Aspecte Genetice In Apoptoza

1. Introducere

1.1 Scurt istoric al studiilor asupra apoptozei

Moartea celulară este un element necesar în decursul vieții unui organism multicelular, îndeplinind numeroase funcții.

Prima descriere a apoptozei în decursul dezvoltării embrionare a fost realizată de Vogt1 în 1842, iar primul studiu integrativ care a propus conceptul de “apoptoză” a fost realizat de către Kerr2 în 1972, care a observat recurența fenomenului în timpul proliferării celulare sau în situații patologice.

Numeroși cercetători au propus termeni diferiți pentru a descrie fenomenul, cum ar fi anoikis, degenerare, autoliză, cromatoliză, sinucidere celulară (vezi Majno și Jolis, 1995)3, fapt care se datorează modelelor diferite de cercetare.

Dacă înainte de precizarea terminologică termenul de “necroză” era utilizat ca un termen general pentru a descrie toate tipurile de moarte celulară, astăzi el este folosit cu un conținut limitat la dezintegrarea pasivă a celulei, diferită de distrugerea voluntară, programată a acesteia. Pe parcursul acestei lucrări voi folosi termenul de “moarte celulară programată” (MCP) ca fiind similar celui de “apoptoză”.

Analiza in vivo diferitelor tipuri de moarte celulară non-necrotică a arătat existența unor trăsături comune, indiferent de originea celulei sau stimulul utilizat.

Cu toate acestea, studiile in vitro au evidențiat diferențe în expresia proceselor sau inexistența unor trăsături tipice în anumite cazuri. De pildă, utilizarea staurosporinei pentru a induce apoptoză generează distrugerea celulei fără formarea corpilor apoptotici, probabil datorită acțiunii inhibitorii asupra unor kinaze implicate în apoptoza normală .4

De asemenea, metamorfoza insectelor diferă în anumite privințe de tipul descris ca universal 5, iar în anumite cazuri când apoptoza este genetic imposibilă, distrugerea capătă o expresie diferită 6.

1.2 Necroza vs. Apoptoza

Despre diferențele dintre necroză și apoptoză până s-a scris o literatura bogata, accentuându-se caracterul voluntar, controlat și dinamic al apoptozei, sau diferențele morfologice caracteristice fiecărui proces în parte. 1

Există însă unele procese ce împărtășesc cu apoptoza multe trăsături dar cărora le lipsesc altele caracteristice acesteia, sau care încalcă modelul descris ca fiind tipic. 2

S-a observat recurența necrozei în urma acelor procese de leziune celulară brutală, cum ar fi atacul a numeroși agenți fizici sau chimici, hipoxia, toxinele, infecțiile, fiind acceptat rolul necrozei în răspunsul generat la adresa unor agenți patogeni și importanța procesului imflamator. 3

Unele dintre elementele necrotice distinctive sunt scăderea ATP citosolic, datorită creșterii permeabilității membranare, disfuncția unor canale cationice, degradarea fosfolipidelor și creșterea calciului intracitoplasmatic. 4

Are loc prin urmare dilatarea reticulului endoplasmatic, degradarea membranelor mitocondriale și modificarea activității translaționale.

În a doua fază necrotică se declanșază o degradare accentuată a membranelor celulare și a organitelor, hidratarea mitocondriilor și apariția unor agregate dense și bogate în lipide.

Dacă în apoptoză celula în restrânge în mod treptat volumul, în necroză are loc un proces invers; cromatina apare agregată haotic, fiind împrăștiată aleatoriu. 5 Celulele devin eozinofile, iar citoplasma este vacuolizată; degradarea finală a organitelor nu este urmată de apariția unor structuri similare corpilor apoptotici.

În apoptoză, modificarea volumului celular se realizează prin pierderea de apă și ioni, nu însă și de macromolecule, membranele rămânând relativ intacte; apar “cute” 6 la suprafața plasmalemală, iar organitele rămân nedigerate până la final. Condensarea cromatinei este ordonată, are loc fragmentarea și condensarea sa în mase compacte distincte la nivelul laminei celulare.

Caracteristica definitorie este fără îndoială formarea corpilor apoptotici și activarea programului fagocitar, ceea ce nu declanșază inflamația.

Procesul apoptotic este controlat genetic, în etape distincte, fiind declanșat ireversibil după depășirea unui “punct critic” 7, iar sinteza proteică nu cunoaște un moment similar celui “catastrofic” necrotic. În acest caz sunt activate endonucleazele (calciu și magneziu dependente și care sunt inhibate de către Zn) care fragmentează ADN la nivelul fragmentelor linker, rezultând fragmente de 180 – 200 perechi de baze 8.

La celulele anucleate apoptoza urmează același scenariu, chiar în absența degradării nucleare.

Apoptoza necesită sinteza unor proteine cu rol apoptotic și ca urmare nu se produce o dezorganizare rapidă a procesului.

Recent s-a descoperit că procesul sintetic este inhibat prin distrugerea factorului 4G eucariotic 9, ceea ce nu afectează sinteza proteinelor cu funcție prooncogenă de tip c – myc care necesită un segment intern de atașare ribozomal (IRES) localizat la segmentul 5’ reglator.

Pentru a sintetiza, apoptoza este caracterizată de următoarele trăsături: 10

membranele plasmatice rămân intacte, formând însă cute;

reducerea volumului celular ;

condensarea cromatinei la periferia nucleului, ce devine picnotic;

fragmentarea ADN si a nucleului;

distrugerea structurilor membranare;

vacuolizarea citoplasmei;

formarea corpilor apoptotici.

1.3 Funcțiile apoptozei

Acest proces nu este numai unul de “curățare”, ci și unul de construcție, având un rol hotărâtor în dezvoltare.

Apoptoza intervine în modelarea unor structuri (formarea unor cavități) 1, eliminarea celulelor redundante (neuronii motori ai vertebratelor), sau în turnover-ul tisular normal. 2

De asemenea, apoptoza are o funcție esențială în menținerea homeostaziei tisulare, cum ar fi cazul hematopoiezei, menținând un echilibru între proliferare și eliminare. 3

Prin apoptoză sunt îndepărtate celulele sistemului imunitar care recunosc antigenele self, celulele imunitare activate inutile, clonele care generează anticorpi anti-self, si celulele T care nu recunosc CMH sau cele cu mare afinitate pentru antigenele self. 4

Limfocitele T pot fi distruse în manieră Fas-independentă sau Fas-dependentă.

Apoptoza reprezintă un mecanism fundamental de protecție a organismului în cazul infecției virale, când mecanismul de atac preferat al virusurilor este sinteza proteinelor cu funcție antiapoptotică, cum ar fi LPM 1 sau LPM 2, în cazul virusului Epstein – Barr 5, sau proteina Tat care blochează apoptoza, în urma infecției cu HIV 6.

Alteori virusurile modifică proteina cu rol proapoptotic, pentru a favoriza diseminarea.

La fel se întâmplă în cazul infecțiilor bacteriene, însă în timp de virusurile au mecanisme eficiente de inhibare a apoptozei pentru a iniția propria replicare, bacteriile au nevoie de supraviețuirea celulelor infectate.

Apoptoza este necesară și în procesul de eliminare a celulelor cu rol imflamator, după îndeplinirea funcției. 7

Mecanismele apoptotice nefunctionale duc la apariția tumorilor, dar, dată fiind importanța procesului, o vom trata într-un capitol separat. 8

Apoptoza este implicată în numeroase maladii dintre care cităm :

Boli neurodegenerative: Alzheimer, Parkinson, scleroză laterală amiotrofică, degenerescență cerebrală;

Sindrom mielodisplazic;

Infarct miocardic.

1.4 Trăsături generale ale apoptozei

1.4.1 Apoptoza în cazul celulelor nucleate.

Putem clasifica trăsăturile apoptozei în esențiale și neesențiale. Cea mai importanță trăsătură a celui de-al doilea tip este modificarea de la nivelul nucleului, deoarece apoptoza are loc în aceeași formă și în celulele anucleate (Jacobson, 1994, Osthoff, 1994)1. Asemenea trăsături sunt clasificate ca “postmortem”, putând fi absente în anumite cazuri, și au loc după “punctul de neîntoarcere” (point of no return).

În 1966 Tata2 a observat faptul că apoptoza necesită ARN și sinteză proteică, ceea ce a subliniat faptul că acest proces este unul activ, dinamic, iar recurenta unor trăsături comune a generat speculația că procesul apoptozei este reprezentat de catre o cale biochimică unică 3 fapt ce a fost întărit de descoperirea existenței acelorași principii de organizare si în cazul C. elegans și al omului.

Dar faptul care a generat o teorie unificată despre apoptoză a fost descoperirea caspazelor, care au fost identificate în toate organismele, mai puțin în drojdii, fiind identificate insa și unele mecanisme apoptotice ce nu necesită existența lor.

Ipoteza originală a fost aceea că apoptoza constă in primul rand în distrugerea citoscheletului de către caspază, ceea ce a fost infirmat ulterior. (Martin 1995) .4

1.4.2 Dinamica citoplasmatică

Schimbările sunt predominant biochimice, nu morfologice, cu excepția dispariției microvililor ce are loc în urma activării caspazelor și concomitent cu defosforilarea ezrinelor si a radixinelor care stabilizează microvilii prin interacțiunea cu actina.

Schimbările plasmatice cele mai evidente sunt datorate semnalelor fagocitice adresate celulelor înconjurătoare, ceea ce va activa ultima etapă a apoptozei. 5

1.4.3 Schimbări la nivelul formei și structurii

În timpul apoptozei, celula își modifică forma, distrugând relațiile cu vecinii, iar la suprafața membranei apar anumite cute (blebs) precedând formarea corpilor apoptotici.

La nivelul citoplasmei apar uneori vacuole, proces ce urmează distrugerii citoscheletului, in distrugerea acestuia un eveniment fundamental constituiindu-l activarea caspazelor, care distrug direct gelsolina, fodrina, actina sau Gas 2 (Kotha-Kota, Martin, Mashima). 6

La soarecii knok-out pentru caspaza 3 apoptoza hepatocitelor și timocitelor prezintă o formare mai redusă a cutelor, lucru observat și în cazul unei linii celulare derivate dintr-un cancer mamar uman. Dacă tratăm celulele cu proteinază K, cutele se formează în mod normal, iar adăugarea inhibitorilor caspazici anihilează această formare, ceea ce evidențiază rolul caspazelor.

Distrugerea citoscheletului 7 nu e haotică, ci organizată, ea necesitând actina, care formează o structură asemănătoare unui cerc la periferie, și gelsolina modificată, soarecii K.O. pentru gelsolină – având o formare mai întârziată a cutelor.

Odată declanșată de activarea caspazei 3 formarea acestora e inevitabilă, chiar dacă sunt adăugați inhibitori caspazici.

La nivelul miozinei au loc fosforilări pa lanțul ușor de către MLCK (miosin light chain kinase), care determină o nouă interacție actină – lanțul ușor al miozinei. 8

Reorganizarea citoscheletului necesită numeroase kinaze: MAP kinaza ce fosforilează hs27 1, (II). Pak 2 ce activează p 21, în urma actiunii caspazelor (III). SLK, Ste-20 kinaza, care e clivată de caspaza 3 și care rearanjează citoscheletul. Pak 2 e implicată în formarea corpilor apoptotici, iar din moment ce acest proces este inhibat de citocalasina B, probabil ca e implicată și actina F.

Apariția vacuolelor depinde de activarea caspazelor, o proteină implicată fiind rabaptina 5 care afectează membrana celulară.9

1.4.4 Schimbări la nivelul organitelor citoplasmatice

Distrugerea acetora este tardivă, schimbări mai pronunțate apărând la nivelul RE 10 care se dilată și pierde ribozomii atașați, iar proteina integrală Bap 31 de leagă de Bcl 2 și pro-caspaza 9, fiiind distrusa de către caspaze. Clivarea rabaptinei 5 va afecta fuziunea endozomilor și va dezorganiza metabolismul. Daca sunt translocate caspaze sau numai factori activati de catre acestea ramane de stabilit, in prezent ambele tabere avand argumente pro si contra.

Clivarea laminelor A și B are loc la început, însă caspazele nu distrug proteinele direct , ci prin intermediul altor molecule care au funcție specială în apoptoză. 11

Distrugerea ADN se realizează la nivelul unor segmente 200 – 300 Kpb, iar proteinele numite ICAD/CAD/DFF45/DFF 40 au un rol important în fragmentare, existând în formă inactivă ca dimeri, DFF 40 fiind complexat de DFF 45 proteină chapperone. 12

DFF 45 e clivată de către caspază și e eliberat DFF 40 care realizează tăieturi dublu catenare, mai ales 10 care se dilată și pierde ribozomii atașați, iar proteina integrală Bap 31 de leagă de Bcl 2 și pro-caspaza 9, fiiind distrusa de către caspaze. Clivarea rabaptinei 5 va afecta fuziunea endozomilor și va dezorganiza metabolismul. Daca sunt translocate caspaze sau numai factori activati de catre acestea ramane de stabilit, in prezent ambele tabere avand argumente pro si contra.

Clivarea laminelor A și B are loc la început, însă caspazele nu distrug proteinele direct , ci prin intermediul altor molecule care au funcție specială în apoptoză. 11

Distrugerea ADN se realizează la nivelul unor segmente 200 – 300 Kpb, iar proteinele numite ICAD/CAD/DFF45/DFF 40 au un rol important în fragmentare, existând în formă inactivă ca dimeri, DFF 40 fiind complexat de DFF 45 proteină chapperone. 12

DFF 45 e clivată de către caspază și e eliberat DFF 40 care realizează tăieturi dublu catenare, mai ales in segmentul de legătură dintre nucleosomi.

Șoarecii trasgenici cu defecte în CAD au o fragmentare incoerentă, iar tratamentul celulelor cu caspază duce la condensarea cromatinei dar procesul e inhibat in urma tratamenului cu DFF 45.

Recent a fost izolată o proteină numită Acinus 13 care e activată de către caspază și care induce fagocitoza corpilor apoptotici si acest lucru se realizează atât in cazul fagocitelor cât și in cel al celulelor nespecializate (de exemplu celulele epiteliale).

Distrugerea celulei se face pe o cale lizozomală în primul rând în celula apoptotică prin autofagie, fiind descrisă o proteină beclina, care se leagă de Bcl 2 și e implicată în fagocitoză.14

Alteori corpii apoptotici sunt digerați de către celulele vecine pe cale lizozomală.

1.4.5. Mitocondria

Dincolo de funcția apoptotică a mitocondriei datorită Bcl 2, unele modificări apar la nivelul membranei externe care e ruptă în urma umflării matrixului, ulterior apărând fenomenul de condensare.15 Există momentan o dezbatere privind implicarea mitocondriei în apoptoză, ideea acceptată de catre majoritatea comuniatii stiintifice a primatului ei în activarea caspazelor fiind contestată de actre o minoritate cu solide argumente in spate. Li Hu de la Burnham Institute a identificat un tip de “receptor nuclear” care părăsește nucleul și intră în mitocondrie, eliberând citocromul c.

A. Marchenko (Stony Brook) a identificat un mecanism similar în cazul p 53, care se poate localiza la nivelul mitocondriei generând o apoptoză mai rapidă.

Alții au subliniat influențele tipurilor de modele de cercetare asupra rezultatelor, studiile pe C. elegans sugerând o activare caspazică independentă de modificarea permeabilității mitocondriale.

H. Steller a arătat că p 53, un inhibitor caspazic al unor virusuri, previne apoptoza în retina unor insecte au o structură asemănătoare retinis pigmentosa, ceea ce susține ideea acțiunii caspazelor înaintea acțiunii mitocondriei.

1.4.6 Nucleul

Trăsătura inițială o constituie condensarea periferica a cromatinei, iar ulterior apare fragmentarea nucleului și dezintegrarea sa datorită degradării ADN și a proteinelor nucleare. 16

Caspazele 3 și 6 atacă proteinele nucleare, cum ar fi lamine, proteinele scaffold, si DFF 45 ( Inhibitor DNA fragmentating factor/ ICAD).

Nucleul este distrus și integrat în corpii apoptotici; un alt factor implicat în apoptoză, AIF, declașază apoptoza independent de caspaze și determină condensarea parțială a cromatinei.

1.4.7 Reglarea volumului celular

Acesta nu este un mecanism pasiv, 17 pierderea volumului celular din timpul apoptozei în opoziție cu mecanismul necrotic de umplere, unde membrana plasmatică este ruptă datorită pierderii timpurii de ATP care oprește transportul ionic, fiind controlata. Ruperea membranei plasmatice și eliberarea conținutului celular duce la un răspuns inflamator, în timp ce apoptoza este acompaniată de scăderea volumului celular și menținerea integrității organitelor, iar integritatea plasmalemei se menține până la sfârșit. 18

Celula a dezvoltat mecanisme reglatorii prin utilizarea canalelor ionice, transportorilor și reorganizarea citoscheletului pentru a menține ciclul celular.

La mamifere rinichii joacă rolul de filtru ionic, însă datorită modificării biochimice celulele trebuie să-și ajusteze singure volumul prin mecanisme de mărire (RVI) sau scădere (RVD) a volumului.

Principalii ioni sunt K+, Na+, Cl-, H+, HCO3-, iar elemetele implicate in mentinerea nivelului osmotic includ aminoacizi, CH3 – NH2, polioli, zaharuri și uree (O’Neill, 1999 ).19

Canalele ionice sunt extrem de permeabile la apă, iar transportul ei depinde de concentrația ionică a aminoacizilor. Celulele în mediu hipertonic suferă procesul de pierdere de apă, însă existența RVI permite supraviețuirea, prin activarea transportorilor electroneutri precum Na+/ H+ și cotransportorul Na+/K+/2Cl-, si prin schimbări în mecanismul de fosforilare.

Antiporterul produce un influx de NaCl și apă, fiind cuplat cu antiporterul Cl-/HCO3-, iar creșterea sodiului intracelular duce la activarea Na+/K+ ATP-azei, ceea ce duce la existența unui gradient electrochimic prin menținerea unei concentrații scăzute de sodiu și clor.

Celulele limfatice rareori apelează la RVI și nu își refac volumul.

Celulele în medii hipotonice își activează RVD și sunt cuplate cu o pierdere intracelulară de potasiu, sodiu și clor, si cu expulzarea apei din celulă. Expulzarea potasiului și clorului duce la reducerea volumului celular, iar o concentrație mare de potasiu inhibă RVD.

Există de asemenea și alte mecanisme de reglaj prin intermediul unor molecule sau transportori.

2. Etapele apoptozei

“Faza inițiatoare”

Cuplarea liganzilor la receptori, alterarea semnalizării prosupraviețuire din partea celulelor vecine sau incapacitatea reparării ADN duc la declanșare apoptozei.1 Pentru un organism unicelular singura șansă de a supraviețui este reapararea ADN lezat. La pluricelulare strategia este mai complexă, implicând blocarea ciclului celular sau a creșterii și apoptoza.

În cazul reparării ADN celula trebuie să decidă dacă materialul genetic a fost corect reparat sau nu. Dacă nu, are loc blocarea ciclului celular până la repararea ADN, sau se declanșază distrugerea prin apoptoză sau “moarte replicativă”.2

II. “Faza de decizie“

Transducția mesajului apoptotic prin intermediul mesagerilor (ceramid, DAG, IP3, kinaze) duce la activarea genelor apoptotice, mai ales a celor bcl – 2 sau ice.

Odată declanșat, procesul este ireversibil. 3

III. “Faza de execuție”

Enzimele de tipul caspazelor sau factorii de genul AIF au rolul de a degrada în mod direct organitele sau de a activa alte molecule cu rol efector.

Activarea endonucleazelor duce la degradarea ADN.4

IV. “Faza de fagocitare”

Corpii apoptotici sunt digerați de către celulele vecine sau de către celulele specializate, în urma semnalizării profagocitare a celulei apoptotice.

În fagocitoză un rol fundamental îl au trombospondina, fosfatidilserina și NANA. 5

3. Elemente implicate in apoptoza

3.1 Receptorii apoptotici

Atunci când celulele sunt lipsite de semnale extracelulare de supraviețuire, se declanșază apoptoza. Aceste semnale sunt produse de celule identice (tip autocrin) sau diferite (tip paracrin).

Adesea apoptoza poate fi indusă de către molecule efectoare exprimate pe surafața altor celule (NK) sau prin intermediul unor citokine. Receptorii apoptotici sunt receptori transmembranari care după interacțiunea cu ligandul transmit semnale apoptotice și fac parte din suprafamilia TNFR (tumor necrosis factor receptor) care posedă domenii extracelulare bogate în cisteină. 1

De asemenea, receptorii apoptotici au o secvență intracitoplasmatică numită “domeniul morții”2 (death domain) care face legătura cu ansamblul apoptotic intracelular care apare și la alte molecule cu funcție în semnalizarea apoptozei.

Cei mai bine caracterizați receptori sunt CD 95 (Fas sau Apo1) și TNFR 1 3(p 55 sau CD 120 a). Alți receptori apoptotici sunt CAR 1, DR 3, DR 4, DR 5, iar receptorul pentru p 75 NGF are și el un domeniu al morții.4

Liganzii care activează acești receptori, cu excepția lui NGF, sunt molecule structural înrudite care aparțin suprafamiliei TNF. CD 95 L se leagă de CD 95, Apo 3 de DR 3, iar Apo 2 de DR 4 și DR 5. Încă nu se cunoaște ligandul pentru CAR 1.

a) CD 95

Fas este o proteină transmembranară formată din 325 de aminoacizi (48 KDa); capătul aminoterminal este citoplasmatic, iar cel carboxiterminal este extracitoplasmatic.

Receptorii pentru Fas sunt repartizați variabil pe diferite celule, găsindu-se în număr mare pe timocite, hepatocite, miocard, ovar și pe suprafața celulelor tumorale.

Este codificat de către o genă localizată pe brațul lung al cromozomului 10 la om și 19 la șoarece, ambele gene având 9 exoni.

Ligandul pentru Fas are un domeniu de aminoacizi hidrofil la mijloc și un segment carboxiterminal la exterior.

Regiunea extracelulară are 150 de aminoacizi, fiind similară cu regiunile omoloage ale familiei TNF

Este codificat la om și șoarece de o genă de pe cromozomul 1, având 5 exoni.

CD 95 joacă un rol fundamental în principal în trei tipuri de apoptoză: deleția periferică a celulelor T mature la sfârșitul unui răspuns imun; distrugerea unor celule infectate de virusuri sau a celulelor canceroase de către celulele cititoxice T și NK; distrugerea unor celule inflamate. Pacienții cu gene pentru CD 95 sau CD 95 L nefuncționale prezintă o acumulare a celulelor limfoide periferice, care se manifestă și în cazul unui sindrom autoimun fatal, caracterizat prin mărirea nodulilor limfatici. CD 95 și ligandul său sunt de asemenea implicați în anumite afecțiuni ale sistemului imunitar.5

CD 95 L este o moleculă homotrimerică, iar studiile de cristalografie sugerează faptul că CD 95 L se leagă de trei receptori CD 95.

Analizele RMN au sugerat o grupare (clustering) a domeniilor morții în urma interacției acestora cu ligandul.6

TNFR 1

TNF este o citokină a cărei funcției este distrugerea tumorilor, având un rol secundar în răspunsul inflamator și imunitar, acționând pe limfocitele T, B, neutrofile, fibroblaste.

Induce de asemenea exprimarea moleculelor de adeziune împreună cu IL – 1.

TNF are două forme, α și β, având o structură identică în proporție de 28 %, fiind codificate de două gene diferite. TNF α este codificat de către macrofage și are un efect citotoxic pe celulele tumorale, iar TNF β este codificat de către TH.

TNFR 1 este unul dintre primii receptori utilizați în răspunsul inflamator, mediind secundar inflamarea unor structuri limfoide, cum ar fi foliculii primari ai limfocitelor B.

Nu toți membrii familiei TNF induc apoptoza după cuplarea cu receptorul specific.

TNF este sintetizat mai ales de macrofagele active și de celulele T ca răspuns la infecție 7. TNF după legare induce asocierea domeniilor morții, iar o proteină adaptoare, TRADD (TNFR associated death domain), se leagă prin propriul domeniu al morții de un domeniu al unui receptor.

TRADD funcționează ca o “interfață” receptor – apoptoză, deoarece activează multe molecule semnal: TRAF 2 (TNFR associated factor 2) și RIP (receptor – interacting protein) stimulează căi de semnalizare care duc la activarea NFKB și a JNK/AP 1 8, în timp ce FADD mediază activarea apoptozei.

Numai RIP are o funcție intrinsecă enzimatică, fiind o serin/treonin kinază.

TRAF 2 și RIP activează NFKB (NIK) care în continuare activează kinaza factorului inhibitor (I – KB) IKK 9.

IKK fosforilează I – KB, ducând la degradarea lui și permițându-i lui NF-KB să se deplaseze în nucleu. Calea de la TRAF 2 și RIP la JNK implică o cascadă de evenimente care include MAP kinazele MEKK 1 (MAP/Erk kinaz kinaza 1).

MEKK 1 este asemeănătoare cu NIK și este implicată deoarece mutanții MEKK 1 blochează activarea JNK de către TNF. MEKK 1 nu se leagă de TRAF 2 sugerând faptul că o altă kinază pentru TRAF 2 acționează înainte de MEKK 1. 10

Celulele din șoareci knock-out pentru TRAF 2 sau din șoareci transgenici ce au o mutație TRAF 2 dominant negativă au numai un ușor defect în răspunsul lor la TNF.

TRAF 2 s-ar putea să fie neesențial pentru activarea NF-KB prin TNF, sau ar putea exista un alt membru al familiei TRAF care se leagă de TRADD și NK și se substituie lui TRAF 2.

TNFR 1 activează factorii transcripționali NF-KB și AP 1, ducând la activarea unor gene proinflamatorii și imunomodulatorii.

TNF, spre deosebire de CD 95 L, declanșază apoptoza numai dacă este blocată sinteza proteică, ceea ce sugerează existența unor factori celulari care anulează semnalul apoptotic generat de către TNF.

Expresia acestor proteine supresoare se pare că este controlată prin intermediul NF-KB și JNK/AP 1.

TNF determină trimerizarea TNFR 1 după legare, inducând asocierea domeniilor morții.

DR 3

Acest receptor 11 este asemănător lui TNFR 1, însă in timp ce TNF este fucțional mai ales în limfocite și macrofagele activate, ARNm pentru DR 3 este exprimat în mod constitutiv în multe țesuturi.

Receptori Apo 2 L sau TRAIL 12 generează la fel ca CD 95 L apoptoza în multe celule canceroase, însă spre deosebire de ultimul, care este restrâns la celule T și NK, ARNm pentru Apo 2 L se exprimă în numeroase țesuturi.

DR 3 are o similaritate cu TNFR 1, deoarece, la fel ca acesta din urmă, activează NF-KB prin TRADD, TRAF 2, RIP și apoptoza prin TRADD, FADD și caspaza 8. DR 3 se leagă la Apo 3 L, care este legat structural de TNF.

Apo 3 L activează NF-KB prin TRADD, TRAF 2, RIP și NIK și declanșază apoptoza prin TRADD și FADD.

Receptorii apoptotici pot fi utilizați în oncologie, deoarece au acces direct la caspaze și în plus inițiază apoptoza independent de gena supresoare tumorală p 53 care este inactivată prin mutație în 50 % din cazuri.

Domeniul morții al CD 95 interacționează cu FADD (Fas associated death domain) prin intermediul domeniului morții al acestuia din urmă. FADD are un “domeniu declanșator al morții” (death effector domain) care se leagă la un domeniu analog repetat în tandem cu forma zimogenă a caspazei 8 (numită FLICE sau MACH).

DED este un tip particular al unui domeniu de interacție homofilică numit CARD (caspaze recruitment domain), care există în unele caspaze cu prodomenii mari (2, 8, 9, 10) 13.

După activarea lui FADD oligomerizarea caspazei 8 duce la activarea ei prin autoclivaj. Caspaza 8 activează alte caspaze efectorii , cum ar fi caspaza 9 – proteina mamaliană omoloagă lui CED 3- ducând la apoptoză.

Șoarecii knock-out pentru FADD în celulele T au o sinteză redusă de celule T ca răspuns la stimularea antigenică, iar deleția FADD duce la moartea embrionilor 14.

3.2 Bcl – 2

Este primul reglator mamalian care permite supraviețuirea celulelor hematopoietice citokin-dependente, în absența citokinei 1, in etapa Go insa . Această descoperire a sugerat că supraviețuirea și proliferarea celulară sunt controlate de mecanisme genetice diferite. Bcl – 2 înregistrează diferite forme de leziuni celulare și decide dacă celula trebuie să declanșeze sau nu apoptoza. Anumite cai apoptotice, precum cele ce declansate de activarea receptorului apoptotic CD 95 evita acest nivel controlat de Bcl – 2.

Până acum au fost identificați cel puțin 15 membri ai familiei Bcl – 2 în celula mamaliană, prezentând cel puțin unul dintre cele patru motive conservate cunoscute ca domeniile de omologie Bcl – 2 (BH 1 – BH 4) 2. Majoritatea claselor cu funcție antiapoptotică prezintă cel puțin BH1 și BH2, iar cei similari lui Bcl – 2 au toate cele patru domenii (Bax, Bak, Bok, au BH 1, 2, 3 și sunt strâns înrudiți cu Bcl – 2). Mai există de asemenea alte 7 tipuri de proteine înrudite cu Bcl – 2 ce au numai un segment parțial omolog cu BH 3 3 (9 –16 aminoacizi), și care în mod normal posedă o funcție apoptotică (EGL – 1 de la C. elegans care se leagă la CED – 9). Bax, Bak și Bok au o asemănare puternică cu BH 1, 2, 3 din Bcl – 2.

Proteinele pro- și antiapoptotice pot heterodimeriza și isi anihila reciproc funcțiile, iar mutageneza dirijată a segmentelor BH 1, 2, 3 influențează în mod clar dimerizarea, modelul fiind reprezentat de Bcl – XL.

Conformația BH 1, 2, 3 crează un spațiu hidrofob la care segmentul BH 3 α helix amfipatic se poate lega. Heterodimerizarea nu este esențială pentru supraviețuire, dar este insa pentru apoptoză.

Bcl – 2 rezidă pe fața citoplasmatică a membranei mitocondriale externe, a reticulului endoplasmatic și a anvelopei nucleare și înregistrează dinamica proceselor măsurând fluxul moleculelor mici sau al peptideor.

Experiențele realizate pe C. elegans au sugerat că proteinele antiapoptotice inhibă direct abilitatea CED – 4 de a activa caspazele.

CED – 9 și Bcl – XL se pot lega de CED – 4, care se leagă la rându-i de CED – 3 și îi stimulează activitatea.

Regiunea BH 4 a Bcl – XL este esențială în activitatea antiapoptotică și interacțiunea cu CED – 4 și poate servi ca un locus de atașare directă pentru CED – 4 și modula structura Bcl – XL.

S-a descoperit recent că Bcl – XL 4 se leagă de porțiunea asemănătoare CED – 4 din Apaf – 1, în timp ce procaspaza 9 se leagă de domeniul de recrutare caspazică NH2 – teminal (CARD), și că Bcl – XL poate inhiba asocierea lui Apaf – 1 cu procaspaza 9 si ii inhibă astfel activarea.

Bcl – 2, direct sau indirect, previne eliberarea din mitocondrii a citocromului c care cu ATP poate schimba structura Apaf – 1 și poate activa caspazele.

Structura lui Bcl – XL (segmentele 5 și 6) se aseamănă cu insertia membranară a toxinelor bacteriene, ducând la ideea că factorii cu BH 1, 2 funcționează prin formarea de pori în membrane.

În timp ce proteinele proapoptotice antagonizează în mod direct cu proteinele antiapoptotice prin intermediul liganzilor de tip BH 3, grupul Bax poate distruge direct organitele , chiar în prezența inhibitorilor caspazei; expresia proteinelor asemănătoare Bax poate ucide celulele, condensând ADN și alterând membranele fără activarea caspazelor, prin formarea unor pori în membrane.

Familia Bcl – 2 este reglată de către citokine, unele gene proapoptotice fiind induse de către acestea, iar bax este activat în cadrul răspunsului mediat de p 53.

În celulele hematopoietice stimulate de IL – 3, Bad este fosforilat și produsul sechestrat în citosol, iar semnalul de la receptor pare a fi transmis de PI 3 kinaza prin kinaza Akt la Bad.

Bcl – 2 poate fi activat prin fosforilarea Ser70 și inactivat prin fosforilare de către JNK.

Bcl – 2 protejază împotriva unor atacuri citotoxice (radiații γ, UV), dexametazona, staurosporina, dar nu impotriva apoptozei declansata de CD95.

Dacă șoarecii bcl – 2 -/- se dezvoltă normal până la o anumită vârstă, cei bcl – x -/- mor in utero, iar cei bax -/- au celule T cu senzitivitate la γ – iradieri; testele au arătat că Bax este responsabil pentru moartea anormală în bcl – x -/- și cea limfoidă în bcl – 2 -/-.

În condiții suboptimale, bcl – 2 promovează intrarea în starea de neactivitate și întârzie declanșarea unui nou ciclu, iar acest efect este separat genetic de funcția de supraviețuire, deoarece inhibarea ciclului celular nu inhibă supraviețuirea, care este afectată printr-o deleție într-o buclă neconservată, sau prin mutatie la nivelul tirozinei 28.

Inhibiția poate implica o proteină care se leagă la regiunea Bcl – 2 , precum calcineurin fosfataza. Celulele T care exprimă Bcl – 2 sintetizează mai puțină IL – 2, citokină necesară intrării în faza S, datorită translocării nucleare reduse a NFAT, care cere calcineurina, pe care Bcl – 2 o poate sechestra în membranele intracelulare.

Odată ce a fost descoperită funcția apoptotică a lui Bcl – 2, a fost analizată și funcția sa în oncogeneză.

În șoarecii transgenici Bcl – 2 se acumulează în exces celule B mature, iar limfoamele prezintă adesea translocații Myc.

Sinergia myc și bcl – 2 a fost demonstrată în cazul limfoamelor si a cancerului mamar la șoarecii bitransgenici.

Toate genele bcl – 2 sunt potențial oncogenice, iar unele mutații probabil măresc expresia în mod indirect. În celulele hematopoietice Myb, Ras, AML – 1 – ETO induc expresia bcl – 2 iar fenomenul de supraexpresie este întâlnit în leucemia mieloidă.

3.3 Mitocondria și apoptoza

Deși inhibarea caspazelor blochează apoptoza indusă de etoposidă, actinomicina D, UV, staurosporină, expresia c – myc, glucocorticoizi, nu menține însă capacitatea replicativă a celulei. În cele din urmă celula moare, pe o cale nonapoptotică, probabil necrotică. 1

Proteinele antiapoptotice Bcl – 2, Bcl – XL și Abl pot menține capacitatea de supraviețuire și multiplicare chiar în urma tratamentelor, iar Bax poate induce moartea celulei prin distrugerea mitocondriei chiar și în absența caspazelor. 2

Există cel puțin trei mecanisme de atac:

distrugerea lanțului transportor de electroni, a fosforilării oxidative și producerii ATP;

eliberarea proteinelor ce determină activarea caspazelor;3

alterarea potențialului redox. 4

Radiațiile γ induc apoptoza în timocite și distrug lanțul transportor de electroni, probabil la nivelul citocrom b – c 1 / citocrom c, prin intermediul unui ceramid care funcționează ca un mesager secundar , iar atașarea Fas duce la afectarea aceluiași transport la nivelul citocromului c.

O consecință a acestui mecanism este scăderea concentrației de ATP care are loc târziu în apoptoză, și probabil ca nu are o funcție esențială.

Importanța mitocontriei în apoptoză a fost sugerată de către analizele sistemelor noncelulare, unde condensarea nucleară și fragmentarea ADN ce era inhibată de Bcl – 2 era dependentă de existența mitocondriei.

Eliberarea citocromului c în citosol este inhibată de către Bcl – 2, aceasta facand parte din “apoptozom” , format în plus de Apaf – 1 și procaspaza 9. 5

Activarea ultimei duce la activarea celorlaltor tipuri caspazice, iar inhibitorii acestora nu previn eliberarea citocromului c indusă de UV, staurosporină, Bax, dar o previn pe cea indusa de catre activarea Fas.

Consecința elliberării citocromului c depinde de tipul celular, deoarece în acele celule unde citocromul c este în exces, caspazele sunt activate, și sufucient citocrom c rămâne depozitat datorită afinității ridicate pentru citocromii b – c1, în acest caz consumul de oxigen și producția de ATP putand continua în timp ce caspazele își continuă demersul.

Alternativ, în celulele ce conțin cantități mari de înhibitori ai caspazelor, eliberarea citocromului c poate eșua în declanșarea apoptozei și poate genera un mecanism necrotic.

Mitocondria eliberează și alți mediatori apoptotici, cum ar fi procaspaza 3, AIF, care este blocat de către Z VAD – Fmk, un inhibitor caspazic general.

Un alt mecanism de distrugere îl constituie generarea anionului superoxid 6 care crește în timpul apoptozei, însă implicarea exactă nu a fost precis lămurită.

Distrugerea potențialului transmembranar se realizează prin intermediul unui por special, 7 format din proteine ale membranei interne (ANT) sau externe (porina) care funcționează sinergistic, la punctele de contact.

Deschiderea unui canal nonselectiv, în membrana internă generează un echilibru ionic între matrice și spațiul intermitocondrial, anulând gradientul de H+ și generând o modificare de volum datorită diferenței osmotice, ceea ce distruge membrana externă, eliberând proteinele activatoare ale caspazelor.

Blocanții formării unui asemenea por (ciclosporinele și acidul bongkrekic ) anulează apoptoza, același efect avându-le și Bcl – 2.

Un alt mecanism de distrugere a membranei mitocondriale externe, implică hiperpolarizarea 8 membranei mitocondriale interne, datorită unui export de protoni ce protonează acizii slabi, care difuzează liber prin membrana internă, schimbând osmolaritatea, mărind matricea mitocondrială și rupand membrana externă.

O altă legătură între apoptoză și fiziologia mitocondriei este sugerată de prezența proteinelor familiei Bcl – 2 în membranele mitocondriale 9. Omologul Bel – 2 din C. elegans CED – 9 este tradus de pe un ARNm dicistronic care codifică atât pentru CED – 9 cât și pentru citocromul b, ceea ce implică că CED – 9 derivă din simbionți promitocondriali, și a fost transferat în genomul nuclear.

Membrii Bcl – 2 sunt ancorați în membrana mitocondrială externă printr-un segment hidrofobic de aminoacizi, localizat la capătul COOH, iar restul proteinei orientat spre citosol.

O mare varietate de evenimente mitocondriale depind de Bcl – 2, ca de pildă inhibarea eliberării Ca2+ din matrix indusă de decuplanți ai respirației.

Proteinele Bcl – XL sunt compuse din 7 α – helixuri legate prin bucle flexibile și au o mare asemănare cu domeniile formatoare de pori ale unor tipuri de toxine bacteriene (toxina difterică, colicina) 10.

Pot forma canale ionice, iar deleția helixurilor 5 și 6 duce la inexistența porilor. Bcl – 2 reglează o mare varietate de evenimente chiar în prezența unor inhibitori ai caspazelor (Z VAD – Fmk) – inhibă nu numai apoptoza dependentă de caspaze, ci și necroza indusă de hipoxie – , iar Bax induce eliberarea citocromului c și apariția apoptozei chiar la drojdii care nu au caspaze.

Deși implicarea mitocondrială și a citocromului c poate nu este universală, aceasta apare frecvent la eucariote. Până acum nu a fost găsită o corelatie între citocromul c și apoptoza la nematode și insecte (la primele activarea caspazelor prin interacțiunea cu CED – 4 se realizează fără citocromul c).

Caspazele

Sunt o familie de cistein proteaze și au capacitatea de a distruge importante grupări proteice, proteoliza fiind un proces ireversibil.

Precursorii caspazelor nu au capacitate enzimatică, clivarea proteolitică transformându-i în grupări active, aceasta realizându-se prin intermediul altei proteaze sau prin autocataliză, datorita legării unor cofactori sau al îndepărtării unor inhibitori.

Reacțiile proteolitice sunt de obicei specifice, aceasta fiind conferită de combinarea structurilor secundare și terțiare ale substratului.

Odată cu descoperirea faptului că CED – 3 1,2 , caspază existentă la nematodul Caenorhabditis elegans, este înrudită cu enzima transformatoare a interleukinei 1β (ICE, caspaza 1), a fost descoperit rolul apoptotic al acestei familii de proteaze, acestea având similarități în secvența de aminoacizi, structură și specificitatea de substrat.

Sunt sintetizate ca proenzime (30 – 50 KDa), au un domeniu aminoterminal cu rol reglator, o subunitate mare (20 KDa) și una mică (10 KDa), iar activitatea implică procesări proteolitice între domenii, urmată de ansamblarea subunităților într-un heterodimer.

Prin cuplarea a doi dimeri rezultă un tetramer cu două situsuri active, cu funcționare independentă. 3

Domeniul aminoterminal, cu o dimensiune variabilă, este implicat în reglare, iar activare presupune recunoașterea a cel puțin patru aminoacizi la nivelul situsului de clivare, ceea ce este suficient.

Motivul de recunoaștere prezintă o diversitate la nivelul diferitelor caspaze, ceea ce explică probabil diversitatea funcțiilor. 4

Cu toate acestea, nu toate proteinele ce conțin secvența de patru aminoacizi sunt clivate, ceea ce constituie un argument pentru importanța structurilor tertiare și cuaternare.

Clivarea proteolitică nu numai că este specifică, dar este și eficientă ( kcat / Km > 106 M-1 S-1). Specificitatea extraordinară a caspazelor implică faptul că proteoliza este extrem de selectivă, iar trăsăturile fundamentale ale apoptozei (fragmentarea ADN, condensarea cromatinei, formarea corpilor apoptotici) nu pot fi înțelese fără o aprofundare a mecanismelor de funcționare a caspazelor. Prima funcție a caspazelor este aceea de a inactiva proteinele care protejază celulele vii de apoptoză. În timpul apoptozei, ICAD este inactivat de către caspaze, eliberând CAD 5. Pe de altă parte, CAD eliberat în absența inhibitorului nu este funcțional, ceea ce argumentează în favoarea unor modificări cotranslaționale CAD – ICAD. 6

Caspazele contribuie la apoptoză prin dezansamblarea structurilor celulare, precum lamina nucleară, formată din polimeri ai filamentelor intermediare (laminele A, B, C) 7,8 . Caspazele clivează proteine implicate în formarea citoscheletului,cum ar fi gelsolina, FAK ( focal adhesion kinase ), sau PAK2 (kinaza 2 activata de p 21). 9

Un alt mecanism de acțiune îl reprezintă dezansamblare multimerilor, prin atacarea în special a domeniilor reglatoare sau efectoare.

Strategia caspazelor constă în ruperea legăturilor celulei cu vecinii, dezorganizarea citoscheletului, afectarea replicării și reparării ADN, a splicing-ului, ruperea ADN, a membranei celulare, si in determinarea semnalizarea unor mesaje cu funcție în fagocitoză și formarea corpilor apoptotici.

Reglarea activității caspazelor se realizează pe mai multe nivele.

Activarea caspazelor efectorii se realizează prin cascadă, semnalul proapoptotic culminând cu activarea unei caspaze cu funcție inițiatoare, care la rândul ei activează caspazele efectorii.

Există mai multe tipuri de caspaze care mediază seturi distincte de semnale, ca de exemplu caspaza 8 care este asociată cu receptorii apoptotici, în timp ce caspaza 9 este implicată în apoptoza indusă de agenții citotoxici.10

Activarea caspazelor inițiatoare. Acest proces implică legarea unor cofactori specifici, fenomen declanșat de un semnal proapoptotic ce rezidă în două motive structurale, unul în prodomeniul caspazei, iar celălalt în cofactor. 11

Activarea procaspazei 8 necesită atașarea FADD la DED, în timp ce procaspaza 9 necesită citocromul c și ATP, si legarea de CARD.

Modelul autoproteolitic descrie fenomenul prin preexistența unor precursori în celule cu o conformație ce previne clivarea.

Cofactorii sunt similari în secvență cu procaspaza 8, exceptând faptul că le lipsesc fragmentele cu funcție catalitică. Aceste proteine competiționează cu procaspazele 8 pentru FADD, prevenind activarea caspazelor.

Un alt mecanism de reglaj îl constituie compartimentalizarea, deoarece extracte din celulă activează caspazele.

4. Proteine cu funcție adaptorie

După interacția receptor-ligand are loc cuplarea acestora cu proteine citoplasmatice care la rândul lor activează efectorii citoplasmatici.

Există două clase, prima cuprinzând TRADD, FADD, RIP, iar a doua – TRAF 1, TRAF 2, TRAF 3.

TRADD 1 este asociată cu TNFR 1, are o masă de 32 KDa, și interacționează cu domeniul morții din receptor. Are un domeniu identic 25 % cu cel similar din receptor în zona carboxiterminală, zona aminoterminală fiind identică.

FADD se cuplează cu domeniul morții din Fas, iar segmentul DED (domeniul apoptotic efector) se cuplează cu segmentul omolog al caspazei 8.

RIP 2 este o altă moleculă de 74 KDa care interacționează cu domeniul morții al lui Fas, fiind implicată însă și în inducerea NF-KB de TNFR 1. Fiind o serin/treonin kinază, poate fi ușor activată și pentru acest rol. RIP poate interacționa și cu TRADD și induce apoptoza.

RAIDD (RIP associated ICH – 1/CED 3 homologous protein with death domain) este o altă moleculă adaptor care este implicată în transmiterea semnalului apoptotic pe calea TNF, și posedă un domeniu CARD omolog cu altul de pe procaspaza 2.

TRAF. Există 6 tipuri de asemenea molecule, având în comun un segment de 150 de aminoacizi, implicat în interacțiunea cu alte molecule.

TRAF se poate cupla și cu TRADD, fiind implicată așadar în semnalizarea TNF 1, iar TRAF 2 activează NF-KB printr-un mecanism încă necunoscut.

FLICE. 3Activarea adaptorilor duce la declanșarea atacului caspazic.

Caspazele se găsesc în celule sub forme inactive, activarea realizându-se în cascadă. Proteinele FLICE (FADD-like ICE) au domenii de omologie cu FADD și cu ICE/CED 3 din clasa caspazelor.

Au două lanțuri aminoterminale de 60 de aminoacizi fiecare, având similaritate de 35 % cu domeniul morții din FADD. 4

MACH. 5 Este omoloagă cu CED 3, are o masă moleculară de 34 KDa și este monomerică. Diferitele forme au segmentul carboxiterminal variabil, aici fiind localizate segmentele omoloage cu ICE/CED 3.

Regiunile omoloage au activitate proteazică de tip cazpază și pot induce activarea acestora.

FLASH 6Au aceeași funcție de activare a caspazelor ca și cele de dinainte, având secvențe similare cu domeniile morții ce se pot cupla cu regiuni omoloage din caspaze sau adaptor.7

5. AIF 1

Analiza mecanismelor apoptotice independente de apoptozom (citocrom c/Apaf 1/caspaza 9)a dus la înțelegerea funcției factorului de inducere a apoptozei (AIF) localizat la fel ca și Bcl –2 în spațiul intermembranar mitocondrial.

Adiția AIF la sisteme nucleare acelulare declanșază trăsăturile tipice ale apoptozei, cum ar fi condensarea cromatinei și fragmentarea ADN.

Liniile celulare aif -/y (gena AIF este X – likată) aveau o proliferare normală in vitro, și spre deosebire de citocrom c -/-, apaf -/-, caspaza 9 -/-, aveau o susceptibilitate normală la apoptoză în urma anulării potențialului mitocondrial, tratamentului cu staurosporină, etopozida, azidă, ultraviolete, anizomicină, lucru constatat chiar în prezența inhibitorului caspazic Z – VAD-fmk.

Acest tip de apoptoză este necesar în decursul dezvoltării embrionare, mai ales în momentul formării cavității amniotice, proces ce nu necesită funcționarea apoptozomului.

Calea este încă necunoscută.

6. ASPECTE GENTICE ALE APOPTOZEI

7.p 53 si cancerul

Apoptoza reprezintă ultima solutie pentru celula și este folosită mai ales în cazul celulelor care constituie un factor de risc neoplazic.

În procesele de răspuns la leziuni sunt implicate mai multe protein kinaze, înrudite cu PI 3 kinaza 1, cum sunt ATM, ce suferă mutație în ataxia telangiectasia și DNA-PK 2, care are un rol important în recombinarea V(D)J și protejarea telomerelor.

Aceste două protein kinaze sunt omoloage cu Rad 3/MEC 1 de la drojdii și sunt implicate în strategia răspunsului la distrugere. p 53 este eliberat de Mdm 2 datorită fosforilării acestuia de ADN – PK și prin PK activate de stress (SAPK/JNK), care este inițiată prin MEKK 1 și implică fosforilări secvențiale și prin activarea căii SEK 1/ MEKK 4 sau SAPK/JAK și c – Jun.

Proteina cu rol în supresia tumorii (p 53), este menținută în mod normal la un nivel scăzut prin interacția cu Mdm 2 care este implicată în distrugerea sa.

Leziunile de la nivelul DNA induc fosforilarea p 53 sau Mdm 2 împiedicând interacția lor și activând p 53. Aceasta este ineficientă în numeroase cancere, iar Mdm 2 este amplificată în unele tumori. 3

Concepția clasică era cea a alternativei: reparare ADN sau moarte pasivă. Datorită înțelegerii funcției p 53, astăzi știm că se poate alege în afară de reparare între blocarea ciclului celular și apoptoză.

Dacă funcția p 53 in cadrul ciclului celular si blocarea lui a fost suficient studiată, rămâne obscură insa relația cu apoptoza.

Se știe că Bax, IGF-1, IGF-BP3 sunt proteine țintă ale p 53, dar nu se cunosc exact relațiile dintre ele. 4

p 53 este implicată și în răspunsul celular la privare fizică, leziuni fizice, șoc termic, hipoxie și expresia myc sau E1A. 5

Prima proteină cu funcție proapoptotică a fost c-myc, al cărei transcript aparține clasei bHLH zip. Un posibil factor implicat în funcția apoptotică a c-myc este clasa cdk. 6

Acstea sunt activate în apoptoza neuronilor “înfometați”, a limfocitelor tratate cu citocalasina B, TNF, FAS sau proteina Tat virală, si in diferențierea miocitelor.

E1A este principala proteină oncogenică codificată de un adenovirus și la fel ca myc, este un inductor apoptotic.

O posibilă interpretare a apoptozei indusă de myc, E1A și E2F, este aceea că apare un conflict intre tendința de dezvoltare indusă de oncogenă și semnalele inhibitorii ale creșterii, ceea ce face loc acțiunii p 53.

În timpul infecției virale, E1A determină acumularea de p53 care ar induce apoptoza dacă nu ar fi proteinele clasei E1B, p 19 și p55 7. E1B 19 K este un omolog al lui Bcl-2, iar 55 K se leagă de p 53 și îl inactivează.

Apoptoza indusă de oncogene poate sugera interdependența dintre sistemul apoptotic și cel al creșterii celulare: prin modelul semnalizării binare induce mesaje apoptotice care în mod normal sunt anihilate de către mesajele de supraviețuire generate de către celelalte celule 8.

Relația este reciprocă deoarece în anumite circumstanțe anihilarea apoptozei induce oprirea proliferării.

Deși expresia Bcl-2 oprește apoptoza, celulele afectate au probleme în continuarea ciclului celular 9 și, reciproc, Bax accelerează acest proces 10.

Un exemplu interesant îl constituie cazul oncoproteinei Ras care este un transductor normal al Raf-MAP K și al activării PI 3 K, AK 1 sau Bcl, în urma cuplării receptorului IGFI 11.

Mutația oncogenică a lui Ras induce proliferarea celulară și blocarea apoptozei, însă exprimarea sa în celulele netransformate duce la efecte contrarii, datorită Raf.

p 53

O trăsătură importantă a celulelor maligne o constituie proprietatea lor de a supraviețui în condiții de instabilitate genomică ridicată, care este generată prin deleția senzorilor de distrugere, atenuarea semnalelor apoptotice și prin creșterea semnalelor de supraviețuire (citokine solubile, factori de creștere, contacte prin matricea celulară).

Aproape 50 % din cazurile de cancer implică o deficiență în funcționarea p 53.

Timocitele p 53 -/- nu intră în apoptoză, însă adiția de glucocorticoizi o induce, ceea ce indică existența căilor p 53 independente; de asemenea celulele bax -/- intră în apoptoza mediată de p 53.

p 53 este un factor de transcripție cu localizare nucleară; are un domeniu aminoterminal de activare și unul central de interacțiune cu ADN la nivelul unor secvențe consensus, majoritatea mutațiilor missense fiind localizate aici.

Are un turn-over rapid (20’) și este menținut în stare inactivă prin interacție cu Mdm 2.

În urma leziunilor ADN p 53 este prelucrat posttranscripțional, devenind astfel mai stabil. p 53 este esențial în cazul apoptozei folicoblastelor embrionare murine induse de E1A; de asemenea, activează p 21 prin inhibarea represorului. p 21 se leagă la complexele cdk – cicline care intervin în tranziția G1 / S și previne fosforilarea Rb, blocând eliberarea E 2 (factori transcripționali) și implicit blocând ciclul celular. p 21 se leagă de asemenea la PCNA (factor al ADN – polimerazei δ) și inhibă replicarea ADN.

NF-kB si apoptoza 1

Citokinele TNF α sau IL – 2 induc translocația NF-kB prin dislocarea de IkB, iar după aceasta are loc inducerea transcripției a numeroase gene care reglează creșterea celulară, a unor receptori sau citokine.

Principala țintă o constituie genele IAP care în mod normal inhibă apoptoza.

NFkB este un heteodimer uzual de 50 KDa, însă a mai fost identificată și o a doua formă, de 65 de KDa.

Datorită activării TNFR 1, NF-kB est activat, protejând celula de intrarea în apoptoză, iar activarea A1 / BFI – 1 determină inhibarea eliberării citocromului c și blocarea activării caspazei 3.

LMP 1 2 (proteina membranară a virusului Epstein – Barr) simulează acțiunea lui TNFR 1 prin legarea la TRAFs și TRADD și induce sinteza NF-KB.

7. MODIFICARI NUCLEARE IN APOPTOZA

Dinamica nucleară este de obicei caracterizată ca fiind dominată de condensarea periferică a cromatinei, fragmentarea ADN și formarea unor corpi apoptotici care înglobează fragmente nucleare.

Cu toate acestea, apoptoza citoplasmatică decurge normal și în celulele care au mutații în genele implicate în dezintegrarea nucleului și în cele anucleate.

În 1994 Schulze-Osthoff 1 a evidențiat faptul că în celulele anucleate aparținând liniei L 928 dintr-un fibrosarcom murin tratamentul cu citocalazina B induce apoptoza clasică, si ca absența fragmentării nucleare nu blochează calea apoptotică mediată de Apo 1 / Fas.

Mai mult, inhibitorii endonucleazelor nu blocau apoptoza indusă Apo 1 / Fas în celulele L 929.

TRASATURI STRUCTURALE

relatia condensare-apoptoza

S-a discutat mult timp despre relatia dintre condensarea cromatinei si fragmentarea ADN. Prima etapă observabilă este condensarea cromatinei la nivelul membranei celulare, ipoteză sugerată de inelul dens ce apare în microscopia electronică2, condensare care cuprinde întreg nucleul, ulterior acesta dezintegrându-se și fiind înglobat în corpii apoptotici.

Caspazele 3 și 6 sunt implicate în activarea DFF 40 (CAD), clivarea PARP, laminelor și a factorilor de atașare la structuri scaffold. 3

Clivarea laminelor are loc în urma activării caspazei 6, iar mutanții cu lamine neclivabile A și B prezintă o întârziere apreciabilă în ceea ce privește fragmentarea nucleară. Alte studii insa au demonstrat faptul ca unele celule incubate cu proteinaza K prezintă o clivare a laminei B, lucru care nu este suficient totusi pentru a declanșa condensarea nucleară.

Ipoteza sugerata de alte studii este aceea că modificările structurale nucleare nu necesită digestia proteinelor structurale, ultimul proces doar acompaniind evenimentul apoptotic, și că aceste schimbări se datorează unor factori apoptotici nucleari activați prin caspaze (exceptând AIF). 4

Dupa asemenea studii clivarea caspazică nu este necesară în condensarea primară însă este esențială în separarea finală a nucleului.

Mutanții care au lamine neclivabile erau rezistenti la proteoliză, fapt care afecteaza condensarea nucleară și distrugerea nucleului, care capata aspect convolut, nucleul suferind colapsul chiar în absența condensării nucleare, proces care are loc și în urma inhibării proteazelor laminare.

Există trei posibile explicații pentru a împăca observațiile uneori conflictuale. 5

Inhibarea clivării laminare poate bloca detașarea ADN de lamină, care va colapsa în zona centrală.

Lamina neclivabila previne fragmentarea nucleară ca are loc în mod normal prin agregarea cromatinei în corpi apoptotici.

Distrugerea laminei facilitează apoptoza prin deschiderea nucleului și expunerea lui la factori citoplasmatici cu rol în activarea nucleazelor.

fragmentarea ADN – condensarea cromatinei

Aceasta are loc în etapa următoare la nivelul unor segmente de 30 – 50 Kpb și 200 – 300 Kpb.

Clivarea internucleozomală generează fragmente de ADN multipli ai lungimii lui în jurul nucleozomului, fiind inhibată de zinc, inhibare care insa nu afectează condensarea cromatinei.

Studiile lui Rao 6 pe celule infectate cu oncogena E1A au arătat că deși în faza inițială are loc o accelerare a replicării ADN, ulterior acumularea

p 53 induce apoptoza. Acest proces este inhibat de către E1B 19 K care este similar cu Bcl – 2 și care probabil interacționează cu lamina nucleară.

Familia caspazică ICE recunoaște și taie la nivelul unui aspartat în poziția P 1 a unei secvențe consensus. PARP este clivată de asemenea la nivelul unui aspartat în secvența DEVD↓D.

Lamina A are două situsuri, 230 și 446 în secvențele EVDNG și EIDSG, iar aspartatul 230 este conservat la om, șoarece, pui, Xenopus, Drosophila.

Fragmente din laminele A/B/C la nivel 220 – 390 au fost generate ca proteine de fuziune cu GST (GST LA 220 – 390 / GST LB 220 – 390) și au fost purificate pe Sepharose, si s-a stabilit astfel ca substituția în P 1 a asparatului cu alanina generează mutanți rezistenți la clivaj.

Extracte citoplasmatice din celule trasformate cu E1A și p 53 au fost blottate folosind anticorpi anti-GST și a fost evidențiată o creștere a cantității de fragmente raportată la timp.

Clivajul laminar se realizează la 32° C, dar nu la 38° C, ceea ce fundamentează implicarea p 53, insa nici un fragment nu a fost observat în celulele infestate cu E1B 19 K la 38° C sau 32° C, care previne de asemenea procesarea CPP 32 și clivarea PARP în linii CHO.

Inhibarea proteolizei laminare in vitro în urma tratamentului cu FLCK blochează modificările nucleare, iar activarea nucleazelor este importantă în apoptoza nucleară, fragmentarea ADN acompaniind pierderea viabilității în apoptoza indusă E1A p 53 dependenta. Degradarea laminei B1 în timocite precede fragmentarea ADN, dar inhibarea cu TLCK nu blochează clivarea internucleozomală a ADN în sisteme noncelulare.

Mutanții deficienți în expresia laminelor au pierdut din viabilitate în 18 ore iar microscopul electronic a evidențiat un nucleu cu lamină intactă, cu un aspect inedit. În cele din urmă nucleii au suferit un colaps și apoptoza a continuat normal.

CIDE – N SI CIDE B

La vertebrate au fost descoperite două noi familii de gene, Cide N și CIDE B 7, care codifică pentru două proteine omoloage segmentului aminoterminal de la DFF 45. Segmentul carboxiterminal al CIDE are un domeniu efector suficient degradării ADN, iar segmentul aminoternimal are funcție reglatoare.

Sunt omoloage cu DFF 45, au un segment aminoterminal similar segmentului CIDE – N din CAD care are funcție reglatorie, si un domeniu carboxiterminal killer (CIDE – C).

În timp ce funcția proapoptotică a moleculelor întregi de CIDE este inhibată de către DFF 45, CIDE – C singura induce apoptoza, ceea ce sugerează o funcție reglatorie a CIDE – N.

CIDE – N are 5 lanțuri β – pliate și 2 α – helixuri, aranjate într-o pliere α /β. Studii NMR au evidențiat faptul că CIDE – N reacționează cu CIDE – N din DFF 45 sau DFF 40. Suprafața de contact este polară și are două regiuni de semn contrar. Juxtapunerea inedită a regiunilor bazice și acide sugerează o interacție bipolară electrostatică.

Lanțurile 1 și 2 sunt legate printr-o buclă și formează un ac de păr în structură pliată, helixul 1 este împachetat în mod antiparalel față de lanțurile 4, 5, 6, iar segmentul 5 este paralel cu o parte din segmentul 1 și formează un complex β pliat.

Fenilalaninele 38, 39, 90 sunt incluse în nucleul hidrofob al moleculei, triptofanul 108 împachetează bucla carboxiterminală înteracționând cu valina 76, alanina 83 și metionina 100 din lanțurile 3 și 5.

Reziduurile aromatice 90 și 108 sunt conservate în toată familia CIDE, mutațiile la acest nivel afectând capacitatea nucleazică.

FRAGMENTAREA INTERNUCLEOZOMALA A ADN

O altă dogmă a studiilor despre apoptoză a fost aceea a oligonucleozomizării. Studiul lui Oberhammer a evidențiat o fragmentare la nivelul de 300 Kpb și 50 Kpb înainte de clivarea internucleozomală. Existența a două tipuri de lungime a fost explicată prin funcționarea a două nucleaze diferite sau prin diferența topologică a cromatinei. 1

În timp ce clivarea la nivelul segmentelor 300 Kpb era explicata prin localizarea la nivelul ADN a topoizomerazei II la distanțe de 300 Kpb, facilitând detașarea de proteinele scaffold, existența fragmentelor de 50kpb se datora functonarii unor nucleaze specializate. Alti cercetatori au observat ca pe masura ce cantitatea de fragmente 300kpb scadea, cea de 50kpb crestea, ceea ce justifică ipoteza derivării fragmentelor de 50 Kpb din primele. 2

Alte studii au arătat că fragmentarea ADN este independentă de clivarea ADN linker și că ultima depinde de acțiunea unor factori adiționali care afectează conformația nucleozomală.

Celulele 10T ½ intrate în apoptoză nu puteau fi distinse de timocitele în aceeasi situatie, când analiza se făcea cu o mărire de cca. 25000 de ori la microscop.

ADN extras din 10T ½ apoptozate (celule embrionare murine pluripotente) era dublu catenar, de aproximativ 20 Kp, fără clivări internucleozomale, existând modificări monocatenare prin introducerea siturilor senzitive alkaline ca și a celor S1 hipersenzitive. Analiza ADN denaturat termic în gel de formaldehidă a arătat existenta unor fragmente mai mici de 400 baze în celule apoptotice, ceea ce sugerează că cele doua tipuri de situsuri senzitive sunt în aceleași regiuni, ocurența lor fiind de 177 – 180 pb. 3

Introducerea unor situsuri abazice în regiunea linker constituie o etapă intermediară în degradarea ADN, ceea ce sugereaza ipoteza ca clivarea internucleozomală nu este universală.

Situsurile S1 hipersenzitive sunt asociate cu modificări în conformația ADN prin tranziții B – Z, ceea ce produce afectarea torsiunii ADN și modificări helicale, datorită introducerii unor repetiții de purine și guanidine identice. Asemenea situsuri pot explica dispariția H1 în apoptoză. 4

ICAD

Au fost identificate până acum două forme de ICAD, L și S, care diferă prin lungime (331 respectiv 269 aminoacizi), si care sunt traduse de pe două ARNm diferite, produse prin splicing alternativ. 5

ICAD – L este necesar pentru producerea unui CAD funcțional, nu S insa, facilitându-i plierea corectă. Probabil că ICAD – S funcționează ca un factor de reglare negativă a funcției chapperone a ICAD – L, sau probabil că ICAD – L este translat preferențial în celule ce vor intra în apoptoză.

Liniile celulare din timocite DFF – 45 deficiente sunt rezistente la fragmentarea ADN în urma tratamentului cu dexametazonă și au trăsături distincte față de tipul sălbatic.

Au fost identificați mai mulți factori cu funcție în apoptoza nucleară.

Acinus 6 este un precursor al unui factor de condensare nucleară, clivarea lui la Asp 1093 de către caspaza 3 fiind un pas necesar dar nu și suficient pentru activarea sa. O protează încă necunoscută clivează Ser 987, eliberând subunitatea activă.

DN-aza II 7 derivă de asemenea dintr-un inhibitor proteazic al elastazei leucocitare, printr-o modificare posttranslațională care este declanșată de o acidifiere citosolică, o modificare metabolică ce însoțește adesea apoptoza, și care adăugată la nucleii purificați determină condensarea cromatinei și înglobarea ei în fragmente cromozomale.

g) Catepsina B 8 este activată prin eliberarea sa din lizozomi și are funcție similară.

AIF 9 este de asemenea un factor de inducere a condensării cromatinei independentă de caspaze.

i) Modificari nucleozomale

Un proces important în condensarea cromatinei îl constituie fosforilarea histonelor cromozomale. 10

H1 este în mod normal fosforilată de către cdc 2 / H1 Kinaza, atingand un maxim în mitoză, mai ales la segmentele carboxi- și animoterminale, H3 este fosforilată la nivelul Ser 10 în segmentul aminoterminal si in cazul condensarii premature a cromozomilor, iar H2A in mod constant de-a lungul intregului ciclu celular. H3 în apoptoză nu mai este fosforilată la nivelul situsurilor uzuale .

H2B este un marker important în apoptoză deoarece este fosforilat în mod distinct la nivelul Ser32, specific pentru apoptoză. Procesul debutează cu o fosforilare în momentul fragmentării ADN la nivel nucleozomal, fiind inhibat de 2 – Asp– CH2 – DCB, un inhibitor nespecific al ICE. Încă nu se cunoaște mecanismul exact. Probabil ca fosforilarea H2B faciliteaza disocierea partiala a ADN linker si faciliteaza fragmentarea endonucleazica.

DFF 40/45

Șoarecii knock-out DFF 45 sunt deficienți în ceea ce privește condensarea cromatinei sau fragmentarea ADN, iar existența omologilor sau a altor sisteme nucleazice nu este suficientă. 11

DFF 45 este un inhibitor al lui DFF 40, iar studii aprofundate au demonstrat funcția sa de proteină chapperone. De asemenea DFF 45 are o funcție importantă în sinteza DFF 40, în plierea și în localizarea sa corectă.

Activarea DFF 40 necesită activarea caspazei 3 care clivează DFF 45 la nivelul aminoacizilor 117 și 224. 12

DFF a fost identificat prin experiențe în care nuclei normali din ficat de hamster au fost incubați cu HeLa S – 100. Caspaza 3 nu putea induce singură fragmentarea ADN și nici fracția citosolică din HeLa.

După incubarea cu caspaza 3 DFF 45 a fost în două fragmente, de 30, respectiv 11 KDal, și ulterior a fost cuantificată reducerea cantitatii de 30 KDal, și marirea celei de 11 KDal, ceea ce a sugerat că fragmentul mare este un intermediar pentru cel mic. 13

DFF 45 are un ORF de 331 de aminoacizi, cu o structură inedită. DFF este localizat citosolic, iar după activare este transportat în nucleu, unde este implicat în degradarea cromatinei.

Studii genetice au identificat o genă CAD pe 1p 36.3, asociată cu o pseudogenă, iar deleția acestui fragment a fost indentificată în numeroase tumori, mai ales în neuroblastoma.

Are o funcție DN-azică intrinsecă, 14 dar analiza BLAST a identificat un domeniu de omologie de 80 de aminoacizi cu proteina murină, localizată în regiunea aminoterminală. Aceste molecule au o identitate de 43,3 %, între 24 – 83.

DFF este similară DN-azelor bacteriene care sunt codificate de către genele colicinelor și care sunt sintetizate cuplat cu inhibitorii specifici și cu NFkB – IKB.

Capacitatea este accelerată de adăugarea H1 și HMG. DFF 40 induce condensarea cromatinei când este adăugat la nuclei izolați, proces care nu este inhibat de Z – VAD – FMF, ce determină blocarea acțiunii AIF. 15

8. Noi familii de gene

În ultima perioadă au fost descoperite noi familii de gene la Drosophila melanogaster, cum ar fi REAPER, HID și GRIM, care codifică pentru inductori puternici ai apoptozei, în cursul dezvoltării embrionare.

Reaper este o moleculă mică (65 aminoacizi), cu o secvență inedită, neavând omologi la celelalte specii și fără funcție catalitică evidentă.1 Se leagă la o proteină numită SCYTHE, 2 care eliberează citocromul c, disociind complexul Scythe – represor. Scythe se leagă de asemenea și la alte două proteine cu funcție reglatoare, GRIM și Hid.

GRIM 3 este o proteină citoplasmatică care în timpul apoptozei este traslocată în mitocondrie, putând fi clivată de către caspaze la nivelul domeniului carboxiterminal. GRIM nu necesită activarea p 53, iar GRIM, hip și reaper acționează prin inhibarea Drosophila IAP (DIAP1) .4

La Drosophila melanogaster a mai fost identificat un factor reglator DREP 1 5, omolog DFF 45, care inhibă apoptoza indusă de CIDE A.