDIU EXPERIMENTAL

3. Materiale și metode

3.1. Obținerea materialului biologic

3.2. Reactivi utilizați

3.3. Echipamente utilizate

3.4. Metoda rapidă de colorare cu soluția carmin-acetică a cromozomilor în mitoză la Allium cepa L. (2n=16)

3.5. Determinarea indicelui mitotic și a indicelui de genotoxicitate

3.6. Prelucrarea și interpretarea statistică a datelor

3.7. Biodegradabilitatea surfactanților

4. Rezultate si discuții

4.1. Analiza calitativă și cantitativă a diviziunii mitotice la Allium cepa

4.1.1. Evidențierea etapelor mitozei

4.1.2. Analiza indicelui mitotic la proba martor

4.2. Influența surfactanților asupra diviziunii cwlulare la Allium cepa

4.2.1. Analiza indicelui mitotic (analiza cantitativă)

4.2.2. Anomalii ale diviziunii celulare în prezența agentului mutagen (analiza calitativă)

4.3. Prelucrarea și interpretarea statistică a datelor

5. Concluzii

6. Bibliografie

Anexe

INTRODUCERE

Agenții superficiali sau surfactanții sunt utilizați din cele mai vechi timpuri. De-a lungul timpului ei au îndeplinit cerințele în ceea ce privește curațenia și igiena. Odata cu revoluția industrială, noii agenți tensioactivi au fost modernizați, pe măsură ce noile tehnici de spălare și noile exigențe în materie de igienă au evoluat.

În zilele noastre surfactanții sunt larg utilizați în domeniul industrial sau casnic, mai ales în producerea detergenților. Interesul stârnit de toxicitatea lor își are originea în anii 60, când au apărut probleme legate de formarea spumei și toxicitatea asupra organismelor acvatice. De atunci, au făcut obiectul a numeroase cercetări privind nivelul de concentrație, transformarea lor în mediu și toxicitatea lor.

În această lucrare de dizertație am inclus o evaluare a unei potențiale acțiuni toxice asupra organismului uman, produs de detergenți. Aceste produse sunt folosite în volume mari, iar consumul anual a depășit 70 000 de tone în Danemarca și 9 000 000 tone în Europa. În ultimul deceniu unele componente utilizate anterior în aceste produse au fost înlocuite cu substanțe cu proprietăți mai bune pentru mediu și sănătate.

Pentru a depista efectul surfactanților asupra diviziunii celulare, am folosit drept ”cobai” de laborator – țesuturile meristematice din zona de creștere a rădăcinilor de ceapă – Allium cepa L. (2n = 16).

Diviziunea celulară este o parte integrată a ciclului celular – viața unei celule din momentul apariției prin diviziunea celulei parentale până la finalul propriei ei diviziuni. Diviziunea celulară presupune distribuirea echilibrată a materialului genetic parental (2 copii fidele a ADN genomic) în cele două celule fiice.

Ciclul celular este reprezentat de: interfază, intervalul dintre două diviziuni consecutive și de diviziunea celulară care cuprinde profaza, metafaza, anafaza și telofaza.

Scopul prezentei lucrări de dizertație este studiul citotoxicității și genotoxicității surfactanților asupra celulei eucariote aflate în diviziune. Pentru atingerea acestuia mi-am propus următoarele obiective:

analiza calitativă și cantitativă a etapelor diviziunii mitotice, în condiții standard, având ca model de celulă eucariota – specia Allium cepa;

evaluarea indicelui mitotic sub influența surfactanților în raport cu proba martor;

analiza principalelor anomalii cromozomale rezultate în urma aplicării tratamentelor cu diferite concentrații de surfactanți;

analiza statistică și interpretarea rezultatelor experimentale.

STUDIUL DOCUMENTAR

1. DIVIZIUNEA CELULARĂ

Celula este unitatea de bază, structurală și funcțională, a tuturor organismelor vii. Aceasta a fost descoperită de către Robert Hooke și este unitatea funcțională a tuturor organismelor vii cunoscute. În 1835, înainte ca teoria finală despre celulă să fie dezvoltată, Jan Evangelista Purkinje a observat mici granule, în timp ce privea prin microscop țesuturi de plante. Teoria celulară, dezvoltată pentru prima oară în 1839 de către Matthias Jakob Schleiden si Theodor Schwann, afirmă că toate organismele sunt compuse din una sau mai multe celule, că toate celulele provin din celule preexistente, că funcțiile vitale ale unu organism au loc în interiorul celulelor și că toate celulele conțin informațiile ereditare necesare pentru reglarea funcțiilor celulare și acestea se transmit generație urmatoare de celule.

Cuvantul celulă provine de la cuvantul latin cellula, care inseamnă, o cameră mică. Termenul descriptiv pentru cea mai mică structură de viață biologică, a fost propus de către Robert Hooke într-o carte pe care a publicat-o în 1665, când a comparat celulele de plută pe care le-a văzut prin microscopul său, cu micile camere de locuit ale calugărilor.

În ceea ce priveste structura microscopică, celula este alcătuită din trei componente principale: membrană celulară, citoplasmă și nucleu (fig1). (Jelea et.al, 2008)

Fig. nr. 1.1. Schema structurii electronomicroscopice a celulei (după Niculescu )

Celula procariotă reprezintă un sinergon în care toate funcțiile metabolice sunt îndeplinite de către citoplasmă sau de către invaginările membranei citoplasmatice fară a se diferenția organite în vederea îndeplinirii diferitelor funcții celulare. În cadrul celulei eucariote se diferențiază organite intracitoplasmatice, cu rol bine stabilit în îndeplinirea unei anumite funcții metabolice. Pe de altă parte celula eucariotă prezintă o organizare nucleară superioară, în care materialul genetic este delimitat față de citoplasmă printr-o membrană nucleară dublă electronoptic, iar cromozomii prezintă un ciclu tipic de spiralizare și despiralizare.

Evoluția diviziunii celulare de la bacterii la animale superioare și plante s-a realizat prin dezvoltarea membranei nucleare, care a separat spațial cromozomii de procesele metabolice generale și prin apariția și evoluția unui fus de diviziune compus din mulți microtubuli orientați; acest fus intervine în diviziunea nucleului. Odată cu apariția fusului de diviziune, a avut loc atașarea cromozomilor de microtubulii fusului prin intermediul centromerilor (chinetocori). La nivelul nucleului a aparut un corpuscul dens, mare, bogat în ARN, cunoscut ca nucleol. În afara nucleului, concomitent cu aceste reorganizări ale sale, a avut loc evoluția centrozomului (centrul celular). Totodată apare un ciclu al condensării și decondensării cromonemelor, asocierea ADN-ului cu proteinele bazice de tip histonă și diferențierea regiunilor cromozomale eucromatice și heterocromatice, acestea din urmă păstrăndu-și condensarea și în interfază.( Voiculeț și Puiu, 1997)

Când o celulă se formează, trebuie să existe alta în urma acesteia, exact cum animalele se nasc din animale și plantele din pante. Aceasta este doctrina celulară propusă de Rudolf Virchow in 1858, realizată cu un profund mesaj despre continuitatea vieții. Toate formele de viață, de la bacteriile unicelulare până la mamiferele multicelulare, sunt produse prin cicluri repetate ale creșterii celulelor și diviziunii celulare.

Prin reproducere celulară se înțelege că celula efectuează o serie de evenimente ordonate prin care se duplică conținutul său și apoi se împarte în două. Acest ciclu de dublare și divizare se numește ciclu celular, și este mecanismul esențial prin care toate organismele vii se reproduc. La speciile multicelulare, secvențele lungi si complexe ale diviziunii celulare sunt necesare pentru a produce o bună funcționare a organismului. Chiar și la un corp adult este necesară diviziunea celulară pentru înlocuirea celulelor care mor.

Ciclul de viață variază de la un organism la altul și în funcție de etapa vieții în care se află. Unele caracteristici sunt totuși universale și anume: trecerea informațiilor genetice în următoarea generație de celule. (Alberts et al, 2002)

Înmulțirea este proprietatea fundamentală a materiei vii prin care se asigură menținerea si continuitatea acesteia. Înmulțirea celulelor se realizează prin diviziune, proces care stă la baza cresterii în lungime și grosime a organelor, formării sporilor și gameților. În aceste fel se asigură înmulțirea celulelor și perpetuarea lor de-a lungul generațiilor. Diviziunea și replicarea celulelor stau la baza înmulțirii sexuate și asexuate, mecanismele de replicare celulară fiind similare sau identice la plante și animale.

Formarea zigotului prin contopirea, în procesul fecundației a doi gameți de sex opus, apoi formarea embrionului, creșterea și dezvoltarea acestuia, pot fi considerate un singur stadiu, în timpul caruia are loc creșterea organismului și diferențierea diverselor tipuri de celule și țesuturi. Aceste transformări sunt asigurate de diviziunea mitotică. La organismele vegetale superioare, centrul activității mitotice este reprezentat de țesuturile meristematice apicale, laterale și intercalare.

Diviziunea celulară este un proces complex, iar în cadrul acesteia diviziunea nucleului constituie momentul cel mai important. Deși se cunosc numeroase aspecte de citologie, biochimie și fiziologie ale procesului de diviziune, sunt încă insuficient elucidați factorii interni și externi care intervin în declanșarea și desfășurarea diviziunii. Este cunoscut faptul că în momentul declanșării diviziunii toate celulele, atât cele diferențiate cât și cele meristematice, prezintă potențialitatea de a se divide; la primele, aceste potențialități se manifestă mai rar în timp ce în celulele nediferențiate (meristematice) capacitatea de a se divide este permanentă.

Dintre factorii interni care declanșează diviziunea cel mai important este raportul nucleoplasmatic (R.N.P.). Acest raport este relativ constant pentru fiecare celulă. În momentul în care citoplasma din celulele meristematice se dublează, ca urmare a procesului de asimilație, pentru restabilirea raportului nucleoplasmatic și a dimensiunilor inițiale ale celulei se declanșează diviziunea celulară. Dintre factorii externi, cei mai importanți s-au dovedit a fi temperatura și diferite substanțe chimice. (Anghel, 1979)

Pentru a produce două celule identic din punct de vedere genetic, ADN-ul din fiecare cromozom replicat trebuie să fie distribuit cu precizie în cele 2 celule fiice astfel încat fiecare primește o copie fidelă a genomului.

Fig. nr. 1.2. Ciclul celular.

Aceste procese definesc cele două faze majore ale ciclului celular. Replicarea ADN-ului apare în timpul fazei de sinteză, care necesită 10-12 ore și ocupă aproximativ jumătate din ciclul celular. După faza de sinteză, segregarea cromozomilor și împărțirea celulară are loc în timpul mitozei, fază care impune mai puțin timp (mai putin de o oră, la mamifere). (Alberts et al, 2002)

Diviziunea celulară este de două tipuri:

Diviziune directă sau amitoză (în unele situații)

Diviziune indirectă, mitoză și meioză

1.1. Amitoza

Amitoza se caracterizează prin absența fusului de diviziune și a cromozomilor. Amitoza este considerată ca cel mai simplu mecanism de înmulțire al celulelor, întalnit atât la plantele inferioare cât și la cele superioare. (Anghel et al, 1981)

Prin diviziune directă se formează două celule fiice prin simplă strangulare a nucleului și a citoplasmei celulei mame, fără apariția cromozomilor, după autoreplicarea materialului genetic. Se întâlnește în hepatocite, celule cartilaginoase, oase, etc. (Cotrutz et al, 1994)

Amitoza se realizeză prin două modalitați: amitoza propiu-zisă și meroamitoza.

Amitoza propiu-zisă

În această diviziune nucleul se divide prin strangulare sau gâtuire. Nucleul, cât și celula, se alungesc și se stranguleză în regiunea mediană, luând aspectul unei haltere, după care celula mamă se separă în două celule fiice. Amitoza prin strangulare se întâlnește în celulele epidermei frunzelor tinere ale bulbului de Allium cepa, A. Sativum, Tulipa gesneriana, la diferite specii de ciuperci.

Diviziunea prin clivare

La suprafața nucleului apare o „fisură” (șanț) care se accentuează și în cele din urmă împarte nucleul și celula în două parți egale. A fost observată în celulele tapetului de la angiosperme, în celulele corticale ale unor plante acvatice, etc.

Meroamitoza

Prin strangularea inelară a nucleului iau nastere doi nuclei de dimensiuni diferite. În felul acesta în citoplasma celulei, alaturi de nucleul inițial, se formează un nucleu mic. Printr-o strangulare ulterioară a citoplasmei rezultă o celulă fiică, mai mică decât celula mamă din care a provenit. În urma creșterii, celula-fiică ajunge la dimensiunile caracteristice speciei. Acest tip de diviziune a fost observat la ciuperci la care conidiile se formează prin meroamitoză.

Inițial s-a crezut că amitoza este caracteristică celulelor senescente (îmbătrânite), fiind un fenomen degenerativ rar. În prezent se consideră că amitoza este un proces fundamental, dar primitiv de diviziune celulară, care se întâlnește atât la plantele inferioare, cât și la cele superioare. (Anghel et al, 1981)

1.2. Mitoza

Viața sistemelor biologice este limitată. Pentru asigurarea continuității lor ca și pentru existența sistemelor biologice de-a lungul unei perioade de timp îndelungate, este necesară reproducerea acestora. Creșterea celulelor se desfășoară până se ating anumite limite peste care celula nu mai poate trece. Reproducerea este determinată și de capacitatea limitată a celulei de a crește, capacitate care, în mod normal, asigură doar duplicarea masei celulare.

Fenomenul diviziunii nucleare a fost observat pentru prima dată de către Dumortier, în 1832, la alga Conferva aurea și de către Cisteakov în 1871. La animale acest fenomen a fost observat încă din 1827; ulterior, Schneider, Strasburger (la 1875); apoi Schleicher și Flemming, au descris acest fenomen fascinant, un mecanism biologic fundamental prin care se asigură înmulțirea celulelor și în același timp prin care se asigură distribuirea genelor la celulele fiice fiind condiționată de existența ADN-ului sub formă dublucatenară și de mecanismul semi-conservativ de replicare a acestuia. (Voiculeț și Puiu, 1997)

Mitoza (greacă: mithos- ață, fir, filament) constituie tipul de diviziune caracteristic celulelor somatice ale tuturor organismelor eucariote (Gavrilă și Dăbală, 1975)

Cu toate că I. Schrader (1953) definește prin termenul de mitoză, diviziunile celulelor eucariote, în mod frecvent mitoza este limitată la diviziunea celulelor somatice de la organismele eucariote. Cu toată această limitare, se întâlnesc și excepții atât în cadrul diferitelor stadii de dezvoltare a unor celule, țesuturi și organe, dar și la diferite tipuri de organisme, ciuperci, plante și animale superioare. (Anghel, 1979)

În mitoză celulele fiice trebuie să aibă același număr de cromozomi ca și celua mamă. După meioză, nucleii din celulele fiice au fiecare câte o jumătate din cromozomii celulei mamă. Vorbim astfel despre numărul diploid (2n) și numărul haploid (n) de cromozomi. Toți membrii aceleași specii au același număr de cromozomi, de exemplu, numărul de cromozomi umani este de 46, porumbul are 20 de cromozomi, varza are 18 cromozomi, etc. (Schooley, 1979)

Dintre multiplele modalități de desfășurare a mitozei, P. Grassẻ (1952) remarcă existența a două tipuri fundamentale: pleuromitoza și ortomitoza.

Pleuromitoza se caracterizează prin inserarea cromozomilor pe membrana elementară internă a învelișului nuclear. După clivarea longitudinală, cromozomii se deplasează către cei doi poli ai celulei, fără a se organiza în placa ecuatorială.

Ortomitoza. La sfârșitul profazei cromozomii se inseră pe fibrele fusului de diviziune și se dispun în placa ecuatorială. Modalitățile de desfășurare a ortomitozei sunt variate, în special în organismele unicelulare (mitoza eugleniană, mitoza chaosiană și ortomitoza adevărată).

În timpul diviziunii mitotice, nucelul somatic parcurge două etape importante: etapa pregătitoare și diviziunea propiu-zisă. În etapa de pregătire are loc creșterea celulelor fiice rezultate la sfârșitul precedentei diviziuni, ajungând la o dublare a volumului înainte de o nouă diviziune. Creșterea celulelor apare adesea ca un aspect al diferențierii postmitotice, creșterea celulară și mitoza nefiind legate în mod necesar. (Anghel, 1979)

Planul minim și general al mitozei cuprinde duplicarea cromozomilor și a centrilor mitotici, separarea spre poli opuși a centriolilor fii și deplasarea spre acești poli a cromozomilor fii. Toate procesele se realizează într-un tot unitar, au o desfăsurare unică și continuă, care au fost încadrate în diferite faze ale diviziunii: profaza, prometafaza, metafaza, anafaza, telofaza. (Voiculeț și Puiu, 1997). Cea de-a șasea fază a diviziunii mitotice, citokineza, debutează în anafază și se încheie la sfârșitul ciclului celular.

Fig. nr. 1.3. Ciclul celular și diviziunea celulară

Interfaza

Fig. nr. 1.4. Interfaza

Intervalul de timp care separă două diviziuni succesive ale unei celule a fost denumit „interfază”. Aceasta reprezintă o etapă esențială a activității celulare, în timpul căreia au loc importante procese metaboloce și un intens transfer de material și energie între nucleu și citoplasmă. D. Mazia (1961) consideră că interfaza este o etapă esențială care împreună cu protofaza, constituie un stadiu continuu pregătitor al metafazei. Un ciclu celular tipic durează în medie 20-24 de ore, interfaza fiind cea mai lungă perioadă. A. Howard și R. Pelӧ (1953) au descris în cadrul etapei pregătitoare trei perioade : perioada presintetică (G1), perioada de sinteză (S) și perioada postsintetică (G2). (Anghel, 1979)

Perioada presintetică ( din eng. „G-gop”- gol)– în această perioadă nu se produce sinteza AND-ului (cantitatea de ADN este 2n (2c)), dar se sintetizează intensiv ARNm, proteine, enzime. În afară de aceasta, în celulă se acumulează ATP, iar numărul de organite celulare crește. Perioada G1 constituie 25-50% din timpul interfazei (4-10 ore). Unele celule pot fi într-o permanentă perioada presintetică, în timp ce altele, în G1 se desfășoară procesele specifice care includ organizarea internă. (Anghel, 1979)

Perioada de sinteză (din eng.” S-synthesis”- sinteză) – are loc reduplicarea ADN-ului, cantitatea lui variind între 2c și 4c (după numărul de cromatide). Paralel cu sinteza ARNr continuă sinteza ARNm. Perioada S ocupă 20-30% din interfază. Ea nu poate lipsi din ciclul celular.

Perioada postsintetică – în această etapă continuă sinteza ARN-ului și a proteinelor necesare formării fusului de diviziune. Se sintetizează în cantitați mari tubulinele, actina si miozina, acestea fiind necesare diviziunii celulare. Perioada G2 are o durată de 20-30% din interfază.

În interfază, cromozomii prezintă un grad redus de condensare și sunt înfășurați unul în jurul altuia, încât cu greu pot fi identificați. Nucleolul are marimea maximă, iar volumul nucleului crește în timpul acestei faze. La finalul interfazei intervin o serie de modificări în organizarea fizică și chimică a cromozomilor. (Anghel, 1979)

Profaza

Fig. nr. 1.5. Profaza

Profaza se caracterizează prin condensarea cromatinei și individualizarea cromozomilor sub forma unor filamente subțiri, duble și atașate pe fața nucleoplasmatică a membranei interne nucleare. Filamentele sunt intim spiralate formând un spirem (ghem). Cele două cromatide ce alcătuiesc cromozomul sunt unite la nivelul centromerului și sunt strâns răsucite una în jurul celeilalte (spiralizare plectonemică). Condensarea cromatinei continuă pe întreaga durată a profazei conducând la scurtarea și îngroșarea progresivă a filamentelor cromatidice. (Gavrilă și Dăbală,1975)

Sunt studii care arată că o parte a materialului nucleolar intră în compoziția cromozomilor, iar condensarea parțială a cromozomilor s-ar datora depunerii de ARN nucleolar. În afara ARNn, în compoziția cromozomilor profazici mai intră proteine și probabil fosfolipide, care împreună formează matrixul.

La începutul profazei sau înaintea acesteia, centrozomul, constituit din cei doi centrioli, se înconjoară de aster și se dublează. Cei doi centri celulari rezultați, fiecare formați din doi centrioli, se îndepărtează unul de altul și se plasează la cei doi poli opuși ai celulei. În jurul fiecărui diplozom (centriol) se dispun radial fibre care constituie asterul.

În timpul deplasării centriolilor, din hialoplasmă se diferențiază structuri fibrilare din care se formează fusul de diviziune celular. Se consideră că fusul este constituit din două tipuri de fibre care se deosebesc prin origine, mod de formare și funcții. S-au identificat fibre continue și fibre cromozomice. (Anghel, 1979)

Fusul de diviziune se asamblează inițial în afara nucleului. Creșterea gradului de condensare a cromatinei este însoțită de o încetinire a proceselor de transcripție și sinteză proteică. Scăderea gradată a procesului transcripțional determină inițial micșorarea volumului nucleolar și ulterior, la sfârșitul profazei, fragmentarea și completa sa dezorganizare ca rezultat al blocării sintezei ARN. (Gavrilă și Dăbală,1975)

Prometafaza

Fig. nr. 1.6. Prometafaza

Debutează prin fragmentarea învelișului nuclear în vezicule delimitate de membrană ce staționează pe întreaga durată a mitozei în jurul fusului de diviziune. În urma acestui eveniment, carioplasma fuzionează cu hialoplasma formând mixoplasma. Dezasamblarea membranei nucleare permite accesul fibrelor fusului de diviziune în regiunea nucleară.

În prometafază pe cele două fețe opuse ale centromerului se maturizează complexe proteice specializate în ancorarea cromozomilor de către fibrele fusoriale, numite kinetocori. Cei doi kinetocori ai unui cromozom sunt capturați de fibre ale fusului de diviziune ce pleacă din centrii celulari opuși. Acestea au fost numite fibre kinetocorice. Fibrele fusoriale libere, orientate spre planul ecuatorial al celulei, poartă numele de fibre polare.

Tensiunea exercitată de fibrele kinetocorice asupra cromozomilor imprimă acestora o mișcare agitată, de oscilare între cei doi poli celulari. (Gavrilă și Dăbală,1975)

Metafaza

Fig.nr. 1.7. Metafaza

Metafaza este inertă din punct de vedere sintetic, cromatina atingând condensarea maximă. Cromatidele surori ale cromozomului metafazic sunt situate una alături de cealaltă. Fibrele kinetocorice aliniază cromozomii într-un singur plan perpendicular pe axa fusului de diviziune, localizat la jumătatea distanței ce separă polii celulari, formând placa ecuatorială sau metafazică. (Gavrilă și Dăbală, 1975)

Mișcarea cromozomilor către centrul celulei și orientarea lor sunt determinate, parțial, de fibrele fusului acromatic. Cu toate că mișcările cromozomilor sunt sincronizate, fiecare cromozom acționează independent de ceilalți.

La speciile care prezintă cromozomi mari și mici, cei mari sunt aproape totdeauna periferici, iar cei mici în centru.

Metafaza este mult mai scurtă decât profaza, dar în medie, puțin mai lungă decât anafaza. La finalul metafazei are loc clivarea chinetocorului, iar cromatidele-surori devin independente. (Anghel, 1979)

Anafaza

Fig. nr.1.8. Anafaza

Debutul anafazei se caracterizează prin dedublarea cromozomilor, separarea completă a cromatidelor-surori și migrarea lor către polii opuși ai celulei. Deplasarea cromatidelor este dirijată ce centromeri care ajung primii în regiunile polare, brațele cromozomilor rămânând în urmă. Scurtarea fibrelor fusului a creat impresia că cromozomii sunt atrași spre poli de către fibrele fusoriale cromozomale. (Anghel, 1979)

S-a constatat că detașarea, prin micromanipulare, a fibrelor kinetocorice ce ancorează unul din cromozomii metafazei nu interferă cu separarea cromatidelor surori. Segregarea cromatidelor tuturor cromozomilor, inclusiv a celui detașat se desfășoară simultan. Observația sugerează că inițierea anafazei nu este dictată de aparatul acromatic, ci de un semnal specific.

Studii întreprinse, pe culturi de celule, au demonstrat că declanșarea anafazei este însoțită de creșterea concentrației ionilor de Ca (o concentrație prea mare de ioni de Ca în spațiul intracelular duce la inișierea prematură a anafazei). La trecerea celulei din metafază în anafază are loc defosforilarea unui număr mare de proteine, inclusiv histonele H1 și laminele.

Cromatidele surori ale cromozomilor sunt deplasate spre polii opuși ai celulei, acest eveniment constituie anafaza A; aceasta este rezultatul depolimerizării fibrelor kinetocorice. Concomitent are loc alungirea fibrelor polare, eveniment ce marchează anafaza B.

La finalul anafazei, cromozomii se află grupați la cei doi poli ai celulei și fibrele kinetocorice dispar. (Schooley, 1997)

Telofaza

Fig. nr.1.9. Telofaza

În telofază se desfășoară procese inverse celor care au avut loc în profază. Cromozomii ajunși la polii celulei suferă numeroase transformări. Cromozomii se prezintă la începutul telofazei sub forma unor fibre fine, alungite și încolăcite unele în jurul altora formând un spirem, iar ulterior formează o masă compactă în care cromozomii își pierd individualitatea optică și se constituie nucleii-fii. În această perioadă prin despiralizare se reorganizează heterocromatina si eucromatina. Deși nu se cunosc modificările care au loc la nivelul centriolilor, se presupune că ei trec într-o stare heterocromatică condensată.(Anghel, 1979) (Gavrilă și Dăbală, 1975)

Veziculele delimitate de membrană, ce înconjoară fusul de diviziune, fuzionează delimitând două spații nucleare situate la polii celulari opuși. Porii nucleari reapar, iar laminele defosforilate se reasociază formând lamina B ce ramâne permanent atașată de membrana veziculelor rezultate prin fragmentarea învelișului nuclear în prometafază.

La nivel nuclear începe sinteza ARN-ului, iar în citoplasmă procesul de proteosinteză se intensifică. Transcripția genelor ARNr, din organizatorii nucleolari și formarea particulelor ribonucleoproteice (RNP) prin asocierea ARNr cu proteine specifice importate în nucleu din citoplasmă, conduc la repartiția nucleolului. (Gavrilă și Dăbală, 1975)

În concluzie, în telofază se reorganizează nucleolul, învelișul celular și are loc dizolvarea aparatului acromatic și organizarea centriolilor. În interiorul nucleului se evidențiază ribozomii.

Citokineza

Citokineza definește fenomenul de diviziune a citoplasmei. Deși s-a constatat că citokineza nu are loc niciodată înaintea diviziunii nucleare, totuși procesul mitotic nu condiționează strict declanșarea diviziunii citoplasmatice. (Gavrilă și Dăbală, 1975)

Diviziunea citoplasmei se realizează centripet și centrifug:

Citokineza centripetă are loc prin diferențierea unei „cute”. Procesul de cutare este datorat, în mare parte, activității membranei plasmatice și/sau a protoplastului și se desfășoară sub control genetic. Se consideră că citokineza prin cutare este mecanismul de diviziune a citoplasmei. Se întâlnește în mod frecvent la procariote și eucariotele talofite. Cuta progresează treptat, centripetal, asemătător unei diafragme, până în centru, unde cele două membrane se unesc, astfel încât fiecare citoplasmă-fiică are un perete propiu.

Citokineza centrifugală. În timp ce are loc reconstituirea nucleilor-fiică, fibrele fusului de diviziune, care se mențin și în telofază, se scurtează și se întind până ating pereții celulei. Fibrele continue numite interzonale se apropie și se formează o regiune interzonală care se transformă îm fragmoplast, care, structural se aseamănă cu fusul de diviziune. În zona centrală a fragmoplastului se diferențiază placa celulară, la formarea căreia contribuie fragmente ale reticolului endoplasmatic și dictiozomii care se acumulează în regiunea ecuatorială a celulei.

Placa ecuatorială intercelulară este perpendiculară pe axul fusului de diviziune, la distanțe egale de cei doi poli opuși si fusului; se dezvoltă din centru spre periferie și se închide în momentul sudării cu pereții celulei. (Anghel, 1979)

Recent, s-a constatat că distrugerea fusului mitotic, prin tratare cu colchicină, după apariția șanțului de clivare nu duce la blocarea diviziunii citoplasmatice. Deși după momentul inițierii clivării, mecanismul citokinezei devine independent de structurile microtubulare. Rolul principal revine acum inelului contractil. Această structură alcătuită din filamente de actină și miozină, atașată de fașa citoplasmatică a plasmalemei prin proteine încă necaracterizate, se asamblează la începutul anafazei.

Contracția inelului prin mecanismul actină-miozină concomitent cu depolimerizarea filamentelor de actină ce-l alcătuiesc conduc la continua micșorare a diametrului său și implicit la adâncirea șanțului de clivare.

La finalul perioadei mitotice cele două celule fiice sunt încă unite printr-o regiune centrală ce conține fibre polare ale fusului de diviziune parțial dezorganizate înconjurate de hialoplasmă.

Separarea completă a celulelor fiice, moment ce marchează desăvârșirea citokinezei, are loc la începutul următoarei interfaze.

Fiecare celulă fiică moștenește în urma citokinezei un set de componente celulare.

Fig. nr.1.10. Citokineza

Diviziunea celulară are un efect regenerativ, în special în cazul reproducerii sexuate. Îmbătrânirea organismelor superioare se datorește imposibilității de întinerire a celulelor prin diviziune celulară mitotică. (Anghel, 1979) (Schooley, 1997)

1.3. Meioza

Meioza (greacă meiosis = micșorare) este întâlnită în procesul de gametogeneză (formarea gameților) și reprezintă un tip de diviziune nucleară caracteristic celulelor germinale. Meioza a fost descoperită de E. van Beneden în 1883 la Parascaris equorum.

Fig.nr.1.11, Meioza

Meioza este caracteristică celulelor germinale, comparativ cu mitoza care este caracteristică celulelor somatice. (Gavrilă și Dăbală, 1975). Cu toate diferențele care separă mitoza de meioză, amândouă sunt dependente de activitățile nucleului și cromozomilor, de organizarea substanței citoplasmatice implicate în diviziune. (Anghel, 1979)

Meioza se caracterizează prin înjumătățirea numărului de cromozomi în celule progene. În celulele diploide (2n) inclusiv cele germinate, nucleul conține cu excepția cromozomilor de sex (X și Y), perechi de cromozomi omologi, fiecare pereche fiind alcătuită dintr-un cromozom matern și altul patern. Gameții rezultați prin diviziunea celulelor germinale sunt celule haploide (n). În nucleul lor se găsesc câte un cromozom din fiecare pereche de omologi și un singur ceomozom ce determină sexul.

Meioza este un mecanism complex care implică desfășurarea succesivă a două diviziuni indirecte. Cele două diviziuni care au loc în cadrul meiozei sunt precedate de o interfază premeiotică și separate de o interfază scurtă, din care lipsește perioada sintetică (replicarea ADN), numită interfază meiotică. (Gavrilă și Dăbală, 1975)

Din punct de vedere citologic, meioza constă în succesiunea a două diviziuni, în urma cărora o celulă diploidă dă naștere la patru celule haploide, numite meioza I și meioza II. Meioza este caracterizată prin formarea perechilor de cromozomi, diviziunea întârziată a centromerului și schimbul de material genetic ce poate avea loc între cromozomii omologi.

Principala deosebire dintre prima profază meiotică și profaza mitotică constă în gruparea cromozomilor omologi sub formă de perechi, numite și gemeni cromozomali.

În timpul meiozei are loc replicarea ADN-ului o singură dată, și anume în interfaza ce precede profaza I și o deduplicare structurală a cromozomilor. Sunt autori care consideră că cromatidele meiotice din profază sunt simple iar cele din mitoză sunt duble, în timp ce alți cercetători au observat cromozomii dubli în faza premeiotică și în telofază. Marcarea cu timidină tritiată a evidențiat că ADN-ul se replică în întregime sau în cea mai mare parte înainte de stadiul de leptoten, iar iradierea cu raze x a nucleilor în interfaza premeiotică indică prin ruperea, în special al cromatidelor, că cromozomii se dublează structural înainte de leptoten. (Anghel, 1979)

Prima diviziune a meiozei (meioza I)

Mai este numită și mitoză heterotipică, reducțională sau atipică.

Meioza I are loc imediat după încheierea interfazei permeiotice, astfel încât la începutul acestei diviziuni ADN-ul este complet replicat (celulele sunt tetraploide), fiecare cromozom fiind alcătuit din două cromatide surori.

Cromozomii bicromatidici omologi (matern și patern) se grupează în perechi formând o structură tetracromatidică numită cromozom bivalent sau tetradă. Cromatidele nesurori ale bivalentului sunt antrenate în procese de remaniere cromozomială. Separarea ulterioară a cromozomilor omologi, translocarea acestora spre polii celulari opuși și citokineza conduc la formarea a două celule progene. Fiecare progen conține câte două copii ale unui singur cromozom din fiecare pereche de omologi ai celulei parentale. Copiile sunt asociate formând un cromozom bicromatidic. (Gavrilă și Dăbală, 1975)

Profaza I

Se deosebește de profaza mitotică atât sub aspectul duratei (90-95%), cât și sub cel al evenimentelor ce au loc în această etapă. (Gavrilă și Dăbală, 1975). După replicarea ADN-ului este inițiată asocierea de cromozomi omologi. De obicei împerecherea cromozomilor omologi se desfășoară în două etape distincte: alinierea cromozomilor și sinapsa cromozomală.

În această etapă se pot vedea la microscop cromozomii îngroșați. Perechile de cromozomi omologi se îndreaptă spre placa ecuatorială, aceasta înseamnă că în loc de două cromatide surori, ca la mitoză, aici sunt patru cromatide surori care se deplasează împreună (tetradă). (Schooley, 1997)

ADN-ul este cel mai important component care stă la baza stucturii și reproducerii cromozomilor. Sinteza ADN-ului în ciclu meiotic se desfășoară la începutul profazei meiotice. În majoritatea cazurilor, sinteza ADN-ului nu se termină în interfaza meiotică și se continuă în profaza I. Astfel s-a stabilit că, chiar în zigoten-pachiten, mai poate avea loc o sinteză suplimentară de ADN. Se consideră că sinteza suplimentară de ADN din profaza I meiotică, se leagă de mecanismul remanierilor prin crossing-over, de eventualele procese reparatorii ale acestora. (Voiculeț și Puiu, 1997)

Profaza este împărțită la rândul ei în cinci stadii succesive: laptoten, zigoten, pachiten, diploten și diachineză.

Leptotenul se caracterizează prin condensarea cromatinei și individualizarea cromozomilor sub forma unor filamente lungi și subțiri.

Fiecare cromozom este alcătuit din două cromatide surori unite la nivelul centromerului și sunt intim asociate, ceea ce conferă cromozomului un aspect monocromatic. Cromozomii sunt atașați cu ambele capete de învelișul nuclear prin intermediul unor structuri specializate numite plăci de atașare; formând în interiorul nucleului o configurație denumită „buchet”. (Gavrilă și Dăbală, 1975)

Experiențele efectuate la numeroase specii au evidențiat că sinteza ADN-ului se continuă și în primele stadii ale profazei, motiv pentru care W. Brown (1972) consideră că leptotenul, zigotenul și pachitenul alcătuiesc o perioadă unică- G2. Deoarece în leptoten nu are loc procesul de clivare al cromozomilor, se consideră că apariția lor precede sinteza ADN-ului.

Pe parcursul leptotenului are loc spiralizarea cromozomilor, cromatidele ramân asociate până când centromerul funcționează singur în fiecare cromozom. Nucleolul este vizibil, dar la unele celule este relativ mic la începutul profazei și crește în volum în leptoten și zigoten, datorită sintezei de ARN. La finalul etapei, pe o singură parte, în lungul fiecărui cromozom se diferențiază o lamă proteică, numită axă. Cromatina ce formează cromatidele surori proemină sub forma unor bucle, pe fața opusă axei.

Zigotenul reprezintă stadiul din care are loc conjugarea cromozomilor omologi, proces numit sinapsis (ormarea sinapsei) pe baza omologiei genelor, fiind fenomenul cel mai semnificativ. Cromozomii omologi, patern și matern, se apropie unul de celălalt și formează perechi de cromozomi bivalenți. Recunoașterea și gruparea cromozomilor omologi în perechi se realizează prin intermediul proteinelor ce intră în alcătuirea axelor. Un rol în aceste evenimente îl joacă și învelișul nuclear de vreme ce, în zigoten, cromozomii continuă să fie atașați de membrana nucleară. Împerecherea poate să înceapă de la capetele cromozomilor și progresează către chinetocor, sau poate să înceapă în regiunea centrală și să progreseze către capete. Inițierea conjugării implică interacții între perechile de baze complementare ale ADN-ului din regiunile cromozomiale specifice numite zigomere sau sinapsomere. Prin stabilirea interacțiilor se realizează alinierea cromozomilor, astfel încât fiecare genă dintr-un cromozom este juxtapusă genei omoloage din cromozomul pereche. Din punctele de inițiere conjugarea se extinde progresiv, cuprinzând integral cromozomii prealineați într-o manieră zipper like.

Rezultatul desăvârșirii conjugării îl constituie formarea bivalenților, numiți și tetrade, denumire ce sugerează numărul de cromatide ce-i alcătuiesc.

În momentul conjugării, cele două axe ale cromozomilor omologi sunt dispuse față în față la o distanță de 100nm, constituind elementele laterale ale unei structuri trilamelare, numite complex sinaptinemal. O lamă proteică este interpusă între cele două axe. Ea reprezintă cea de-a treia componentă a complexului sinaptonemal și poartă denumirea de element central. Elementele laterale sunt conectate în mod similar treptelor unei scări. (Gavrilă și Dăbală, 1975)

Fig. nr. 1.12. Stadiul zigoten; conjugarea cromozomilor cu formarea bivalenților.

În meioza I, compexul sinaptinemal joacă un rol important în stabilirea cromozomilor omologi în tetradă. (Edgar Hartsuiker și J. Kohly, 2001 )

Pachitenul începe în momentul desăvârșirii conjugării cromozomilor. În acest stadiu formarea perechilor de cromozomi este completă, fiecare se înfășoară unul în jurul celuilalt. Ca rezultat al creșterii diametrului spirelor și al apariției unui alt nivel de spiralizare, cromozomii sunt și mai scurți și mai groși. (Anghel, 1979)

Principalul eveniment ce caracterizează pachitenul este crossing-over-ul. Fenomen ce implică ruperea în aceași poziție a extremității unei cromatide materne și a alteia paterne și reuniunea încrucișată a fragmentelor. Prin schimbul reciproc de fragmente între cromatidele nesurori se realizează recombinarea genetică. Fiecare cromozom va conține gene aparținând ambilor genitori, noua combinație de gene creată transmițâdu-se generațiilor următoare.

Procesul de recombinare este catalizat de către complexe multiproteice a căror diametru este de 90nm, numite nodului de recombinare. Aceștia se formează în interiorul complexului sinaptinemal ocupând aproape integral spațiul ce separă cele două axe ale cromozomilor omologi.

Deși implicarea complexelor multiproteice în recombinarea genetică nu a fost demonstrată experimental, se consideră că nodulii de recombinare conțin întregul echipament enzimatic necesar clivării cromatidelor nesurori și reunirii încrucișate a fragmentelor cromatidice. Participarea acestor noduli, în desfășurarea crossing-over-ului a fost sugerată de următoarele constatări:

Corelarea existentă între numărul nodulilor și cel al chiasmelor evidențiate în stadiul următor al profazei I

Distribuția spațială similară a nodulilor de recombinare și al evenimentelor de crossing-over de-alungul complexului sinaptinemal

La mutanții Drosophilei melanogaster ce prezintă o diminuare și o distribuție anormală a crossing-over-ului, numărul nodulilor de recombinare este mai mic, iar localizarea lor diferă de cea întâlnită la indivizii normali. (Gavrilă și Dăbală, 1975)

Diplotenul reprezintă stadiul profazei I în care are loc separarea parțială a omologilor prin dezorganizarea complexului sinaptinemal. Cromozomii suferă în continuare fenomenul de condensare prin accentuarea spiralizării și se evidențiază o tendință de separare, rămânând uniți în anumite puncte de contact denumite chiasme. Ca urmare a creșterii spirelor și scurtarea cromozomilor, are loc o deplasare a chiasmelor către capetele cromozomilor, fenomen numit terminalizare. Clivarea longitudinală a cromozomilor determină ca fiecare bivalent să apară format din patru cromatide.

Deși teoretic chiasmele se pot forma în orice zonă cromozomală, s-a constatat absența lor în zonele heterocromatinice. În plus, apariția unui crossing-over împiedică desfășurarea unui eveniment simular în zonele imediar învecinate, ceea ce impune o anumită distanță între chiasmele situate pe același braț cromozomal. Ea a fost denumită distanță de interferență.

În meioza I, chiasma joacă un rol similar celui pe care îl are centromerul în mitoză, asigurând segregarea corectă a materialului genetic. Absența chiasmei într-un bivalent face imposibilă segregarea cromozomilor omologi în următoarele etape ale meiozei, fenomen cunoscut sub numele de nondisjuncție. În acest caz o parte din gameții rezultați vor avea un cromozom în minus, în timp ce alții vor conține o copie cromozomială în plus.

Diachineza debutează cu condensarea cromatinei și blocarea transcripției. Se caracterizează prin continua scurtare și îngroșare a cromozomilor. Cromozomii pereche migrează către periferia nucleului și se separă unul de altul, rămânând uniți numai prin chiasmele terminale, adesea reduse ca număr și ușor de evidențiat. Deși inițial nucleolii sunt vizibili, la finalul diachinezei dispar.

În acest stadiu membrana nucleară se dezorganizează și se diferențiază fusul acromatic. În diachineză sunt posibile schimburi reciproce de segmente între două din cele patru cromatide ale unui bivalent.

În prezent se consideră că fenomenul de crossing-over are loc la sfârșitul interfazei, între cromozomii necondensați. (Anghel, 1979)

Prometafaza I

Sunt cercetători care consideră prometafaza ca un stadiu de sine stătător, în care cromozomii, sub formă de bivalenți, se deplasează către centrul celulei, unde vor forma placa ecuatorială.

În această fază se dezorganizează învelișul nuclear și se formează aparatul acromatic. La nivelul centromerilor se evidențiază kinetocorii. Cei doi kinetocori ce se dezvoltă pe centromerul unui cromozom din bivalent sunt ancorați de fibrele kinetocorice ce pornesc de la același pol al fusului de diviziune. Kinetocorii de pe centromerul cromozomului omolog sunt legați prin fibre kinetocorice de polul opus. (Gavrilă și Dăbală, 1975)

Metafaza I

Este marcată de dispunerea cromozomilor sub forma plăcii ecuatoriale, fiind orientați cu centromerii spre polii fusului și cu brațele spre regiunea ecuatorială. Regiunile centromerice se resping reciproc și determină această orientare către polii fusului acromatic. Prin această orientare metafaza meiotică se deosebește de cea mitotică la care centromerii sunt dispuși la nivelul plăcii metafazice. (Anghel,1979)

Mobilizarea bivalenților spre regiunea ecuatorială a celulei și alinierea lor în placa metafazică constituie evenimentele caracteristice metafazei I. Chiasmele localizate terminal mențin cromozomii omologi uniți pe toată durata metafazei I. Finalul acestei etape este marcată de dispariția chiasmelor și eliberarea cromozomilor din bivalent.

Anafaza I

Odată eliberați din tetradă, cromozomii omologi sunt translocați spre polii celulari opuși printr-un mecanism similar celui întâlnit în mitoză. (depolimerizarea fibrelor kinetocorice și alungirea fibrelor polare).

Spre deosebire de cromozomii monocromatidici din anafaza mitotică, cromozomii din afara mitozei I sunt bicromatidici. Migrarea la polii celulari ai acestora conduce la reducerea la jumătate a numărului de cromozomi prezenți inițial în celula parentală. Concomitent începe procesul de decondensare a cromozomilor. (Gavrilă și Dăbală, 1975)

Telofaza I

Cromozomii ajung la polii fusului și se alungesc printr-un proces de despiralizare, dar își păstrează individualitatea. Relaxarea cromatinei face posibilă reînceperea sintezei ARN-ului. Membrana nucleară se reorganizează delimitând cei doi nuclei rezultați în urma diviziunii. Cromozomii se prezintă sub forma a două cromatide unite prin centromer. Nu se cunoaște precis dacă aceasta se datorează replicării ADN-ului sau a unei dublări structurale a cromozomilor. Citockineza poate avea loc sau poate lipsi și asfel produșii primei diviziuni meiotice pot fi două celule sau doi nuclei separați sau nu printr-o membrană plasmatică.

Interfaza dintre cele două diviziuni nu prezintă sinteza ADN-ului, și prin aceasta se deosebește de interfaza ce precede diviziunea reducțională. (Anghel,1979)

Interfaza meiotică

Mai scurtă decât interfaza mitotică sau premeotică, interfaza ce separă cele două diviziuni meiotice se caracterizează prin absența perioadei S.

Pe parcursul interfazei meiotice se desfășoară procese transcripționale și de proteosinteză ce pregătesc intrarea celulei în meioza II. Se apreciază că acum are loc reorganizarea kinetocorilor, care se poziționează pe fețele opuse ale centromerului fiecărui cromozom bicromatidic. Reorientarea face posibilă segregarea materialului genetic pe parcursul celei de-a doua diviziuni meiotice.

Interfaza meiotică nu este întălnită la toate celulele eucariote, fiind posibilă derularea succesivă a color două diviziuni. (Gavrilă și Dăbală, 1975)

A doua diviziune a meiozei ( meioza II)

În comparație cu prima diviziune meiotică, cea de-a doua diviziune, desfățurându-se aparent după tipul unei mitoze obișnuite este mai puțin spectaculoasă. Deosebirea esențială între a dpuă diviziune meiotică și mitoza propiu-zisă constă în aceea că, împărțirea fiecărui cromozom în cromatide a preexistat în toată prima diviziune meiotică și se moștenește direct de la aceasta, pe când în cazul mitozei, ea s-a produs în cursul interfazei recente, ce precede diviziunea în sine. De asemenea cromatidele cromozomilor în a doua diviziune meiotică, fiind un mozaic de material genetic matern și patern, se deosebesc de cromatidele cromozomilor din mitoza tipică. Crossing-over-ul, realizat în prima diviziune meiotică reprezintă baza materială a recombinării genetice și a realizării acestui mozaic

Meioza II este în estență, o diviziune mitotică cu singura deosebire că cromozomii se mențin dublați în anafaza I; are loc simultan în cele două celule haploide rezultate în urma primei diviziuni reducționale.

Profaza II

În profaza II cele două cromatide ale fiecărei diade cromozomale au aspect de X fiind unite de o regiune centromerică comună. Cele patru brațe sunt larg îndepărtate. Constituția genetică a celor două cromatide ale fiecărei diade cromozomale depinde de felul și numărul crossing-overelor ce au loc în P1. Dacă nu a avut loc crossing-overul, diada va fi formată din două cromatide surori identice fie de origine maternă sau paternă. Dacă a avut loc crossing-overul, fiecare cromatidă va avea segmente derivate de la ambii cromozomi parentali. Singurele regiuni invariabile, compuse din segmente de la cromatide surori, sunt acelea din imediata vecinătate a centromerilor și care sunt proximale primei chiasme. (Voiculeț și Puiu, 1997)

La finalul profazei II dispare membrana nucleară și apare în citoplasmă fusul de diviziune.

Metafaza II

În această etapă diadele cromatidice devin orientate cu regiunile lor centromerice pe placa ecuatorială și cu brațele către cei doi poli. Centromerul fiecărei diade devine dublu structural și funcțional. De la centromeri pornesc fibrele cromozomale. Începe după dedublarea centromerului, deplasarea cromatidelor spre polii opuși.

Anafaza II

Cromozomii se deplasează la cei doi poli ai celulei. Deplasarea are loc imediat ce centromerul este dublu din punct de vedere funcțional. Diviziunea este homotipică sau ecvațională. Se formează patru nuclei fii, care conțin doar câte un cromozom omolog de la fiecare părinte. Dar ca rezultat al crossing-overului, acești cromozomi fii conțin atât material genetic de origine maternă, cât și material genetic de origine paternă, materialul genetic la nivelul lor fiind reorganizat, recombinat.

Pe baza segregării independente a cromozomilor, pertenerii fiecărui bivalent prezintă o posibilitate egală de a migra spre un pol sau spre celălalt. Aceasta creează posibilitatea egală de a migra spre un pol sau spre celălalt. Aceasta crează posibilitatea regrupării cromozomilor, adică posibilitatea realizării în cei patru nuclei haploizi, rezultați în urma celor două diviziuni meiotice succesive a diferitelor asocieri de cromozomi materni și paterni. Din această cauză se crează o gamă largă de posibilități de recombinare a cromozomilor condiționată de numărul acestor cromozomi. W.S. Sutton la 1903 descoperă faptul că gameții rezultat al diviziunii meiotice, prezintă o multitudine de posibilități de combinare a cromozomilor paterni și materni.

Telofaza II

Are loc despiralizarea cromozomilor, repartiția nucleolului și formarea învelișului nuclear. Cromozomii își pierd individualitatea la nivelul celor patru nuclei fii haploizi. Spre finalul ei, se individualizează patru celule haploide care alcătuiesc o tetradă. Fiecare celulă a tetradei devine un gamet.

La speciile sau liniile poliploide, meioza prezintă anumite caracteristici datorită numărului mare de cromozomi omologi sau aproape homeologi. În mod constant se observă apariția cu o fregvență mărită a unor anomalii cromozomale. (Jelea et al, 2007)

2. SURFACTANȚII

În societatea primitivă, chiar și în zilele de azi, hainele erau curațate prin frecarea cu pietre pe malul unei ape curgătoare. În dicționar, cuvântul ”detergent” este definit ca agent de curațare. În ultimii 20 de ani, însă acest cuvânt a căpătat semnificație de detergent sintetic. Aceștia conțin anumite cimponente nuumite substanțe tensio-active. De exemplu săpunul este cea mai veche substanță tensio-activă.

Numele de săpun, după o veche legendă romană, vine de la muntele Sapo, unde erau sacrificate animale. Ploaia a amestecat grasimile cu seu și cu cenușă pe malul râului Tibet. Femeile au observat că acest amestec de sol lutos îmbibat cu grăsimi le ușura munca.

Săpunul s-a transformat în detergent când o firmă germană a început comercializarea detergentului ”Persil” care pe lângă dăpunul de acid carboxilic, conținea perbonat de sodiu (NaBO3), silicat de sodiu și carbonat de sodiu.

În timpul celui de-al doilea război mondial, lipsa grăsimilor, ingredientul predominant din săpunuri, a dus la cercetarea detergenților sintetici.

2.1. Surfactanții utilizați pentru fabricarea detergenților

Detergenții sunt preparate complexe ce pot reuni chiar și peste 20 de compuși din diferite clase de substanțe organice și anorganice. Efectul de curățare al unui detergent este dat de suma efectelor parțiale ale componentelor, fiecare contribuind fizic și/sau chimic în proces. Acțiunea acestora reduce energia mecanică și tehnică necesare procesului de curățare (Florescu S. și Leca M., 2003).

Detergenții au o compoziție complexă conținând, alături de surfactanți și agenți de condiționare, înălbitori optici și chimici, activator de albire, enzime, agenți de reglare a gradului de spumare, coloranți, parfumuri și alte componente auxiliare.

Agenții activi de suprafață, surfactanții, sunt substanțe chimice care în soluții se concentrează la suprafață și solubilizează materiale care au o mică afinitate unele față de altele. Acumulându-se pe suprafețele de separare, surfactanții sunt capabili să modifice puternic, chiar și în concentrații mici, proprietățile superficiale ale lichidelor în care se dizolvă.

Surfactanții prezintă o structură moleculară asimetrică compusă din două parți, cu proprietăți fundamentale diferite: una polară sau slab polară (hidrocarbonată)și alta puternic polară (ionizabilă sai neionizabilă). Partea nepolară este insolubilă în apă (hidrofobă)și îm lichide puternic polare dar este ușor solubilă în uleiuri (lipofilă) și în general în lichide nepolare. Partea polară, din contră, este hidrofilă. Datorită diverselor afinități pe care le prezintă pentru diferitele faze, astfel de molecule se numesc amfifile.

Acumularea surfactanților la interfețe se datorează structurii asimetrice a moleculelor lor, care prezintă afinități diferite față de diferitele faze care formează sistemul. Stratul de absorbție care se formează servește ca legătură între fazele insolubile (de exemplu apă-ulei). Industrial surfactanții se împart în patru categorii bazate pe sarcină electrică prezentă în moleculele lor în soluții:

– surfactanții anionici au un ion negativ în gruparea polară,

– iar surfactanții cationici un ion pozitiv.

– surfactanții neionici nu au sarcină electrică.

– surfactanții amfolitici au o sarcină negativă, fie una pozitivă în funcție de pH-ul soluției. Fiecare au parte nepolară constituită dintr-o grupare hidrocarbonată ce diferă ca dimensiune moleculară și complexitate. (Avram R. et all, 2004)

2.2. Caracterizarea surfactanților

2.2.1. Surfactanți anionici

Majoritatea deterhenților conțin o cantitate mare de surfactanți anionici. Cei mai importanți dintre surfactanții anionici utilizați în detergenți sunt:

Săpunuri

Alchil benzen sulfonați (în principal LAS – lauryl alchilbenzen sulfonat)

Alchil sulfații (AS)

Alchil eter sulfații (AES)

Alcani sulfonați secundari (SAS)

Săpunul a rămas cel mai răspândit surfactant din lume din punct de vedere al volumului. Multe țări încă aleg acest surfactant. Detergenții conțin o cantitate scăzută de săpun datorită sensibilității sale la duritatea apei. Astfel principala funcție a săpunului în Europa este de a ajusta spumarea în detergenți.

În Europa, SUA și Japonia, săpinul a fost înlocuit cu un surfactant anionic sintetic LAS. Deoarece acesta prezintă o capacitate foarte bună de curățare și ca o consecință a solubilitații lor înalte, LAS sunt de asemenea utilizați în detergenții lichizi (Helle Buchardt Boyd, 2001).

AS sunt în general alcooli sulfați și sunt fie obținuți din alcooli grași naturali sau din substanțe petrochimice. (Merretting-Bruns, et all, 2003)

AES sunt etoxisulfați ce conțin un alchil hidrofobic și in lanț etoxil hidrofilic. Acesta prezintă în formulările lichide o sensibilitate înaltă și o bună stabilitate în depozitare la temperaturi scăzute. AES comerciali au ca principali componenți alchil eter sulfații și alchil alchil sulfații. Ei conduc la o spumare intensă și în consecință sunt potriviți pentru utilizarea lor în detergenții cu spumare înaltă. (Merretting-Bruns, et all, 2003)

SAS sunt considerați surfactanți anionici speciali pentru produse de consum. Prezintă o solubilitate înaltă, proprietăți de umezire rapidă, stabilitate chimică. Aceștia sunt complet insensibili la hidroliză, chiar și la valori extreme de pH, o consecință a prezenței legăturii stabile carbon-sulf. (Merretting-Bruns, et all, 2003)

2.2.2. Surfactanți neionici

Surfactanții neionici, pe măsură ce trece timpul, capătă o importanță din ce în ce mai mare. Proprietățile hidrofile ale acestora sunt asigurate de grupările hidroxil, de legaturi eterice, de grupe amidice, etc. (Avram R, et all, 2004)

Proporția surfactanților neionici în cadrul producției și folosirii totale de surfactanți a crescut continuu sin 1970. Contribuabilii principali la această creștere au fost etoxilații alcoolilor grași, oxo-alcoolii li acloolii secundari obținuți din reacția alcoolilor corespunzători cu oxidul de etilenă. Cea mai răspândită utilizare a surfactanților neionici în formulările detergenților a fost parțial concomitentă cu tendința de a spăla la temperaturi scăzute și cu schimbările. Cei m importanți sunt:

Alcool etoxilații (AE)

Alchilfenol etoxilați (APE)

Alcanoamide ai acizilor grași (FAA)

Oxizi de alchiamine (AO)

N- Metilglucamide (NMG)

Alchilpoliglicozide (APG)

AE sunt cei mai importanți surfactanți neionici prezenți în formulările detergenților. Prin varierea lungimii lanțului de carbon și al gradului de etoxilare, acești surfactanți neionici pot fi modificați în funcție de temperatura de spălare. (Merretting-Bruns, et all, 2003)

APE sunt bazați pe p-octil-, nonil-, și dodecilfenol poli(etilen glicol) esteri. Ei au obținut un succes timpuriu datorită proprietăților excepționale ale capacitații de curațire, în mod special caracteristicilor de îndepărtare a uleiurilor și grasimilor. (Merretting-Bruns, et all, 2003)

FAA sunt uitlizați în proporții mici în detergenții de rufe. Cea mai importantă trasatură este amlificarea spumei. Totuși cantitați mici de FAA utilizați ca și co-surfactanți sunt capabile sa potențeze proprietațile de îndepărtare a petelor ale componenților detergentților clasici la temperaturi de spălare scăzute. (Merretting-Bruns, et all, 2003)

AO sunt produși prin oxidarea aminelor terțiare cu perhidrol. Ei prezintă un comportament cationic în mediu acid și se comportă ca și surfactanți neionici în mediu alcalin sau neutru. În ciuda proprietăților bune de curațare, aceștia sunt rareori incluși în formulele detergenților de rufe. (Merretting-Bruns, et all, 2003)

NMG reprezintă un nou tip de surfactanți neionici care au fost introduși în detergenți în 1990.sunt utilizați utilizați foarte mult ca și cosurfactanți în formulările detergenților lichizi și tip pudră. (Merretting-Bruns, et all, 2003)

APG, constând într-un lanț alchil (hidrofob) și derivați ai zahărului (hidrofil), au caracteristici distincte de spumare, în special în combinații cu surfactanți anionici. Datorită proprietaților lor de spumare sunt predominant folosiți în detergenții de spălat vase, detergenți lichizi, și în detergenții pentru materiale fine. (Merretting-Bruns, et all, 2003)

2.2.3. Surfactanți cationici

În surfactanții cationici proprietățile superficial active sunt asigurate de cationi și de regulă, sunt săruri cuaternare de amoniu. Aceștia, sunt utilizați ca:

Agenți antiseptici

Componente pentru produse cosmetice

Inhibitori de coroziune

Depresanți de spumare

Agenți de flotație

Aditivi pentru asfalt, etc.

Se pot sublinia în mod deosebit două utilizări ca fiind mai importante: agenți antimicrobieni și agenți de înmuiere a țesăturilor textile. (Avram R, et all, 2004)

Cei mai importanți sunt compușii cuaternari de azot:

Compuși mono- sau di-alchil cuaternari (DADMAC)

Compuși mono- sau di-alchil cuaternari interesterificați (esterquats- EQ)

Derivați imidazolini

DADMAC (clorură dialchildimetilamoniu) este primul balsam de rufe introdus în 1949, apoi a fost înlocuit cu esterquats din anii 1980. Datorită legăturilor esterice, care sunt potențiale puncte de scindare, esterquats sunt ușor degradabile comparative cu DADMAC, având de asemenea și proprietăți ecotoxice și toxicologice favorabile.

Derivații imidazolin alchilați sunt de asemenea utilizați în detergenți dar și în produse pentru îngrijire corporal. (Merretting-Bruns, et all, 2003)

EQ a fost testat pe șoareci și șobolani în doze orale de 5000 mg/kg greutate corporală, în urma testelor nu a rezultat nici o reacție toxică. În ruma aplicării testului Ames EQ nu au arătat efecte mutagene și nici muutații cromozomiale. (Helle Buchardt Boyd, 2001)

2.2.4. Surfactanți amfoterici

Acești surfactanți dețin atât grupări anionice cât și cationice în aceeași moleculă chiar și în soluții apoase. În ciuda proprietăților excelente de curățire, acești surfactanți sunt rar incluși în detergenții de rufe, în general datorită costurilor mari. Dintre acești surfactanți, betaina este importanță din punct de vedere economic. Betaina nu este sensibilă la duritatea apei, este puțin toxică și este compatibilă cu pielea. Este utilizată atat în detergenți de vase, rufe, cât și în produse de îngrijire corporală.

Cele mai importante tipuri de surfactanți amfoterici sunt:

Alchil betaina

Alchilamidopropil betaina

Betaine derivate din imidazoline

Alchilamfoacetați (Merretting-Bruns, et all, 2003)

Amfoterii sunt ușor absorbiți în intestin și se excretă parțial nemodificați prin materii fecale. Nu au fost detectate acumulări în organism sau depozitări de betaină în anumite organe. Betaina are în general o toxicitate acută mică. Teste de genotoxicitate au avut rezultate negative, observându-se că betaina este non-mutagenă la Salmonella typhimurium. (Helle Buchardt Boyd, 2001)

Nici un surfactant nu este capabil să îndeplinească toate cerințele unui singur produs de unul singur, într-un mod optim. Prin urmare, a crescut din ce în ce mai mult tendința de a utiliza amestecuri de surfactanți, în care proprietățile componenților sunt destinate să se completeze reciproc.

Surfactanții adecvați trebuie să îndeplineasca următoarele condiții pentru a putea fi utilizați în detergenți:

Adsorbția specifică

Îndepărtarea excelentă a petelor

Sensibilitate scăzută la duritatea apei

Proprietăți de dispersie bune

Solubilitate înaltă

Putere de înmuiere suficientă

Caracteristici de spumare bune

Miros neutru

Stabilitate de stocare suficientă

Caracteristici de manipulare bune

Toxicitate scăzută pentru oameni

Comportament favorabil față de mediul înconjurător

Asigurarea aprovizionării cu materii prime

Costuri competitive (Bothing R.S.și Lyuch D.G., 1992)

O gamă largă de surfactanți sunt disponibili pe piață. O parte din ei sunt utilizați ca și surfactanți primari, iar alții ca co-surfactanți. Acești co-surfactanți sunt de obicei amestecați, la un nivel scazut cu surfactanții primari pentru un efect sinergic.

Tabel nr. 2.1. Utilizarea surfactanților în formulările pentru detergenți

2.3. Materii prime utilizate în obținerea surfactanților

2.3.1. Produse naturale

Produsele naturale sunt excelente materii prime pentru fabricarea surfactantilor utilizați în cele mai diverse domenii. În plus prezintă avantajul de a fi regenerabile, netoxice, iar surfactanții obținuți din ele, au o foarte bună degradabilitate.

Două din sursele principale din care provin aceste produse (animală și vegetală) sunt formate în general din grăsimi, uleiuri și hidrați de carbon.

Grasimi și uleiuri

Grasimile și uleiurile care se obțin din surse vegetale cât și animale, sunt formate din esteri rezultați dintr-o moleculă de glicerină și trei molecule de acizi grași – trigliceride. Toate grăsimile naturale conțin acizi primari sau în marea lor majoritate primari, cu număr par de atomi de carbon, în catene liniare.

Hidrații de carbon

Pentru obținerea surfactanților cei mai importanți hidrași de carbon sunt monozaharidele, dizaharidele și polizaharidele.

Produse petrochimice

Joacă un rol important în sinteza surfactanților constituind principalele materii prime pentru aceste sinteze. Cel mai important surfactant anionic, alchibenzensulfonatul de sodiu, se obține numai din materii prime petroliere. O situație asemănătoare se întâlnește și în cazul substanțelor anionice și cationice. Printre produsele petrochimice utilizate ca surse pentru obținerea de surfactanți amintim:

n-alcanii care sunt extrași din fracțiunile de petrol lampant și motorinele de la distilarea țițeiului,

alchene liniare,

alcoolii grași,

liniar alchilbenzenii,

alchilaminele,

etilen oxidul

2.4. Legislația Uniunii Europene privind detergenții

REGULAMENTUL (CE) NR. 48/2004 AL PARLAMENTULUI EUROPEAN ȘI AL

CONSILIULUI din 31 martie 2004 privind detergenții

(Text cu relevanță pentru SEE)

PARLAMENTUL EUROPEAN ȘI CONSILIUL UNIUNII EUROPENE,

având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Europene, în special articolul 95, având în vedere propunerea Comisiei, având în vedere avizul Comitetului Economic și Social European(1), hotărând în conformitate cu procedura prevăzută la articolul 251 din tratat (2), întrucât:

Directiva 73/404/CEE a Consiliului din 22 noiembrie 1973 privind apropierea legislațiilor statelor membre în domeniul detergenților (3), Directiva 73/405/CEE a Consiliului din 22 noiembrie 1973 privind apropierea legislațiilor statelor membre în domeniul metodelor de testare a biodegradabilității surfactanților anionici (4), Directiva 82/242/CEE a Consiliului din 31 martie 1982 privind apropierea legislațiilor statelor membre referitoare la metodele de testare a biodegradabilității surfactanților neionici (5), Directiva 82/243/CEE a Consiliului din 31 martie 1982 de modificare a Directivei 73/405/CEE privind apropierea legislațiilor statelor membre în domeniul metodelor de testare a biodegradabilității surfactanților anionici (6) și Directiva 86/94/CEE a Consiliului din 10 martie 1986 de modificare pentru a doua oară a Directivei 73/404/CEE privind apropierea legislațiilor statelor membre în domeniul detergenților (7) au fost modificate semnificativ de mai multe ori. Din motive de claritate și raț ionalizare, este de dorit să se reformeze dispozițiile în discuție prin cumularea lor într-un text unic. Recomandarea 89/542/CEE a Comisiei din 13 septembrie 1989 (8), privind dispozițiile de etichetare referitoare la detergenți și produse de curățare ar trebui, de asemenea, să fie inclusă în textul unic.

(2) Deoarece, în lipsa unor criterii tehnice comune în întreaga Comunitate, statele membre nu pot să îndeplinească, într-o măsură suficientă, obiectivul prezentului regulament pentru a asigura piața internă cu privire la detergenți și care, prin urmare, se poate realiza mai bine la nivel comunitar, Comunitatea poate să ia măsuri în conformitate cu principiul subsidiarității prevăzut la articolul 5 din tratat. În conformitate cu principiul proporționalității, prevăzut la articolul menționat, prezentul regulament nu depășește ceea ce este necesar pentru îndeplinirea obiectivului menționat. Un regulament reprezintă instrumentul juridic corespunzător, deoarece impune direct producătorilor cerințe precise care trebuie să fie puse în aplicare în același timp și în același mod în întreaga Comunitate; în domeniul legislației tehnice, este necesară o aplicare uniformă în statele membre și acest lucru se poate garanta numai printr-un regulament.

(3) Este necesară o nouă definiție pentru detergenți care să includă utilizările echivalente și să țină seama de evoluțiile la nivelul statelor membre.

(4) Este necesar să se introducă o definiție a agenților tensioactivi, care lipsea din legislația existentă.

(5) Este important să se ofere o descriere clară și precisă a tipurilor relevante de biodegradabilitate.

(6) Pentru a se asigura funcționarea pieței interne și pentru a se evita limitarea concurenței în Comunitate, ar trebui să se ia măsuri referitoare la detergenți.

(7) După cum este stipulat în Carta albă a Comisiei privind strategia pentru o politică viitoare în domeniul substanțelor chimice, ar trebui ca măsurile corespunzătoare referitoare la detergenți săasigure un grad înalt de protecție a mediului, în special a mediului acvatic.

(8) Detergenții intră deja sub incidența anumitor dispoziții comunitare referitoare la producerea și manipularea, utilizarea și etichetarea corespunzătoare a acestora, în special cu trimitere la Recomandarea 89/542/CEE a Comisiei și Recomandarea 98/480/CE a Comisiei din 22 iulie 1998 privind buna practică de mediu pentru detergenții de rufe de uz casnic (1); Directiva 1999/45/CE a Parlamentului European și a Consiliului din 31 mai 1999 privind apropierea actelor cu putere de lege și a actelor administrative ale statelor membre referitoare la clasificarea, ambalarea și etichetarea preparatelor periculoase (2) se aplică detergenților.

(9) Clorura de dimetildioctadecilamoniu (DTDMAC) și nonilfenolul [inclusiv derivații etoxilați-etoxilații alchilfenolului (APEs)] sunt substanțe prioritare care, la nivel comunitar, fac obiectul activităților de evaluare a riscului, în conformitate cu Regulamentul (CEE) nr. 793/93 al Consiliului din 23 martie 1993 privind evaluarea și controlul riscurilor prezentate de substanțele existente (3) și, prin urmare, ar trebui să se recomande și să se pună în aplicare, după caz, strategii adecvate pentru limitarea riscurilor de expunere la substanțele menționate, în cadrul altor dispoziții comunitare.

(10) Sub incidența legislației existente privind biodegradabilitatea agenților tensioactivi din detergenți intră numai biodegradabilitatea primară (4) și această legislație se aplică numai în cazul agenților tensioactivi anionici (5) și neionici (6); prin urmare, ar trebui să fie înlocuită cu o nouă legislație care să pună accentul în principal pe biodegradabilitatea finală și să răspundă preocupărilor referitoare la posibila toxicitate a metaboliților permanenți.

(11) Acest lucru necesită introducerea unui nou set de teste pe baza standardelor EN ISO și a orientărilor OCDE, care să reglementeze acordarea autorizărilor directe pentru introducerea detergenților pe piață.

(12) Pentru a asigura un nivel înalt de protecție a mediului, detergenții care nu îndeplinesc cerințele stabilite de prezentul regulament nu ar trebui să fie introduși pe piață.

(13) La 25 noiembrie 1999, Comitetul științific pentru toxicitate, ecotoxicitate și mediu și-a dat avizul cu privire la biodegradabilitatea agenților tensioactivi din detergenți și la pertinența metodelor de testare utilizate pentru controlul de reglementare în domeniul respectiv.

(14) Cerințele existente referitoare la biodegradabilitatea primară ar trebui să se mențină la un al doilea nivel ierarhic și să se completeze cu o evaluare suplimentară a riscurilor pentru acei agenți tensioactivi care dau rezultate negative la testele de biodegradabilitate finală; în plus, pentru agenții tensioactivi care dau rezultate negative la testele de biodegradabilitate primară nu ar trebui să se elibereze autorizație de comercializare prin derogare.

(15) Cerințele pentru biodegradabilitate primară ar trebui să se extindă la toți agenții tensioactivi, în special la cei cationici și amfoteri, care permit, în același timp, posibilitatea de aplicare a analizelor instrumentale în cazurile în care metodele analitice semi-specifice nu sunt potrivite.

(16) Determinarea metodelor de testare a biodegradabilității și păstrarea listelor de derogări sunt aspecte tehnice și ar trebui să fie revizuite, ținând seama de evoluția tehnicii și științei, precum și de evoluția reglementărilor.

(17) Metodele de testare ar trebui să genereze date care să ofere o asigurare suficientă cu privire la biodegradabilitatea agenților tensioactivi din detergenți.

(18) Metodele de testare a biodegradabilității agenților tensioactivi din detergenți pot să dea rezultate variabile. În aceste cazuri, metodele ar trebui completate de evaluări suplimentare pentru determinarea riscurilor la utilizare continuă.

(19) De asemenea, ar trebui să se stabilească dispoziții referitoare la introducerea pe piață, în cazuri excepționale, a agenților tensioactivi din detergenți care dau rezultate negative la testele de biodegradabilitate finală și acest lucru ar trebui să aibă loc pe baza unor informații pertinente pentru a asigura protecția mediului și de la caz la caz.

(20) Măsurile necesare pentru punerea în aplicare a prezentului regulamentar trebui să fie luate în conformitate cu Decizia 1999/468/CE a Consiliului din 28 iunie 1999 de stabilire a normelor de exercitare a competențelor de executare conferite Comisiei (1).

(21) Este oportun să se amintească de faptul că se poate aplica agenților tensioactivi din detergenți o altă legislație orizontală, în special Directiva 76/769/CEE a Consiliului din 27 iulie 1976 privind apropierea actelor cu putere de lege și a actelor administrative ale statelor membre referitoare la restricțiile de comercializare și utilizare a anumitor substanțe și preparate periculoase (2) prin care ar putea să fie interzise sau limitate comercializarea și utilizarea substanțelor periculoase specificate de prezentul regulament, Directiva 67/548/CEE a Consiliului din 27 iunie 1967 privind apropierea actelor cu putere de lege și a actelor administrative referitoare la clasificarea, ambalarea și etichetarea substanțelor periculoase (3), Directiva 93/67/CEE a Comisiei din 20 iulie 1993 de stabilire a principiilor de evaluare a riscurilor pentru om și pentru mediu prezentate de substanțele notificate în conformitate cu Directiva 67/548/CEE a Consiliului, Regulamentul (CEE) nr. 793/93 și Regulamentul (CE) nr. 1488/94 al Comisiei din 28 iunie 1994 de stabilire a principiilor de evaluare a riscurilor pentru populație și mediu prezentate de anumite substanțe existente; Directiva 98/8/CE a Parlamentului European și a Consiliului din 16 februarie 1998 privind introducerea pe piață a produselor biocide; Directiva 2004/10/CE a Parlamentului European și a Consiliului din 11 februarie 2004 privind armonizarea actelor cu putere de lege și a actelor administrative referitoare la aplicarea principiilor bunei practici de laborator și la verificarea aplicării acestora la testările substanțelor chimice (versiunea codificată); Directiva 2004/9/CE a Parlamentului European și a Consiliului din 11 februarie 2004 privind inspecția și verificarea bunei practice de laborator (BPL) (versiunea codificată); și Directiva 86/609/CEE a Consiliului din 24 noiembrie 1986 privind apropierea actelor cu putere de lege și a actelor administrative ale statelor membre referitoare la protecția animalelor utilizate în scopuri experimentale și în alte scopuri științifice.

(22) Ar trebui să revină producătorilor responsabilitatea de a se abține să comercializeze detergenți care nu respectă prezentul regulament și cea de a pune la dispoziția autorităților naționale dosarele tehnice pentru toate substanțele și amestecurile care intră sub incidența prezentului regulament; același lucru ar trebui să se aplice și în cazul agenților tensioactivi care au dat rezultate negative la testele menționate la anexa III.

(23) Ar trebui ca producătorii să aibă posibilitatea să solicite o derogare de la Comisie, care ar trebui să aibă posibilitatea să acorde o astfel de derogare în conformitate cu procedura menționată la articolul 12 alineatul.

(24) Autoritățile competente ale statelor membre ar trebui să aibă posibilitatea să aplice măsuri pentru controlul detergenților de pe piață, dar ar trebui să evite repetarea testelor efectuate de laboratoarele competente.

(25) Dispozițiile existente pentru etichetarea detergenților ar trebui menținute, inclusiv cele din Recomandarea 89/542/CEE, care sunt incluse în prezentul regulament pentru îndeplinirea obiectivului de modernizare a normelor privind detergenții. Se introduce etichetarea specifică pentru informarea consumatorilor cu privire la substanțele parfumate și conservanții prezenți în detergenți. Personalul medical ar trebui să aibă posibilitatea să obțină de la producător, la cerere, lista completă cu toate ingredientele unui detergent, care să-i ajute în cercetarea unei posibile legături cauzale între apariția unei reacții alergice și expunerea la o anumită substanță chimică, iar statele membre ar trebui să aibă posibilitatea să ceară ca această listă să fie pusă și la dispoziția unui organism public specific, desemnat să ofere aceste informații personalului medical.

(26) Toate punctele menționate anterior fac necesară o nouă legislație care să o înlocuiască pe cea existentă; cu toate acestea, pentru o anumită perioadă, statele membre pot să continue să aplice legislația existentă.

(28) Ar trebui să existe posibilitatea ca detergenții care respect prezentul regulament să fie introduși pe piață, fără a adduce atingere altor dispoziții comunitare relevante.

(29) Pentru a asigura protecția oamenilor și a mediului față de riscurile imprevizibile ale detergenților, este necesară o clauză de salvgardare.

(30) Testele precizate pentru determinarea biodegradabilității agenților tensioactivi ar trebui să se efectueze în laboratoare care respectă un standard recunoscut la nivel internațional, respectiv EN ISO/CEI/17025 sau principiile bunei practici de laborator; nu s-ar justifica solicitarea de a aplica aceasta ultimă cerință pentru agenții tensioactivi existenți, în măsura în care testele disponibile pentru aceștia au fost efectuate înainte de intrarea în vigoare a standardului menționat anterior și încă mai oferă un nivel comparabil al calității științifice.

(31) Comisia ar trebui să examineze aspectele referitoare la biodegradarea anaerobă, biodegradarea componentelor organice, care nu sunt agenți tensioactivi, din detergenți, precum și la conținutul de fosfați, care nu sunt abordate în prezentul regulament și ar trebui să se prezinte Parlamentului European și Consiliului o propunere, dacă este cazul. Până la o viitoare armonizare, statele membre pot să mențină sau să stabilească norme interne referitoare la chestiunile menționate anterior.

(32) Cele cinci directive și recomandarea Comisiei menționate la considerentul (1), care sunt înlocuite prin prezentul regulament, ar trebui să se abroge,

ADOPTĂ PREZENTUL REGULAMENT:

Articolul 1

Obiective și domeniu de aplicare

(1) Prezentul regulament stabilește norme pentru realizarea liberei circulații a detergenților și agenților tensioactivi pentru detergenți pe piața internă, asigurând, în același timp, un grad înalt de protecție a mediului și a sănătății umane.

(2) În acest sens, prezentul regulament armonizează normele prezentate în continuare pentru introducerea pe piață a detergenților și a agenților tensioactivi pentru detergenți:

— biodegradabilitatea agenților tensioactivi din detergenți;

— restricții sau interdicții privind agenții tensioactivi din motive de biodegradabilitate;

— etichetarea suplimentară a detergenților, care să includă parfumurile alergene

și

informațiile pe care producătorii trebuie să le pună la dispoziția autorităților competente și personalului medical din statele membre.

Articolul 2

Definiții

În sensul prezentului regulament:

„Detergent” înseamnă orice substanță sau preparat care conține săpunuri și/sau alți agenți tensioactivi destinați proceselor de spălare și curățare. Detergenții pot fi sub forme diferite (lichidă, pulbere, pastă, bucăți, blocuri, piesă turnată, piesă fasonată etc.) și să se comercializeze pentru uz casnic, în scopuri instituționale sau industriale.

Alte produse care se pot considera detergenți sunt:

— „preparat auxiliar de spălare”, destinat înmuierii (prespălării), clătirii sau albirii hainelor, lenjeriei de uz casnic etc.;

— „balsam pentru rufe”, destinat modificării tușeului țesăturilor în operațiile de completare a spălării țesăturilor;

— „preparat de curățare”, pentru produsele de întreținere domestică de uz general și/sau alte produse de curățare pentru suprafețe (de exemplu, materiale, produse, mașini, instalații mecanice, mijloace de transport și echipamente conexe, instrumente, aparatură etc.);

— „Alte preparate de curățare și spălare”, destinate altor procese de spălare și curățare.

2. „Spălarea” înseamnă curățarea rufelor, țesăturilor, vaselor și a altor suprafețe dure.

3. „Curățarea” este definită de EN ISO 862.

4. „Substanța” înseamnă elementele chimice și compușii acestora în stare naturală sau obținuți prin orice proces de producție, care includ orice aditiv necesar pentru menținerea stabilității produselor și orice impuritate rezultată din procedeul utilizat, dar exclud orice solvent care poate să fie separat fără să afecteze stabilitateasubstanței sau să modifice compoziția acesteia.

5. „Preparatul” înseamnă un amestec sau o soluție compusă din două sau mai multe substanțe.

6. „Agentul tensioactiv” înseamnă orice substanță organică și/sau preparatul organic utilizat în detergenți, care are proprietăți tensioactive și care conține una sau mai multe grupe hidrofile și unasau mai multe grupe hidrofobe de natură și dimensiuni care să facă posibile reducerea tensiunii superficiale a apei și formarea unormonostraturi întinse sau adsorbite la interfața apă-aer, precum și formarea de emulsii și/sau microemulsii și/sau micele și adsorbția la interfețele apă-solid.

7. „Biodegradarea primară” înseamnă modificarea structurală (transformarea) a unui agent tensioactiv de către microorganisme, care conduce la pierderea proprietăților tensioactive ale acestuia datorită degradării substanței de bază și pierderii, în consecință, a proprietății tensioactive determinate prin metodele de testare specificate la anexa II.

8. „Biodegradarea aerobă finală” înseamnă nivelul biodegradării rezultate atunci când microorganismele utilizează agentul tensioactiv în totalitate, în prezența oxigenului, ducând la descompunerea acestuia în bioxid de carbon, apă și săruri minerale ale oricăror altor elemente prezente (mineralizare), determinate prin metodele de testare specificate la anexa III, și noi component celulare microbiene (biomasă).

9. „Introducerea pe piață” înseamnă introducerea pe piața comunitară și prin aceasta punerea la dispoziția unor terțe părți, contra cost sau nu. Importul pe teritoriul vamal comunitar se consideră introducere pe piață.

10. „Producătorul” înseamnă persoana fizică sau juridică responsabilă de introducerea pe piață a unui detergent sau a unui agent tensioactiv pentru un detergent; în special un producător, importator, ambalator care lucrează pe cont propriu sau orice persoană care schimbă caracteristicilor unui detergent sau ale unui etichetarea acestora se consideră a fi producător. Un distribuitor care nu schimbă caracteristicile etichetării sau ambalării unui detergent sau ale unui agent tensioactiv pentru un detergent nu se consideră a fi producător, cu excepția cazului în care exercită o activitate de importator.

11. „Personal medical” înseamnă o persoană autorizată care practică medicina, sau o persoană care-și desfășoară activitatea sub îndrumarea unei persoane autorizate care practică medicina, care oferă îngrijire medicală, pune diagnostice sau administrează tratamente și care trebuie să respecte secretul profesional.

12. „Detergentul industrial și instituțional” înseamnă un detergent pentru spălare și curățare în afara sferei domestice, realizate de personal specializat care utilizează produse specifice.

Articolul 3

Introducerea pe piață

(1) La introducerea pe piață, detergenții și agenții tensioactivi pentru detergenți menționați la articolul 1 se conformează condițiilor, caracteristicilor și limitelor stabilite prin prezentul regulament și anexele la acesta și, după caz, Directivei 98/8/CE și oricărei alte legislații comunitarerelevante. Agenții tensioactivi care sunt și substanțe active însensul Directivei 98/8/CE și care se utilizează ca dezinfectanți sunt exceptați de la aplicarea dispozițiilor din anexele II, III, IV și VIII la prezentul regulament, cu condiția ca:

(a) să fie specificați în lista din anexa I sau IA la Directiva 98/8/CE sau

(b) să fie componente ale produselor biocide autorizate conform Directivei 98/8/CE articolul 15 alineatul (1) sau (2) sau

(c) să fie componente ale produselor biocide autorizate conform măsurilor de tranziție sau a sub rezerva programului de lucru de 10 ani prevăzut la articolul 16 din Directiva 98/8/CE.

În schimb, se consideră că acești agenți tensioactivi sunt dezinfectanți și detergenții în compoziția cărora intră sunt supuși dispozițiilor de etichetare pentru dezinfectanți din anexa VII A.

(2) Producătorii de detergenți și/sau de agenți tensioactivi pentru detergenți sunt stabiliți în Comunitate.

(3) Producătorii sunt responsabili de conformitatea detergenților și/sau a agenților tensioactivi pentru detergenți cu dispozițiile prezentului regulament și ale anexelor la acesta.

Articolul 4

Limitările bazate pe biodegradabilitatea agenților tensioactivi

(1) Conform prezentului regulament, agenții tensioactivi și detergenții ce conțin agenți tensioactivi care îndeplinesc criteriile pentru biodegradarea aerobă finală prevăzute de anexa III se pot introduce pe piață fără alte limitări referitoare la biodegradabilitate.

(2) În cazul în care un detergent conține agenți tensioactivi cu un nivel de biodegradare aerobă finală mai scăzut decât cel stipulat laanexa III, producătorii de detergenți industriali sau instituționali ce conțin agenți tensioactivi și/sau de agenți tensioactivi pentru detergenți industriali sau instituționali pot să solicite o derogare. Solicitările de derogare se fac și se soluționează conform articolelor 5, 6 și 9.

(3) Nivelul biodegradabilității primare se măsoară pentru toți agenții tensioactivi din detergenții care nu dau rezultate corespunzătoare la testele de biodegradare aerobă. Pentru agenții tensioactivi din detergenți cu un nivel de biodegradabilitate primară mai scăzut decât cel stipulat la anexa II nu se acordă derogare.

Articolul 5

Acordarea derogării

(1) Solicitarea derogării de către un producător se face prin trimiterea unei cereri autorității competente a statului membru în cauză, menționată la articolul 8 alineatul și Comisiei, oferind dovezi referitoare la criteriile menționate la articolul 6 alineatul (1). Statele membre pot condiționa solicitarea derogării de plata unei taxe autorității competente a statului membru. Aceste eventuale taxe se percep fără discriminare și nu depășesc costul analizării cererii.

(2) Cererile includ o documentație tehnică care furnizează toate informațiile și justificările necesare pentru evaluarea aspectelor de siguranță referitoare la utilizarea specifică a agenților tensioactivi din detergenții care nu respectă limitele de biodegradabilitate stabilite la anexa III.

Pe lângă rezultatele testelor stipulate la anexa III, documentația tehnică include informațiile și rezultatele testelor stipulate la anexele II și IV. Testele prevăzute de anexa IV, punctul 4 se realizează pe baza unei proceduri în etape. Procedura în etape se definește într-un document de

orientare tehnică ce urmează a fi adoptat în conformitate cu procedura menționată la articolul 12 alineatul (2) până la 8 aprilie 2007. Documentul de orientare menționat mai specifică, după caz, testele la care ar trebui să se aplice principiile bunei practici de laborator.

(3) Autoritatea competentă a statului membru care primește cererile pentru derogare în conformitate cu alineatele (1) și (2) examinează cererile, evaluează conformitatea acestora cu condițiile de derogare și informează Comisia cu privire la rezultate în termen de șase luni de la

primirea cererii complete. În cazul în care autoritatea competentă a statului membru apreciază că

este necesar pentru evaluarea riscului pe care poate să-l provoace o substanță și/sau un preparat, solicită, în termen de trei luni de la primirea cererii, informații suplimentare, verificarea și/sau teste de confirmare referitoare la substanțele și/sau preparatele respective sau la produsele rezultate în urma transformării acestora, pentru care a primit notificări sau informații conform prezentului regulament. Termenul necesar pentru evaluarea dosarului de către autoritatea competentă a statului membru începe să curgă numai după completarea dosarului cu informațiile suplimentare. În cazul în care informațiile solicitate nu sunt oferite în termen de 12 luni, cererea se considerăincompletă și nu mai este valabilă. În acest caz nu se aplică articolul 6 alineatul (2).

În cazul în care se cer informații suplimentare despre metaboliți, ar trebui să se utilizeze strategii de testare în trepte pentru a garanta utilizarea maximă a metodelor de test in vitroși a altor metode de testare care nu utilizează animale.

(4) Pe baza, în special, a evaluării realizate de statele membre, Comisia poate să acorde o derogare conform procedurii menționate la articolul 12 alineatul (2). După caz, înaintea acordării acestei derogări, Comisia procedează la o evaluare suplimentară a elementelor indicate la alineatul (3) din prezentul articol. Comisia decide în termen de 12 luni de la primirea evaluării de la statul membru, cu excepția situației din Decizia 1999/468/CE articolul 5 alineatele (4) și (6), pentru care termenul este de 18 luni.

(5) Aceste derogări pot să permită, să limiteze sau să restrângă în mod serios introducerea pe piață și utilizarea agenților tensioactivi drept componente ale detergenților, în funcție de rezultatele evaluării complementare a riscurilor, definite la anexa IV. Acestea pot să includă o

perioadă de retragere treptată pentru introducerea pe piață și utilizarea agenților tensioactivi drept componente în detergenți. Comisia poate să revizuiască o derogare de îndată ce dispune de informații care să justifice o revizuire semnificativă a documentației tehnice ce însoțește cererea de derogare. În acest sens, producătorul prezintă Comisiei, la cerere, o documentație tehnică actualizată, referitoare la elementele menționate de anexa IV punctul 2. Pe baza acestor informații actualizate, Comisia poate să decidă prelungirea, modificarea sau revocarea derogării. Alineatele (1)-(4) și (6) din prezentul articol și articolul 6 se aplică mutatis mutandis.

(6) Comisia publică lista agenților tensioactivi pentru care s-a obținut derogare, împreună cu condițiile sau limitările de utilizare corespunzătoare, conform anexei V.

Articolul 6

Condiții pentru acordarea derogării

(1) În cazul în care Comisia ia în considerare acordarea unei derogări, aceasta procedează conform procedurii menționate la articolul 12 alineatul (2) și pe baza criteriilor următoare:

— utilizarea mai degrabă în aplicații slab dispersive, decât în aplicații puternic dispersive;

— utilizarea numai în aplicații industriale și/sau instituționale specifice;

— riscul pentru mediu sau pentru sănătate, prezentat de volumul de vânzări și de modul de utilizare în întreaga Comunitate este scăzut în comparație cu avantajele socio-economice, inclusiv siguranța alimentelor și standardele de igienă.

(2) Atât timp cât Comisia nu hotărăște cu privire la o cerere de derogare, introducerea pe piață și utilizarea agentului tensioactiv în cauză pot continua, cu condiția ca producătorul să poată prezenta dovezi că agentul tensioactiv se utiliza deja pe piața comunitară la data intrării în vigoare a prezentului regulament și că cererea de derogare s-a făcut în termen de doi ani de la data respectivă.

(3) În cazul în care Comisia refuză acordarea unei derogări, o face în termen de 12 luni de la primirea evaluării, menționate la articolul 5 alineatul (3), de la un stat membru, cu excepția cazului în care se aplică articolul 5 alineatele (4) și (6) din Decizia 1999/468/CE, când termenul este de 18 luni. Se poate stabili o perioadă de tranziție în care să se procedeze la o retragere treptată de pe piață și din uz a agentului tensioactiv în cauză. Perioada de tranziție este de maxim doi ani de la data hotărârii Comisiei.

(4) Comisia publică la anexa VI lista agenților tensioactivi identificați că nu respectă prezentul regulament.

Articolul 7

Testarea agenților tensioactivi

Toate testele menționate la articolele 3 și 4 și la anexele II, II, IV și VIII se realizează conform standardelor menționate de anexa I.1 și conform cerințelor de testare prevăzute la articolul 10 alineatul (5) din Regulamentul (CEE) nr. 793/93 . În acest sens, este suficient să se aplice fie standardul EN ISO/CEI, fie principiile bunei practici delaborator, cu excepția acelor teste pentru care principiile bunei practice de laborator au devenit obligatorii. Pentru agenții tensioactivi utilizați în detergenții care au fost introduși pe piață înainte de intrarea în vigoare a

standardului menționat anterior, se pot accepta, de la caz la caz, testele existente care s-au realizat cu utilizarea celor mai bune cunoștințe științifice disponibile și după un standard comparabil cu cele menționate laanexa I. Producătorul sau statul membru poate să prezinte Comisiei orice caz asupra căruia există îndoieli sau un diferend. Atunci se ia o decizie conform procedurii stabilite la articolul 12 alineatul (2).

2.5. Biodegradabilitatea surfactanților

Prin biodegradabilitatea surfactanților se înțelege descompunerea lor biochimică în prezența unor microorganism.

În considerațiile actuale de evaluare ecologică a surfactanților, biodegradabilitatea si toxicitatea ecologică sunt deosebit de importante. Biodegradabilitatea se basează pe capacitatea microorganismelor de a distruge prin oxidare în condiții natural a surfactantului care trebuie să fie suficient de mare pentru a se elimina proprietățile nedorite cum ar fi spumarea si toxicitatea pentru fauna subacvatică.

Biodegradabilitatea se masoară prin cantitatea de oxigen dizolvat consumat în digestia aerobă a unui produs organic de o cultură de microorganism. Din punct de vedere al evaluării practice a biodegradării succesive, surfactanții se impart în:

– total biodegradabili (degradare 100%), cu transformarea lor în material minerale (CO2, H2O, Na2SO4) inofensive pentru mediul ambient.

– biodegradabili (degradare > 80%)

– neobiodegradabili (degradare <80%) (Avram R, et all, 2004)

Consumul biochimic de oxigen este cantitatea de oxigen consumată de microorganism într-un interval de timp, pentru descompunerea biochimică a substanțelor organice conținute în apă.

Conținutul în oxygen dizolvat, este un parametru foarte important de calitate a unei ape, deoarece oxigenul are o importanță vitală pentru plantele și animalele acvatice.

3. MUTAGENEZA

Termenul de mutație a fost dat de Hugo de Vries, în 1901, în urma analizei unor noi forme de Oenothera lamarckiana. Deși a analizat un fenomen diferit (el a observat rezultatul segregării, ci nu al mutației), noțiunea nouă elaborată de acesta a rămas în genetică și desemnează orice modificare în secvența de nucleotide din ADN, care nu este consecința recombinării genetice și care este permanentă și ereditară. Procesul prin care apare o mutație se numește mutageneză.

Mutația este o schimbare în secvența nucleotidelor dintr-o regiune a genomului. Multe mutații sunt punctiforme, ceea ce presupune înlocuirea unei nucleotide cu alta. Mutațiile punctiforme se împart în trei categorii:

Tranzitorii care presupune schimbări de la o nucleotidă purinică la o altă purină sau la o pirimidină la alta.

Transversii care produs schimbări de la purine la pirimidine sau invers.

Alte mutații apar de la introducerea sau eliminarea uneia sau a mai multor nucleotide. Mutațiile rezultate fie de la erorile în replicarea ADN-ului sau cauzate de efectele mutagenilor cum ar fi chimicalele și radiațiile, care reacționează cu ADN-ul și schimbă structura nucleotidelor individuale. Toate celulele posedă enzime ADN-reparatoare, care au rolul să reducă numărul mutațiilor care apar.

Mutațiile pot avea efecte dramatice în celulele în care se produc, o mutație într-o genă „cheie” poate duce la sinteza unei proteine „defecte”, care ar putea produce moartea celulei. Toate acțiunile mutagene care nu au efect letal, au potențial de a contribui la evoluția genomului, iar ca aceasta să se întâmple, trebuiesc moștenite când organismul se reproduce.

La organismele multicelulare (bacterii, drojdii) toate aberațiile genomului care nu sunt letale sau corectate sunt moștenite de celulele fiice și devin trăsături permanente în linia descendenței a celulei respective, în care alterația s-a produs. În organismele multicelulare, doar acele evenimente care apar în celulele germinate sunt relevante în evoluția genomului

Mutațiile sunt determinate de agenți mutageni fizici (radiații neionizante, radiații ionizante), agenți mutageni chimici (aditivii alimentari, pesticide, acidul azotos, hipoxantina,etc) și agenți mutageni biologici (virusurile și micoplasmele).

Clasificarea mutațiilor:

După cantitatea de material genetic afectată, mutațiile pot fi:

mutații genice care afectează întreaga genă, o parte din ea sau doar o singură nucleotidă (mutație punctiformă) și generează în populație gene alele (gene sălbatice). Ex: Polidactilie, Sindactilie, Sindromul Marfan, Albinismul, Anemia falciformă, Guta, Hemofilia, Daltonismul.

mutații cromozomale produc remanieri ale cromozomilor prin rearanjarea unor segmente în stuctura lor. În funcție de tipul de cromozomi pe care se instalează, sunt autozomale sau heterozomale. Ex: Cri du chat.

mutații genomice, care afectează întreaga cantitate de material genetic a unei celule. Fregvența cu care apar acestea este mai mare și sunt de mai multe feluri (aneuploidia, pseudoaneuploidia, autopoliploidia, alopoliploidie). Ex: Sindromul Patau, Sindromul Edwards, Sindromul Down.

După tipul de celule afectate, mutațiile se clasifică în:

mutații spontane, când sunt generate de erori de copiere în cursul replicării ADN-ului și care „scapă” de funcția de autocorecție a ADN-polimerazelor.

mutații induse, când sunt determinate de agenți mutageni fizici, chimici sau biologici; ele se pot produce în mod natural sau artificial în diferite scopuri de cercetare fundamentală sau aplicativă.

După efectele fenotipice pe care le produc, există:

mutații neutre, atunci când afectează regiunile necodificatoare ale ADN-ului și nu se exprimă în fenotip.

mutații expresive când apar în regiunile codificatoare și care, după manifestarea lor în fenotip pot fi: dominante, recesive, benefice, patogene (care pot fi la rândul lor letale, semiletale și viabile).

După materialul genetic afectat, mutațiile sunt:

nucleare, când afectează materialul genetic nuclear.

extranucleare sau citoplasmatice, când afectează materialul genetic extranuclear din mitocondrii sau cloroplaste.

După sensul de desfășurare a modificării se cunosc mutații:

progresive (directe) sau înaintate, când mutația generează o noutate față de gena normală, de tip ”sălbatic”.

de reversie sau back mutațion, când un genotip mutant revine la tipul normal, sălbatic.

După modificarea produsă în secvența de nucleotide a ADN-ului, se deosebesc:

substituția, care reprezintă înlocuirea unui singur nucleotid și este o mutație punctiformă.

delecția sau inserția (adiția) unui multiplu de trei nucleotide se soldează cu lipsa sau adăugarea unui aminoacid în catena polipeptidică.

remanieri cromozomale, care la rândul lor pot fi de mai multe feluri:

duplicația – segmentul cromozomal este în dublu exemplar și este însoțit de alungirea cromozomului,

inversia – se schimbă ordinea genelor într-un cromozom, datorită ruperii unui segment cromozomal și realipirii lui, după o rotație de 180°,

translocație – constă în asocierea unui segment dintr-un cromozom la capătul unui cromozom neomolog, ca urmare a modificării prin mutație a telomerelor. Poate fi reciprocă sau nereciprocă.

deleția sau pierderea unui segment cromozomal poate fi terminală sau interstițiară.

fuziunea sau fisiunea centromerică (translocații robertsoniene), ce se soldează cu pseudoaneuploidii,

lacune cromozomale (gap) fie pe o singură cromatidă a unui cromozom, fie pe ambele.

În ultimii ani a apărut și s-a dezvoltat o nouă ramură a geneticii care se ocupă cu mutageneza mediului. Ea își propune să testeze potențialul mutagen, cancerigen și teratogen al diferiților factori cu care omul vine în contact.

Unele îngrășăminte chimice, erbicide, fungicide, insecticide, unii aditivi alimentari, unele substanțe chimice produse în industrie, poluanții atmosferici, ai solului și acvatici, etc., cu care omul vine direct sau indirect în contact, pot afecta aparatul genetic celular. Este bine cunoscut cazul medicamentului thalidomida, care a determinat, prin foloirea lui de către femeile însărcinate, unele fenomene teratogene puternice la copiii nou-născuți.

Ținând seama de multitudinea factorilor din mediu, inclusiv din alimentație, capabili să afecteze materialul genetic celular, testarea privind capacitatea lor mutagenă, cancerigenă și teratogenă ocupă în prezent un loc important în protecția sănătății omului și a mediului ambiant. (Petre Raicu,1980)

Genomul fiecărui individ, indiferent de nivelul la care se află pe scară evolutivă, suferă numeroase și variate leziuni, spontane sau induse de agenți externi sau interni. Însă, frecvența exprimării în fenotip a acestor leziuni este menținută la un nivel scăzut, prin intervenția unor sisteme de recunoaștere a leziunilor ADN și reparare enzimatică. Chiar dacă nu au o eficiență absolută, performanța acestor sisteme este ridicată. La nivel molecular, mijloacele de apărare sunt de natură ereditară să sunt procese reparatorii ce corectează:

greșeli în procesul de replicare a ADN-ului.

Greșeli de încorporare sau de includere

Greșeli de împerechere, ce apar în timpul formării punților de hidrogen dintre nucleotidele de pe catena matriță și nucleotidele inserate pe bază de complementaritate în catena nouă. Cele mai frecvente greșeli sunt G-T.

În cazul secvențelor repetate, poate să apară fenomenul de ”alunecare” a ADN-polimerazei.

Depurinizarea este o greșeală care apare foarte rar, prin slăbirea legăturilor N-glicozidice dintre baza azotată purinică și dezoxiriboză.

Leziuni induse în structura ADN-ului de către agenți mutageni. Aceste leziuni pot fi corectate printr-un proces reparator, chiar înainte ca acestea să se fi exprimat în fenotip. Doar când aparatul enzimatic de reparare este ineficient, aceste modificări genetice se exprimă și devin vizibile în fenotip.

Leziuni ce constau în baze azotate, modificate după replicare. Acest tip de leziuni sunt reparate prin trei mecanisme: BER (Base Excision Repaire), NER (Nucleotid Excision Repaire) și repararea directă monoenzimatică prin intervenția enzimei metilguanin-metil-transferaza MGMT.

Leziuni ce constau în rupturi mono- sau bicatenare ale ADN-ului. (Barbu Vasilica, 2008)

Agenti mutageni chimici

Mecanisme de mutageneza induse de surfactanți

Surfactanti anionici

Administrarea orală și expunerea dermica a săpunurilor prezintă efecte carcinogenice grave. Prin administrarea orală la șobolani de oleat de sodiu în concentrație de 2,5% și 5% în băuturi timp de 108 săptămâni nu a indus tumori.

LAS sunt rapid absorbiți în tractul gastrointestinal în urma administrării pe cale orală. Se absorb încet la nivelul pielei, dar provoacă iritații la nivelul acesteia, precum și la nivelul ochilor și mucoaselor membranare. Potențialul mutagen a fost testat folosind tulpini de Salmonella typhimurium folosind testul Ames. În aceste studii LAS nu a fost mutagen. Studiile disponibile nu prezintă semne de carcinogenitate. (Helle Buchardt Boyd, 2001)

AS dacă sunt administrați pe cale orală se absorb rapid în tractul gastrointestinal. De asemenea poate pătrunde în cantitate minimă prin piele. Sunt metabolizați diferit în funcție se specie, rezultand acidul sulfat-4-butiric. AS și metaboliții săi sunt eliminați în primul rând prin urină și foarte puțin prin materiile fecale. Într-un studiu de mutageneză șobolanii au fost hrăniți cu 1,13 si 0,56% AS amestecat cu hrană timp de 90 de zile. Acest tratament nu a provocat abateri cromozomale în celulele maduvei osoase. Studii de mutagenitate efectuate pe Salmonella typhimurium (testul Ames) nu au indicat efecte mutagene ale AS. Touși studiile disponibile pe animalele de laborator (șoareci și șobolani) sunt insuficiente pentru a evalua potențialul carcinogen produs de AS. Cu toate acestea la animalele cărora li s-a administrat AS în concentrație de până la 4% pe cale orală nu a existat nici un indiciu de risc crescut de cancer.

În studiile de mutageneză, s-au administrat șoarecilor 1,13 și 0,56 % C12AS timp de 90 de zile. Acest tratament nu a cauzat aberații cromozomiale in celulele maduvii osoase. Studiile realizate pe Salmonella typhimurium (testul Ames) nu a avut efecte mutagenice. În studiile realizate pe animale, administrându-se AS în concentrație de 4% nu a indicat creșterea riscului de cancer. (Helle Buchardt Boyd, 2001)

AES sunt ușor absorbite în inestin la șobolani dar și la om, după administrare orală. Si nu sunt indicații că ar prezenta risc cancerigen.

Studii realizate pe șobolani care au primit 300 mg SAS/kg greutate corporală/zi pe cale orală, timp de 45-90 de zile nu au relevat efecte adverse. Similar șobolanii hraniți cu 0,5% SAS timp de 91 de zile, nu au prezentat nici un simptom advers. Nu au fost nici indicații de risc crescut de cancer prin administrare orală de SAS. Efecte carcinogenice nu au fost observate după ce s-a administrat la nivel cutanat. (Helle Buchardt Boyd, 2001)

SAS sunt absorbiți rapid la nivelul tractului gastrointestinal la șobolani după administrarea orală. Metaboliții rezultați în urma metaboliării SAS sunt eliminați prin urină. Studiile realizate pe șobolani în urma administrării a 300 mg SAS/ kg timp de 45-90 de zile nu au relatat efecte adverse. SAS nu prezintă risc de cancer dupa ingerare.

AOS se absorbe lent la nivelul tractului gastrointestinal. În funcție de concentrația utilizată poate irita pielea. Aceasta putând tolera până la 1% AOS. Toxicitatea și potențialul mutagenic a fost testat timp de 2 ani pe șobolani cărora li s-a administrat în dietă 0,1, 0,25 și 0,5 % AOS. Nu s-au observat efecte clinice și șobolanii nu au fost afectați de acet tratament. Examinarea histologică a organelor nu au prezentat nici o urmă de toxicitate în urma tratamentului. Rezultate negative s-au obținut si în urma studiilor realizate pe Salmonella. (Helle Buchardt Boyd, 2001)

Surfactanti ionici

În general, AE sunt ușor absorbite prin piele de către cobai și șobolani și prin mucoasa gastro-intestinală de șobolani. AE sunt eliminate rapid din organism prin urina, fecale, și aer expirat. AE dozat oral a fost absorbit rapid și extensiv la șobolani, și mai mult de 75% din doză a fost absorbită când se aplică pe piele la om; dozele au fost absorbit lent și incomplet (50% în 72 de ore). Jumătate din suprafața absorbită a fost eliminată prompt în urină și cantități mai mici de AE apărut în fecale și aerul expirat. Nu au existat dovezi de mutagenitate cand a fost testat în cadrul testului Ames. Răspunsul mutagen a fost investigat pe tulpini de Salmonella typhimuriumde evaluându-se capacitatea lor de a induce perechi de bază de substituție și mutații.

S-a demonstrat că FAA (soluție de cocoamide DEA) a fost un iritant moderat la iepuri. În produsele care intră în contact direct cu pielea concentrația de cocoamide DEA nu trebuie să depășească 5%. Concentrații mici precum 0,6% sunt grav iritante pentru ochi. Mai multe FAA au fost testate in teste de genotoxicitate pe termen scurt. Nu s-au observat daune genetice. Lau-ramida DEA a fost testată și nu a demonstrat activitate mutagenă la Salmonella typhimurium sau în celule embrionare de hamster. Cocoamide DEA nu este mutagenă la testarea pe tulpini de Salmonella typhimurium cu sau fără activare metabolică. (Helle Buchardt Boyd, 2001)

Surfactanti cationici

Cateva studii cu referire la absorbția surfactanților cationici au indicat ca se realizează în cantități mici prin piele. Absorbția subcutanată a ATMAB-ului în soluție 3% a fost ușoară și corespunde cu 0,6% din cea aplicată în decursul a 72 de ore. O parte din cantitatea de surfactant absorbită se elimină prin urină. (0,33% din cantitatea administrată în primele 24 de ore).

Iritația pielei depinde de concentrația de surfactant utilizată. O soluție cu aproximativ 0,1% surfactant cationic este rar iritantă. Concentrațiile cuprinse între 1,0% și 10,0% sunt cu adevărat iritante. ATMAC este iritant la o concentrație de 2,5%. ARMAC testat pe Salmonella typhimurium nu a prezentat efecte mutagene și genetice.

DADMAC, au proprietăți ecotoxice și toxicologice favorabile. Nu induce transformări în celulele in vitro. Potențialul mutagenetic a fost testat și pe tulpini de Salmonella typhimurium, având ca rezultat lipsa anomaliilor mutagene.

EQ a fost testat pe șoareci și șobolani în doze orale de 5000 mg/kg greutate corporală, în urma testelor nu a rezultat nici o reacție toxică. În urma aplicării testului Ames EQ nu au arătat efecte mutagene și nici mutații cromozomiale. (Helle Buchardt Boyd, 2001)

Surfactanții amfoterici

Majoritatea surfactanților amfoterici sunt absorbiți în mare parte și sunt eliminați prin transpirație. Nu se acumulează în organism. Cocoamidopropyl betaine testată pe Salmonella typhylurium cu testul Ames nu a prezentat efect mutagen.

Alchilamfoacetații prezintă o toxicitate acută scăzută după ingerarea orală la șobolani. Aceștia nu provoacă iritație la nivelul pielei. Nu prezintă efecte mutagenetice. (Helle Buchardt Boyd, 2001)

II. Studiu experimental

Materiale și metode

3.1. Obținerea materialului biologic

3.2. Reactivi utilizați

3.3. Echipamente utilizate

3.4. Metoda rapidă de colorare cu soluția carmin-acetică a cromozomilor în mitoză la Allium cepa L. (2n=16)

3.5. Determinarea indicelui mitotic și a indicelui de genotoxicitate

3.6. Prelucrarea și interpretarea statistică a datelor

3.7. Biodegradabilitatea surfactanților

Reactivi

În lucrările practice de citogenetică vegetală se folosesc mai ales specii de plante cu cromozomi de dimensiuni mari și în număr relativ mic. Pentru evidențierea cromozomilor, în celulele aflate în diviziune mitotică, am folosit țesuturile meristematice din zona de creștere a rădăcinilor de ceapă – Allium cepa L. (2n = 16)

Radicelele se obțin după 2-3 zile prin ținerea bulbului de ceapă într-un pahar cu apă, astfel ca numai discul să pătrundă în lichid. La temperatura camerei, rădăcinile ating lungimea de 10-15 mm și pot fi detașate.

La proba martor s-au urmărit etapele mitozei utilizând radicele obținute direct în apă ultrapură. Aceste rezultate au fost comparate cu cele obținute prin studiul radicelelor crescute prin imersia discului bulbului de ceapă în soluție cu surfactant, imersarea radicelelor de ceapă în diferite concentrații de surfactant.

Prefixatori Soluție apoasă de colchicină 0,5%

Într-un balon cotat de 100 ml se dizolvă 0.5 g colchicină și adăugăm apă distilată până la semn. Rolul colchicinei este acela de a inhiba polimerizarea monomerilor de tubulină în care sunt constituite fibrele fusului de diviziune deci blochează diviziunea în etapa în care aceasta se găsește ușurând vizualizarea la microscop.

Fixator nuclear – fixator Carnoy (6 părți alcool etilic absolut: 3 părți cloroform : 1 parte acid acetic glacial) Fixatorul Carnoy are rolul de a omorî celulele, în starea în care se află în acel moment și de a coagula constituenții celulari, fără a modifica structura internă și externă a celulelor. Prin fixare, biocoloizii celulei se coagulează, constituenții celulari putându-se colora cu diferiți coloranți.

Coloranți: Soluție carmin acetică

Din carmin se prepară soluția carmin acetică astfel: 55 ml apă distilată la 100ºC, 45 ml acid acetic glacial și 0,5 g carmin. Amestecul se pune într-un balon de sticlă, se agită și se așează în bain-marie, lăsându-se să fiarbă câteva minute. Se agită din nou și se lasă să se răcească; se filtrează și se adaugă câteva cristale de acetat de fier (cu rol de mordant), ce se dizolvă încet în soluție, excesul depunându-se la baza vasului. Se păstrează la întuneric și la rece (la frigider).

Soluția carmin-acetică acționează de asemenea în zona meristematică din vârful radicelelor de ceapă, iar celulele aflate în diviziune se colorează în roșu închis.

Surfactanți

Lauril sulfat de sodiu – surfactant anionic

Tabel nr. 2. Caracteristici generale ale surfactantului anionic lauril sulfat de sodiu

Cocamidopropil betaină – surfactant amfoteric

Tabel nr. 3. Caracteristici generale ale surfactantului amfoteric cocamidopropil betaină

Alchilpoliglicozide – surfactant neionic

Tabel nr. 4. Caracteristici generale ale surfactantului neionic alchilpoliglicozide

Ustensile de laborator si echipamente

Sticlărie: pahare Berzelius, flacoane, lame, lamele, pipete gradate, pipete Pasteur;

Instrumentar: pensete, lame, bisturie, hârtie de filtru;

Echipamente:

Microscop optic cu contrast de fază la care am realizat fotografierea preparatelor.

Componentă optică vizualizare P Kruss Model MBL 2000

Metode

Metoda rapidă de colorare cu soluție carmin-acetică a cromozomilor în mitoză

Metoda a fost elaborată în 1926 de către Belling (cf. Tudose, 1967) și se bazează pe faptul că acidul carminic se comportă ca un colorant acid în soluție alcalină și se încarcă negativ, iar în soluție acidă, ca un colorant bazic, încărcându-se pozitiv. Această metodă este des folosită în studiile de citogenetică vegetală, deoarece este ușor de efectuat, necesitând un timp scurt.

Materialul biologic, sticlăria, instrumentarul și reactivii utilizați sunt identici cu cei folosiți în cazul metodei Feulgen. Deosebirea constă în colorantul utilizat în locul reactivului Schiff și anume carminul care este un colorant natural extras din femelele homopterului Coccus cacti.

Etape de lucru

Prefixarea

Prefixarea materialului biologic lipsește, sau poate fi efectuată la fel ca la metoda Feulgen cu soluție de colchicină 0.2% sau 0.5%.

Fixarea

Fixarea nu este obligatorie; se poate realiza în fixator Carnoy preparat în varianta alcool etilic absolut : acid acetic glacial (3 : 1), timp de 2 – 12 ore, sau cu alt fixator. Dacă nu se continuă lucrul, materialul poate fi păstrat la rece, în fiole cu alcool 70%, bine închise.

Hidroliza și colorarea

Hidroliza și colorarea se efectuează simultan, în soluția carmin-acetică. Într-o sticlă de ceas sau o capsulă de porțelan, se pun 3 – 5 ml colorant carmin acetic, peste materialul de studiat (radicelele de 10 – 15 mm lungime). Pentru realizarea hidrolizei se adaugă câteva picături (10 – 15) de HCl 1N; se încălzește 20 – 25 min. la flacăra unui a unui bec de gaz, evitând fierberea și agitând, până când materialul capătă culoarea roșu închis, devine moale și se lasă la baza vasului.

Efectuarea preparatelor temporare rapide (metoda squash)

Preparatele microscopice rapide se obțin prin etalarea vârfului colorat al rădăcinii (de preferință o porțiune de 1-2 mm), pe o lamă de microscop curată și degresată (prin spălarea lamelor în amestecuri oxidante speciale folosite în lucrările de citologie, în alcool etilic 96%, sau în spirt sanitar, urmate de o bună ștergere cu o bucată de tifon, înaintea efectuării preparatului), într-o picătură de solutie carmin- acetic.

În prealabil, vârful colorat al rădăcinii se poate trece printr-un cristalizor cu apă. Așezând deasupra vârfului detașat al rădăcinii o lamelă și ținând cu un deget o latură a lamelei, se etalează preparatul prin bătăi ritmice și sistematice în lamelă, cu un băț de chibrit, pentru dispunerea celulelor într-un singur strat și etalării cromozomilor în celule. Eliminarea excesului de soluție și desăvârșirea dispersării celulelor și a cromozomilor se realizează cu ajutorul unei hârtii de filtru, apăsând cu degetul mare peste lamelă, fără a o mișca. Pentru a împiedica împrăștierea cromozomilor și pentru o bună fixare a celulelor pe lamă, se recomandă ungerea acesteia înaintea executării preparatului cu albumină glicerinată. Lama unsă este trecută cu partea uscată deasupra unei flăcări, evitând coagularea albuminei glicerinate.

Cu cât etalarea se efectuează mai bine, cu atât preparatul este mai bun, prezentând cromozomii bine dispersați și individualizați. Trebuie evitată deplasarea lamelei pe lamă în timpul etalării, fapt ce duce la alunecarea celulelor și la compromiterea parțială sau totală a preparatului. După etalare, între lamă și lamelă, trebuie să se observe cu ochiul liber un strat foarte fin de material celular colorat în violet.

Preparatele astfel obținute, se pot observa la microscop imediat după efectuare, timp de câteva ore, deoarece la lumină și la temperatura camerei, colorantul va dispersa în citoplasmă.

Examinarea preparatelor la microscopul optic

Examinarea preparatelor se efectuează în lumină puternică, cu folosirea unui filtru verde, care mărește contrastul între cromozomi și citoplasmă. Se recomandă ca observarea să înceapă cu obiectivul 10x, apoi, se schimbă obiectivele 20x, 40x și chiar 90x (cu imersie în ulei de cedru).

3.2. Rezultate si discuții

3.3. Concluzii

Bibliografie

Nicolae Voiculeț, Liliana Puiu, (1997), Biologia moleculară a celulelor, Ed. BicAll Arl.

Liviu Gavrilă, Ion Dăbală, (1975), Genetica diviziunii celulare, Ed. Dacia Cluj-Napoca.

Constantin Cotrutz, Carmen Cotrutz, Maria Kocsis, Cezar Radu Ionescu, (1994), Manual de lucrari practice de biologie celulara, Ed. Tehnica.

M. Anghel, I. Anghel, I. Popescu, E. Stoica, (1981), Lucrari practice de biologie vegetala, Ed. Didactica si pedagogica, Bucuresti.

Ion Anghel, (1979), Citologie vegetala, Ed. Didactica si pedagogica Bucuresti.

Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Maetin Raff, Keith Roberts și Peter Walter, (2002), Molecular biology of the cell, Ed. New York Garland Science,

Stela-Gabriela Jelea, Marian Jelea, (2007), Citologie, histology, embriologie, Ed. Universitații de Nord Baia Mare

James Schooley, (1997), Introduction to botany, Ed. Delmar Publishers.

Edgar Hartsuiker și J. Kohly „Meiosis” Ion Dăbală și L. Gavrilă, (1975), Genetica diviziunii celulare, Editura Dacia Cluj Napoca.

http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/biobk/BioBookmeiosis.html

T.A.Brawn, (2008), Genomes 3, Editura Garland Science, New York and London

Vasilica Barbu, (2008), Principii de genetică, Galați University Press.

Petre Raicu, Doina Duma, Bogdan Stugren, Nicolae Coman, Flofica Marascu, (1980), Biologie-genetică și evoluționism, edidura Didactică și pedagogică, R.A. București.

Helle Buchardt Boyd, Torben Madsen, Dorthe Nylén, Anne Rathmann Pedersen, Gitte I. Petersen and Flemming Simonsen, Environmental and Health Assessment of Substances in Household Detergents and Cosmetic, Environmental Project Miljøprojekt No. 615/2001

Leca M, Florescu S., Detergenți și detergență, ed. Academica Română, București 2003

Avram Radu, Călinescu Ioan, Lambrache Papahagi, Lupu Angela, Iliuță Ion, Cgipurici Petre, Surfactanți- Sinteze, ed. Didactică și pedagogică, București, 2004

Merretting-Bruns U., Jelen E., Anaerobic biodegradation of the detergent durfactants, Fraunhofer UMISICHT, Oberhausen, Germanz, 2003

Painter H.A., Anionic surfactants. In the Handbook of environmental chemistry, Berlin, Heidelberg Germanz, 1992

Bothing R.S., Lyuch D.G., Quaternarz amonium Surfactants, Berlin, Heidelberg, Germanz, 1992,vol.3.

AISE/CESIO: Role of surfactant in hausehold detergents and cleaning products, July 2003

Regulamentul (CE) Nr. 48/2004 Al Parlamentului European și al Consiliului din 31 martie 2004 privind detergenții