Activitatea Enzimatica a Laptelui

CAPITOLUL 4

Parte experimentala

În lucrarea de față s-au studiat factorii care influențează activitatea enzimatică a laptelui si s-au determinat caracteristicilor fizico-chimice și organoleptice ale tipurilor de lapte analizate: densitatea, aciditatea, vâscozitatea, pH-ul, indicele de peroxid, de iod, conținutul de proteine și cel de grăsime.

Pentru a studia influența pH-ului și a temperaturii asupra activității enzimei s-a marit cantitatea de enzimă existatentă în lapte,introducând diferite cantității de catalază (0,5 mL, 1 mL și 1,5 mL), pentru a observa modifcările care se produc odată cu creșterea cantității de enzimă.

4.1. Caracteristicile organoleptice ale laptelui

Lucrarea prezintă caracteristicile organoleptice a două tipuri de lapte (vacă și capră), în stare crudă și respectiv tratat termic. În tabelul 4.1. sunt prezentate caracteristicile organoleptice ale laptelui studiata.

Tabelul 4.1. Caracteristicile organoleptice ale laptelui supus analizei

În continuare s-au determinat caracteristicile fizico-chimice ale tipurilor de lapte analizate:

4.2. Determinarea densității

Gerneralității

Densitatea este o proprietate fizică a laptelui și reprezintă masa unității de volum la 20ºC, exprimată în g/cm3.

Densitatea depinde de conținutul de substanță uscată; scade cu cât conținutul de grăsime este mai ridicat și crește prin smântânirea laptelui.

Densintatea laptelui, materie primă se face cu ajutorul picnometrului.

Mod de lucru

Înainte de întrebuințare picnometrul se curăță perfect prin spălare cu amestec sulfocromic, apoi cu apă distilată . Apoi apa se îndepărtează prin spălare cu alcool și eter, după care se usucă în curent de aer sau etuvă.

Operația următoare este determinarea cifrei de apă a picnometrului, care reprezintă masa volumului de apă distilată, la temperatura de 20°C, conținut de picnometru.

Pentru determinarea cifrei de apă se cântărește picnometrul curat și uscat la balanța analitică, cu o precizie de 0,0002 g rezultând m1- masa picnometrului gol, curat și uscat, în grame.

Apoi se umple picnometrul cu apă distilată proaspăt fiartă și răcită la 20°C. Se ține în termostat la 20°C timp de 30 minute. Se scoate picnometrul din termostat , se îndepărtează excesul de apă ieșit prin dop , cu ajutorul unei fâșii de hârtie de filtru, se șterge din nou și se cântărește la balanța analitică. Astfel se obține m2 – masa picnometrului cu apă distilată , la 20°C în grame.

Cifra de apă ( m ) se obține scăzând masa picnometrului gol din masa picnometrului cu apă distilată.

Pentru a determina densitatea laptelui, după ce picnometrul se spală și se usucă, se umple cu lichidul de cercetat, se pune cu grijă dopul apoi se termostatează la 20°C timp de 30 de minute . După termostatare se scoate picnometrul și respectând regulile prezentate mai sus se șterge și se cântărește la balanța analitică. Astfel se va obține m3 – masa picnometrului cu produs la 20°C în grame.

În continuare am calculat densitatea pentru fiecare tip de lapate.

m1 = 24,8121

m2 = 76,2238

m3 = 77,7380 (lapte de vacă crud)

m3 = 77,5334 (lapte de vacă pasteurizat)

m3 = 77,0255 (lapte de capră crud)

m3 = 76,8956 (lapte capră pasteurizat)

Tabel 4.2. Densitatea leptelui studiat

În urma măsurării densității se observă că laptele crud are o densitatea mai mare în comparație cu cel pasteurizat, în special laptele de vacă crud. Literatura de specialitatea prezintă o densitatea de 1,027 atât pentru laptele de vacă cât și pentru cel de capră, după cum se observă laptele de vacă studiat are o densitate mai apropiată de standard decât cel de capră.

4.3. Determinarea acidității

Aciditatea laptelui este dată de amestecul de acizi liberi și de săruri cu reacție acidă și constituie un indicator al prospețimii laptelui. Laptele proaspăt muls are o reacție ușor acidă, dar aciditatea acestuia crește în timp ca urmare a fermentației microbiene a lactozei și transformării ei în acid lactic.

Aciditatea laptelui poate fi apreciată rapid prin anumite reacții calitative (proba fierberii, proba cu alcool), iar cantitativ prin metoda titrării (metodă standardizată).

Aciditatea laptelui se exprimă în grade Thörner (ºT) care reprezintă numărul de mililitri de soluție hidroxid de sodiu 0,1N necesar pentru neutralizarea a 100 ml de lapte în prezența fenolftaleinei ca indicator.

Determinarea acidității prin titrare

Aciditatea se determină prin titrare cu soluție alcalină de NaOH până la neutralizarea probei de lapte în prezența fenolftaleinei ca indicator.

Modul de lucru

Într-un pahar Erlenmeyer se introduc 10 ml de lapte, se adaugă 20 ml de apă distilată cu aceeași pipetă cu care s-a măsurat laptele și 3-4 picături de fenolftaleină. Amestecul se titrează cu soluție de hidroxid de sodiu 0,1N, agitând mereu până la apariția unei colorații roz deschise care nu dispare timp de 1 minut.

Unde, V este volumul de NaOH 0,1 N folosit al titrare.

V = 1.8 (lapte vacă crud)

V= 2 (lapte vaca pasteurizat)

V = 1,9 (lapte de capră crud)

V = 1,9 (lapte de capră pasteurizat)

Tabel 4.3. Aciditatea laptelui studiat

Ca urmare a măsurării acidității laptelui s-a observat că lapte de vacă crud are aciditatea cea mai scăzut în timp ce laptele de vacă pasteurizat prezintă aciditatea cea mai ridicată 20ºT. În comparație cu literatura de specialitate care prezintă o aciditate de 15-19 ºT la laptele de vacă și maxim 19ºT la cel de capră se observă că toate tipurile de lapte se încadrează între limite mai puțin laptele de vacă pasteurizat care are o aciditate mai mare.

4.4. Determinarea vâscozității

Toate lichidele reale au proprietăți particulare, reflectate inclusiv în faptul că au coeficienți de vâscozitate diferiți.

În lucrarea de față se va determina vâscozitatea laptelui cu ajutorul vâscozimetrului Hoppler.

Modul de lucru

Se introduce lichidul de masurare, în cazul nostru laptele, în tubul vîscozimetrului, se intruduce bila și se răstoarnă tubul aparatului, cronometrând timpul de cădere al sferei între reperele A și C. Cronometrul se declanșează în momentul când privind reperul A dintr-o poziție în care inelul de pe cilindru se vede ca o singură linie, partea inferioară a sferei atinge reperul A și se oprește atunci când partea inferioară a sferei atinge reperul C.

Vâscozitatea lichidelor se va determina cu ajutorul relației:

Unde:

ƞ – vâscozinatea kg/m3

k = constanta bilei, 0,007

ρ1 = densitatea bilei, 2,2.

ρ2= densitatea laptelui

Lapte de vacă crud

t = 6,2 min =372s; ρ= 1,0294

Lapte pasteurizat de vacă

t = 3,49 min =229s; ρ= 1,0254

Lapte de capră crud

t = 5,19 min = 319s; ρ = 1,0155

Lapte de capră pasteurizat

t = 4,54 min = 294s; ρ = 1,0130

Tabelul 4.4. Vâscozitatea laptelui

După măsurarea vâscozității se observă că laptele de vacă crud prezintă valoarea cea mai mare, 3,048 kg/m3, iar valoarea cea mai mică am obținut-o la cel de vacă pasteurizat, 1,882kg/m3. Literatura de specialitate spune că laptele are vâscozitatea între 1,74 și 2,4 și după cum se observă în tabelul 6.2.4. singurul lapte care se încadrează între aceste valori este laptele de vacă pasteurizat. Valoarea vâscozității laptelui în literatura de specialitate la temperatura de 20ºC, este de 2 Centipoise, față de 1 la apa.

4.5. Determinarea pH-ului

Laptele proaspăt muls de la animale sănătoase are pH-ul 6,5 – 6,8, indicând o reacție slab acidă, datorită disocierii parțiale a diferitelor săruri conținute (fosfați, citrați). Scăderea treptată a pH-ului sub această limită indică un proces de acidifiere. Când pH-ul laptelui atinge valoarea de 4,6 – cazeina precipită (punct izoelectric). Determinarea pH-ului se poate faceelectrometric, cu ajutorul pH-metrului, sau colorimetric, cu soluție sau cu hârtie indicatoare.

În industrie se folosesc pH-metre cu electrozi de construcție specială, pentru determinarea pH-ului laptelui direct în bidoane, vane, tancuri, precum și pentru determinarea directă a pH-ului în produse finite (brânzeturi, unt).

Tabelul 4.5. pH-ul laptelui supus analizei

Laptele de vacă crud prezintă pH-ul cel mai acid în timp ce laptele de capră pasteurizat are pH-ul cel mai putin acid, 6,75. Literatura de specialitate spune ca pH laptelui de vacă este de aproximativ 6,6 iar a celui de capră 6,48.

4.6. Determinarea indicelui de peroxid

Indicele de peroxid reprezintă cantitatea de substanțe din monstra (exprimată în miliechivalenți de oxigen activ la kilogram) care oxidează iodura de potasiu în condițiile de lucru descrise.

Principiu

Mostra sub formă de soluție într-un amestec de acid acetic și cloroform se tratează cu o soluție de iodură de potasiu. Iodul eliberat se titrează cu o soluție de tiosulfat de sodiu.

Mod de lucru

Pentru determinare se cântărește 1g probă (lapte) și se dizolvă într-un amestec de 3,6 cm3 acid acetic și 2,4 cm3 cloroform, într-un vas conic cu dop șlefuit. Se adaugă o soluție proaspăt preparată dintr-un gram de iodură de potasiu și 0,2 cm3 apă și se agită puternic. După un minut, se adaugă 6 cm3 apă și 0,4 cm3 soluție de amidon și se titrează cu o soluție de tiosulfat de sodiu.

În paralel se efectuează o probă de control al reactivilor, trecând prin toate fazele analizelor aceeași reactivi ca la proba de analizat, luați în aceeași cantității.

Calcul: indicele de peroxid se exprimă în miliechivalenți de peroxid pe kg de produs și se calculează cu formula:

Unde:

V2 = volumul soluției 0,01n de tiosulfat de sodiu folosit la titrarea probei de analizat, în cm3;

V1 = volumul soluției 0,01n de tiosulfat folosit la titrarea probei de control al reactivilor, în cm3;

n = normalitatea soluției de tiosulfat de sodiu;

m = masa probei luate pentru determinare, în grame.

Volumul soluției de tiosulfat folosit la titrarea probei de control al reactivilor este:

Tabelul 4.6. Indicele de peroxid al laptelui studiat la diferite intervale de timp

Valorile sunt cu atât mai ridicate cu cât grăsimea conține o proporție mai mare de acizi grași nesaturați, în timp se înregistrează un declin datorită scindării peroxizilor în compuși secundari de oxidare.

4.7. Determinarea indicelui de iod

Generalități

Indicele de iod reprezintă gradul de nesaturare al uleiurilor și grăsimilor și se exprimă în grame de iod absorbit de 100 g produs.

Principiul metodei

Proba de analizat se titrează cu soluție de tiosulfat de sodiu 0,1 n până la culoarea galben-pai.

Mod de lucru

Se cântărește 1g probă, se dizolvă în 4 mL cloroform și se adaugă 5 mL soluție alcoolică de iod 0,1N într-un flacon cu dop rodat de 300 mL. Flaconul se închide și se ține la întuneric timp de 30 minute, agitând din când în când. Se adaugă 3 mL KI, 2 mL apă și se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,1N până la colorația galben deschis. Se adaugă 0,4 mL amidon și se continuă titrarea, agitănd puternic până la decolorare.

În paralel se efectuează determinarea cu o probă martor.

Indicele de iod se calculează conform relației:

În care:

Ii = indicele de iod

V2 = volumul soluției de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei de analizat, în mL;

V1 = volumul soluției de tiosulfat 0,1N folosit la titrarea probei de control al reactivilor, în mL;

m = masa probei luate în lucru;

0,01269 = numărul de grame de iod corespunzător la 1 mL tiosulfat de sodiu 0,1N.

Rezultate:

V1 = 2,1 mL

Tabelul 4.7. Indicele de iod al laptelui analizat

Valoarea cea mai mare a indicelui de iod am obținut-o pentru laptele de vacă crud, iar cea mai joasă este reprezentată de laptele de capră pasteurizat.

4.8. Determinarea proteinelor

Primul pas pentru determinarea proteinelor din lapte este acela de a realiza digestia probelor analizate astfel:

Pentru digestie se folosește sistemul Kjeldahl alcǎtuit din:

Un aparat Turbo THERM;

Un Turbosorg;

Vapodest 20 s, aparatele sunt produse de firma Gerhardt .

În primul tub se introduce proba martor alcǎtuitǎ din 20 ml acid sulfuric 98%, catalizatorul (5g K2SO4 +0,5g CuSO4) și 1 pastila antispumare;

În urmatoarele tuburi se introduc 1-1,2 g de proba de analizat (sau 10 ml lapte), 20 ml acid sulfuric 98%, catalizatorul (5g K2SO4 +0,5g CuSO4) și 1 pastila antispumare.

Se pornește aparatul pentru a realiza digestia care dureaza 1 ora. În urma mineralizării substanțelor organice la cald cu acid sulfuric concentrat, azotul grupărilor aminice trece în sulfat de amoniu. Dupǎ rǎcirea probelor se adaugǎ încet 50 ml apǎ distilatǎ peste fiecare probǎ, apoi se ia pe rǎnd fiecare tub de digestie Kjeldatherm și se introduce în conul Viton al aparatului Vapodest. Lângǎ conul din Viton pe suport se așeazǎ un pahar Erlenmayer, în care se gǎsesc 65 ml acid boric 4% si 2-3 picǎturi de indicator mixt. Dupa distilare conținutul paharului Erlenmayer se titreaza cu HCl 0,1 N pana la virajul indicatorului.

Conținutul de azot total din lapte și produse lactate se calculeazǎ cu formula:

Unde:

CHCl – concentratia HCl folosit

V – volumul de HCl folosit la titrarea probei de analizat

Vb – volumul de HCl folosit la titrarea probei blank

m (g) – masa de substanta supusa digestiei

Pe baza relației de obținere a concetrație azotului se poate determina și conținutul de proteine, folosind relatia:

Tabelul 4.8. Conținutul de proteine al laptelui studiat

Ca urmare a măsurării conținutului de proteine se observă că laptele de capră crud are conținutul cel mai mare de proteine, în timp ce laptele de vacă pasteurizat are conținutul cel mai mic. În studiile de specialitate conținutul de proteine din lapte este între 2,50-3,96% pentru laptele de vaca și 3,7-5,0% pentru laptele de capră și după cum se observă laptele studiat se încadrează între limitile indicate.

4.9. Determinarea grăsimii

Principiul metodei

Proba se încălzește cu acid clorhidric sau sulfuric pentru separarea fazelor, iar substanțele grase se extrag cu parafină și se dozează gravimetric.

Mod de lucru

Se cântărește circa 5g probă și se introduce într-un vas conic de circa 200 ml, se adaugă 20mL acid clorhidric și două-trei picaturi de soluție de metiloraje pe baie de apă la fierbere până la separarea netă a fazelor.

Conținutul paharului se trece cantitativ într-o pălnie de separare, spălând paharul cu 50 mL eter de petrol care se adaugă tot în pălnia de separare. Se adaugă 50 mL apă, se agită pentru extracția glicerinei în apă și se lasă să se separe straturile.

Soluția apoasă se trece cantitativ într-o pălnie de separare, iar soluția eterică se supune la extracții repetate cu apă, până la reacția neutră. Soluțiile apoase unite în aceeași pălnie de separare se spală cu 50 mL eter de petrol, iar după separarea straturilor se unesc soluțiile eterice din cele două pălnii.

Soluțiile astfel obținute se filtrează printr-o hârtie de filtru cu porozitate medie, tratată, trecând întăi soluția eterică și spălând hârtia de filtru cu eter de petrol, apoi soluția apoasă care s-a prins separat.

Soluția eterică se filtrează apoi peste sulfatul de sodiu anhidru prin hârtie de filtru cu porozitate mare, într-un pahar uscat. Filtrul se spală cu tere de petrol, care s-a prins în același balon. Eterul de petrol seevaporă încălzind balonul pe baie de nisip, iar rezidul se usucă în etuvă la 150ºC timp de 30min, apoi se cântărește.

Conținutul de substanțe grase totale se exprimă în procente și se calculează cu formula:

În care:

m1 = masa rezidului după uscare, în g;

m = masa probei luate pentru determinare, în g.

Tabelul 4.9. Conținutul de grăsime al laptelui studiat

În urma analizei se observă că laptele crud de vacă are conținutul cel mai mare de grăsime, în timp ce laptele de capră pasteurizat care conținutul cel mai mic în grăsime. Conform literaturii de specialitate conținutul de grăsime din lapte variază între 3,02 și 5,44, deci toate cele patru tipuri de lapte se încadrează între limitele de specialitate.

4.10. Determinarea substanței uscate

Toate substanțele alimentare conțin apă și substanță uscată în diferite cantității în funcție de produs. Apa prin prezența ei influențează calitatea produsului, detreminarea conținutului de apă și de substanță uscată se face cel mai adesea prin uscarea la etuvă.

Metoda constă în măsurănd capsula care conține proba (cu o precizie de 0,0002) înainte ca aceasta să fie introdusă la etuvă timp de 30 de minte la o temperatura de 103±2ºC și după, iar conținutul de substanță uscata se va determina cu următoarea formulă:

Unde:

m1 = masa capsulei cu capac și probă înainte de uscare;

m2 = masa capsulei cu capac și proba uscată;

m = masa capsulei goale cu capac.

Tabelul 4.10. Substantele uscate din laptele analizat

În literatura de specialitate conținutul de substanță uscată este între 10,5 și 13,5%, după cum se observă laptele studiat se încadrează între aceste limite, mai puțin laptele de vacă pasteuriat care are conținutul cel mai mic în substanță uscată.

4.11. Influenta factorilor asupra activității enzimei

Pentru a studia factorii care influențează activitatea enzimatică a laptelui, am marit doza de enzimă existentă în acesta și am efectuat studii asupra influentei temperaturii si a pH-ului. Enzima utilizată este catalaza extrasă din drojdie.

4.11.1. Extracția catalazei

Catalaza este o enzimă din clasa oxido-reductazelor, răspăndintă în majoritatea microorganismelor aerobe, în ceulele animalelor și ale plantelor superioare.

Mod de lucru

Se iau 10g de produs ce conține catalază (drojdie), bine marunțit sau mojarat, se trece intr-un cilindru gradat de100mL cu apă distilată, se adaugă câteva picături de toluen și se aduce la semn; se omogenizează bine și se lasă la temperatura camerei timp de 30 minute și se agită de câteva ori.

După expirarea timpului, se filtrează prin filtru cutat într-un vas de sticlă curat și uscat, după care din extract se iau probe pentru efectuarea determinărilor.

4.11.2. Influența pH-ului

Metoda are la bază determinarea produsilor de hidroliză rezultați în urma acțiunii preparatului enzimatic asupra unui substrat (cazeină, hemoglobină sau altă proteină).

Mod de lucru

Se iau într-un balon Erlenmeyer 10 mL lapte, 10 mL apă distilată și 5 mL extract enzimatic. După omogenizare se prelevează imediat 10 mL din amestecul de reactiv (proba martor) se adaugă 5mL formol neutralizat, 3picături de fenoftaleină și se titrează cu hidroxid de sodiu 0,01N până la colorația roz pal.

Amestecul râmas se termostatează la temperatura de 37-40ºC timp de o oră. După care se iau 10mL din amestecul termostatat, se adaugă 5mL formol neutralizat, 3picături de fenoftaleină și se titrează cu hidroxid de sodiu 0,01N până la colorația roz pal.

Făcând diferența dintre volumul de hidroxid de sodiufolosit la titrarea probei termostatate (Ve) și volumul de hidroxid de sodiu folosit la titrarea probei netermostatate (Vm) aflăm volumul de hidroxid de sodiu corespunzător aminoacizilor eliberați de enzimă.

Activitatea enzimei proteolitice se exprimă convențional prin cantitatea de glicocol eliberată de enzimă timp de o oră din 100g cazeină, de cître un ml extract enzimatic în conditiile de lucru date.

Unde:

t – titrul solutiei de hidroxid de sodiu în raport cu glicocolul, gl, 0,01.

d – diluția efectuată, 0.25 mL;

C – cantitatea de preparat enzimatic luat în analiză, în ml sau g;

În urma calculării activității am obținut următoarele rezultate:

Tabelul 4.11. Activitatea catalazei la diferite valori ale pH-ului

Din rezultatele obținute în urma determinării activității catalazei am observat că la pH 6,71 catalaza are activitatea cea mai mare, iar valoarea cea mai mică o are la pH 6,47.

4.11.3 Influența temperaturii

Pentru a determina influența temperaturii asupra activității enzimatice am mărit temperatura laptelui și am calculat activitatea catalitică după relația folosită la punctul anterior.

Tabelul 4.12. Influența temperaturii asupra activității catalazei

Rezultatele din tabelul 4.12. arată că activitatea catalazei, în toate cele patru cazuri, este maximă la temperatura de 20ºC. La temperaturi scăzute activitatea catalazei este minimă, aceasta crescănd odată cu creșterea temperaturii, până la o temperatură medie de aproximativ 20ºC, dar la temperaturi ridicate de peste 50ºC enzima se denaturează și iși pierde din activitate.

4.11.4 Inflența enzimei asupra conductivității

Conductivitatea electrică este mărimea fizică prin care se caracterizează capacitatea unui material de a permite transportul sarcinilor electrice atunci când este plasat într-un câmp electric. Simbolul folosit pentru această mărime este de obicei σ (litera grecească sigma), iar unitatea de măsură estesiemens pe metru (S·m−1).

Cu ajutorul conductometrului am citit conductivitate alaptelui cu diferite concentrații de enzime.

Tabelul 4.13. Conductivitatea laptelui [ns]

În urma măsurării conductivității laptelui cu ajutorul conductometrului s-a observat că odată cu creșterea cantității de enzimă din lapte scade capacitatea de transfer al sarcinilor electrice din lapte. Capacitatea cea mai mare de transfer o are laptele de capră crud, 5,98ns în timp ce laptele de vacă pasteurizat are valoarea ceamai inferioară 4,20 ns.

4.11.5. Influența enzimei asupra indicelui de refracție

Indicele de refracție este raportul dintre viteza de propagare a radiatiilor luminoase sau a undelor în mediul în care provin și viteza de propagare în mediul în care pătrund. Aflarea indicelui de  refracție se bazează pe proprietățile potice ale lactoserumului, obținut după extragerea grăsimilor și proteinelor.

Tabelul 4.14. Indicele de refrație al laptelui analizat

În urma măsurării indicelui de refracție s-a constatat că laptele de vacă pasteurizat are indicele cel mai mare, în timp ce laptele de capră crud are valoarea ce mai mică.