Cercetari Privind Efectele Hipertiroidismului Experimental la Gaina
CUPRINS
1. Partea întâi: Studiu bibliografic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..2
1.1. Generalități privind funcțiile hormonilor. . . . . . . . . . . . .3
1.1.1. Integrarea neuro – endocrină în controlul proceselor fiziologice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4
1.1.2. Sinteza de hormoni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.1.2.1. Sinteza hormonilor proteici. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.1.2.2. Sinteza hormonilor steroizi . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
1.1.2.3. Transportul sanguin al hormonilor proteici . . . . . .10
1.1.2.4. Transportul sanguin al hormonilor steroizi și tiroidieni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .10
1.1.3. Efectul cascadă al activității hormonale. . . . . . . . . .11
1.1.4. Interacțiunea hormon – celulă. . . . . . . . . . . . . . . . . .12
1.1.5. Răspunsul celular la interacțiunea hormon- receptor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14
1.1.6. Metabolismul hormonilor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.1.7. Mecanisme de control feedback al secreției de hormoni. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
1.2. Fiziologia tiroidei la mamifere și păsări. . . . . . . . . . . .19
1.2.1. Secreția de hormoni tiroidieni – mecanisme. . . . . . .19
1.2.2. Mecanisme de reglare a secreției hormonilor tiroidieni iodurați.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23
1.2.3. Efectele biologice ale tiroxinei. . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2. Partea a doua: Cercetări propii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30
2.1. Organizarea experimentelor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.2. Materiale și metode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.2.1. Determinarea numărului de eritrocite . . . . . . . . . . .32
2.2.2. Dozarea hemoglobinei . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
2.2.2.1. Determinarea conținutului în hemoglobină al sângelui prin metoda cu cianmethemoglobină.. . . . . . . . . 33
2.2.3. Întocmirea formulei leucocitare . . . . . . . . . . . . . . . .34
2.2.4. Determinarea hematocritului. . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.2.5. Numărarea trombocitelor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.2.6. Calculul constantelor sanguine și al unor indici eritrocitari derivați. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39
2.2.7. Determinarea activității transaminazelor serice ALT și AST. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41
2.2.7.1. Determinarea activității alanin – aminotransferazei (ALT, GPT). .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42
2.2.7.2. Determinarea activității aspartat– aminotransferazei (GOT). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.2.8. Determinarea activității gamma – glutamil transferazei (GGT). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
2.2.9. Determinarea activității fosfatazei alcaline. . . . . . . 45
2.2.10. Dozarea calciului seric . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.2.11. Dozarea fosforului seric . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.2.12. Dozarea magneziului seric . . . . . . . . . . . . . . . . . .52
2.2.13. Dozarea tiroxinei. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55
2.2. Rezultate și discuții . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56
Concluzii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
Bibliografie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74
BIBLIOGRAFIE
BABICH, H., ANTONYAC, H., SKLYAROV, A.A.Y. (2000) – The influence of thyroxine on intensity of energy metabolism in bone marrow myeloid cells and neutrophylic polymorphonuclear leucocytes of neonatal pig; Endocrine regulations, vol. 2; pp. 22-27.
BARTHA, T., DEWIL, E., RUDAS, P., KUHN, E. R., SEANES, C.G., DECUYPERE, E. (1994) – Kinetic parameters of plasma thyroid hormone and thyroid hormone receptors in a DWARF and control line of chicken. General and [NUME_REDACTAT], 96; pp. 140-148.
BILDIK, A., BELG, F., YUR, F., ALKAN, M., KILIALP, D. (2002) – The effect of hyperthyroidism on the levels of Na+ATP+ase, glucose 6 phosphate dehidrogenase and glutathione. Vol 57(2).
CARTER, W.J., BENJAMIN, W.S., FAAS, F.H. (1982) – Effects of experimental hyperthyroidism on protein turnover in skeletal and cardiac muscle as measured by [14C] thyroid infusion, 204; pp. 69-74.
CLARCK, L.C., BECK, E. (1999) – Plasma alkaline phosphatase activity. I. Normative data for growing children; Journal of Pediatrics, 24,2, pp. 335-341.
CUNINGHAM, J.G. (1993) – Textbook of [NUME_REDACTAT]. Editura W.B. Saunders, SUA.
DARRAS, V.M., GRIS, K.L., BUYSE, J., BERGHMAN, L.R., DECUYPERE, E., KUHN, E.R. (1997) – Thyroid hormone secretion and peripheral deiodination in the chicken: hormonal and nutritional influences. Perspectives in [NUME_REDACTAT], pp 317-328.
DARRAS, V. M., VAN DER GEYTEN, S., KUHN, E.R. (2000) – Thyroid hormone metabolism in poultry. Biotechnol. Agron. Soc. Environ, 4(1), pp. 13-20.
DECUYPERE, E., KUHN, E. R. (1998) – Thyroid hormone secretion and peripheral deiodination in the chicken: hormonal and nutritional influences. Perspectives in [NUME_REDACTAT], pp. 317-328.
DOJANĂ, N. (2000) – Fiziologia animalelor domestice, Ediția II, [NUME_REDACTAT], București.
DOJANÃ, N., DINISCHIOTU, A., MILITARU, M. (2002) – The effect of thyroxine, insulin, hydrocortisone or adrenaline administration on pancreatic exocrine secretion in rabbit. 7th [NUME_REDACTAT] Congress, Valencia, Spania.
DOJANÃ, N., ELEFTERESCU, H., COTOR, G., MIHALACHE, F., ORÃȘANU, A., OGNEAN, L. (2001) – Evolution of laying eggs diagram and haematological parameters in thyroxine treated Leghorn hens. Simpozionul la 140 de ani; Facultatea de [NUME_REDACTAT] din București, [NUME_REDACTAT] Bucurescensis.
DOJANÃ, N., OGNEAN, L., COTOR, G., CODREANU, I. (2002) – Lucrări practice de fiziologie animală. [NUME_REDACTAT], București.
DUMITRU, I.F., IORDÃCHESCU, D. (1971) – Enzime, structură și mecanism de acțiune. [NUME_REDACTAT], București.
GARY, D., BUTCHER, D.VM., PH., D., CURTIS, B. (1999) – [NUME_REDACTAT] (Thyroid hyperplasia or dysplasia) .
GHERGARIU, S. (1980) – Oligominerale și oligomineraloze. [NUME_REDACTAT], București.
GHERGARIU, S., POP, A., KADAR, L., SPÂNU, M. (1999) – Manual de laborator clinic veterinar. [NUME_REDACTAT] Educațional.
GUYTON, A.C. (1997) – Fiziologie. Fiziologie umană și mecanismele bolilor, a 5-a ediție. Ediția în limba română sub redacția R. Cârmaciu. [NUME_REDACTAT] Amaltea, WB Saunders.
KAASIK, A., MINAJEVA, A., PAJU, K., EIMRE, M., SEPPET, M.K. (1997) – Thyroid hormones differentiallis effect sarcoplasmic reticulum function in rat atri and ventricles. Mol. Cell. Biochem. 176(1-2), pp. 119- 126.
KEVIN, R.S., JONAS, N.B., JAMES, L., SREEKUMARAN, K.N. (2001) – T3 increases mitochondrial ATP production in oxidative muscle despite increased expression of UCP2 and -3. Physiol. Endocrinol. Metab. ,vol. 280, Issue 5, E761- E769.
KUHN, E.R., VERHEYEN, G., CHIASSON, R.B., HUTA, C., HUYBRENEHTS, L.M., VAN DER STEEN, P., DECUYPERE, E. (1987) – Growth hormone stimulates the peripheral conversion of thyrosine into triidothyrosine by increasing the liver 5’- monodeiodinase activity in the fasted and normal fed chicken. Hormone and [NUME_REDACTAT]. 19, pp. 304- 308.
LOWRY, O.H., ROSSENBROUGH, N.Y. (1981) – Japn. J. BIol. Chem. 193, pp.265-275.
MANTA, I., CUCUIANU, M., BENGA, G., HODÂRNÃU, A. (1970) – Metode biochimice în laboratorul clinic. Editura “ Dacia”, Cluj-Napoca.
Mc NABB, F.M., LYONS, L.J., HUGHENS, T.E. (1984) – Free thyroid hormones in altricial (ring doves) versus precocial (Japanesse quail) develepment. Endocrinology, vol. 115, pp. 2311-2136.
MIHALACHE, F. (1999) – Efectele tiroxinei, adrenalinei, hidrocortizonului și insulinei asupra unor parametri hematologici la iepurile domestic. Lucrare de diplomă, îndrumător Conf. univ. dr. N. Dojană, U.S.A.M.V. București.
MONTI, M., HEDNER, P., IKOMI-KUMM, J., VALDE-MARSSON, S. (1987) – Erythrocyte thermogenesis in hyperthyroid patiens: Microcalorimetric investigation of sodium, potassium pump and cell metabolism. Metabolism. 36(2), pp. 155-159.
NEHAL, M., BAQUER, N.Z. (1998) – Changes in hexokinaze and glucose 6 pkosphate dehydrogenase in red cells during hypo- and hyperthyroidicm. Biochim. Intern. 19(1), pp.193-199.
OCARINO, N.M., SERAKIDES, R., NUNES, V.A. (2003) – Does the estrogenic phase modify the bone and mineral metabolism response in rats under hyperthyroidism? Arq. Bras. MED. Vet. Zootec. vol. 55, no 4, [NUME_REDACTAT].
REECE, W.O. (1996) – Physiology of domestic animals. 2nd Edition, Williams & [NUME_REDACTAT].
SEKIMOTO, K., IMAI, K., SUZUKI, M., TAKIKAWA, H., HOSHINO, N. (1987) – Thyroxin – induced molting and gonadal function of laying hens. [NUME_REDACTAT]. 66(4), pp. 752-756.
SERAKIDES, R., NUNES, V.A., NASCIMENTO, E.F., SILVA, C.M., RIBEIRO, A.F.C. (2000) – Reletionship between thyroid, gonads and plasmatic levels of phosphorus, calcium and alkaline phosphatase in rats. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.52, no. 6, pp.579-595.
ȘERBAN, M., CÂMPEANU, Gh. (1986) – Lucrări practice de biochimie medicală. Atelierele de multiplicat cursuri ale [NUME_REDACTAT] “ N. Bălcescu “, București.
ȘERBAN, M., CÂMPEANU, Gh., IONESCU, E. (1993) – Metode de laborator în biochimia animală. [NUME_REDACTAT], București.
TACU, A. (1968) – „t”-Test in Statistic methods in zootechny and veterinary medicine. [NUME_REDACTAT], Cluj- Napoca. Pp.21-53.
TÃMAȘ, V., ȘERBAN, M., COTRUȚ, M. (1982) – Biochimie medicală veterinară. [NUME_REDACTAT] și Pedagogică, București.
TIXIER-BIOCHARD, M., DECUYPERE, E., HUYBRECHTS, L., KUNHN, E.R., MERAT, P. (1990) – Effects of dietary T3 on growth parameters and hormone levels in normal and sex- linked Dwarf chicken. [NUME_REDACTAT] Endocrinology. 7(4), pp. 573-586.
THOMPSON, J.C., ELLISON, R.S., KIRK, J. (1997) – Serum thyroid hormone concentrations in [NUME_REDACTAT] horses. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]. 45(1), pp.11-14.
VERHEYEN, G., DECUYPERE, E., KUNHN, E.R., HERREMANS, M. (1986) – Dissociation of the effect of thyroxine and triiodothyronine in relation to the halt, egg laying and moult in hens. Arhiv fur [NUME_REDACTAT]. 40(2), pp. 573-586.
=== Lucrare de diploma ===
1. PARTEA ÎNTÂI
STUDIU BIBLIOGRAFIC
1.1. Generalități privind funcțiile hormonilor
Sistemul endocrin are rolul de a controla, coordona și regla procesele fiziologice din organismul animal. Acest sistem utilizează mesageri chimici denumiți hormoni. Hormonii sunt substanțe chimice produse de glande endocrine specifice, transportate de sistemul vascular sanguin și care, în doze mici, sunt capabile să afecteze activitatea unor organe țintă situate la distanță de locul secreției. Există, însă, substanțe incluse în categoria hormonilor, cum ar fi prostaglandinele și somatomedinele, care sunt produse nu de un anumit organ ci de numeroase țesuturi. Alte sisteme de control utilizează substanțe chimice care nu sunt transportate de sânge pentru a influența activitatea unor celule situate la distanță. Toate aceste sisteme servesc ca mijloace de integrare în sau între celule. Substanțele eliberate de aceste sisteme sunt denumite: (1) efectori endocrini, când mesagerul este vehiculat de sânge; (2) efectori paracrini, când mesagerul difuzează prin fluidul interstițial pentru a influența celulele adiacente; (3) efectori autocrini, când mesagerul acționează chiar asupra celulei sale de origine (fig. 1); (4) efectori exocrini, când substanțele sintetizate sunt eliminate din corp și (5) neurotransmițători, când mesagerul afectează comunicările între neuroni sau între neuroni și celulele țintă (fig. 2).
1.1.1. Integrarea neuro-endocrină în controlul proceselor fiziologice
Sistemul endocrin interacționează cu sistemul nervos în coordonarea proceselor fiziologice. Un exemplu de interacțiune strânsă între cele două sisteme reglatoare este reflexul de eliberare a laptelui: mulsul sau alăptarea determină excitarea terminațiilor nervoase senzitive din glanda mamară iar excitațiile sunt conduse pe căi senzitive la hipotalamus. Neuronii neurosecretori din nucleii supraoptic și paraventricular sunt stimulați pentru sinteza oxitocinei. Oxitocina este transportată de-a lungul axonilor acestor neuroni până la hipofiza posterioară, din care este eliberată în sânge. Sângele transportă oxitocina la glanda mamară unde determină contracția celulelor mioepiteliale care înconjoară alveolele mamare, unitățile structurale secretoare de lapte. Sub presiunea creată de contracția celulelor mioepiteliale, laptele din alveole este eliminat în canalele galactofore și de aici în cisternele mamare, de unde poate fi extras prin muls sau supt.
Interacțiunea dintre sistemul nervos și cel endocrin poate fi și mai directă. Un exemplu îl constituie celulele endocrine din medulosuprarenală a căror activitate secretoare este controlată direct de către neuronii preganglionari. Aceasta permite eliberarea imediată a hormonilor medulosuprarenali ca răspuns la factorii de stres. Unele substanțe, cum ar fi adrenalina, dopamina, histamina și somatostatinul, sunt întâlnite atât în sistemul nervos cât și în cel endocrin.
Sistemul endocrin este implicat în controlul unor funcții cum ar fi metabolismul, creșterea și reproducția. Una din subdiviziunile metabolismului este cea în metabolism energetic și metabolism al substanțelor minerale. Printre hormonii care controlează metabolismul energetic se numără: insulina, glucagonul, cortizolul, adrenalina, tiroxina și hormonul de creștere. Printre hormonii care controlează metabolismul substanțelor minerale se numără: hormonul paratiroidian, calcitonina, angiotensina și renina. Printre hormonii care controlează creșterea se numără: hormonul de creștere, tiroxina, insulina, estrogenii și androgenii precum și un mare număr de factori de creștere. Hormonii care controlează reproducția includ: estrogenii, androgenii, progesteronul, hormonul luteinizant (LH), hormonul foliculostimulant (FSH), prolactina și oxitocina.
Una dintre cele mai importante caracteristici ale sistemului endocrin este amplificarea semnalului. O moleculă de hormon steroid poate determina formarea mai multor molecule de ARNm, fiecare dintre acestea inducând sinteza a numeroase molecule enzimatice. De asemenea, o moleculă proteică poate influența formarea a numeroase molecule de AMPc, ficare dintre acestea putând activa numeroase enzime. Amplificarea stă la baza sensibilității sistemului endocrin, aceasta permițând unor mici cantități de hormon din plasmă (9-11 – 9-12) să exercite efecte mari. O altă particularitate a sistemului endocrin este aceea că el influențează doar rata derulării unor reacții enzimatice, fără a iniția noi reacții. De asemenea, hormonii acționează lent și prelungit, efectele lor apărând după minute sau zile, ceea ce contrastează cu sistemul nervos, ale cărui efecte sunt rapide și de scurtă durată (de la milisecunde la secunde) [11].
1.1.2. Sinteza de hormoni
Majoritatea hormonilor sunt proteine (hormonul de creștere, insulina, hormonul adrenocorticotrop), peptide (oxitocina, vasopresina), amine (dopamina, melatonina, adrenalina) sau steroizi (cortizolul, progesteronul, vitamina D etc).
1.1.2.1. Sinteza hormonilor proteici
Proteinele și polipeptidele hormonale sunt sintetizate sub forma unor precursori proteinici cunoscuți sub numele de preprohormoni (fig. 3). În timpul sintezei, preprohormonul este eliberat în interiorul reticulului endoplasmic rugos (RER). O peptidază din peretele RER elimină porțiunea “pre” din molecula preprohormonului eliberând prohormonul care părăsește RER containerizat în vezicule. Aceste vezicule sunt preluate de aparatul Golgi unde se unesc cu membranele Golgi formând granule de secreție. În timpul acestui proces, prohormonul este clivat eliberând hormonul activ, astfel că majoritatea granulelor de secreție conțin hormonul activ.
Hormonii proteici sunt stocați sub forma granulelor de secreție în citoplasma celulelor secretoare până la eliberarea lor. Deși o parte din secreția hormonală este eliberată continuu, cea mai mare parte a granulelor de secreție este eliberată prin exocitoză, sub forma granulelor de secreție, ca răspuns la acțiunea unui semnal specific. Procesul de exocitoză necesită prezența adenozintrifosfatului (ATP) și a calciului. Creșterea calciului citoplasmatic rezultă din eliberarea intracelulară a calciului din mitocondrii, reticul endoplasmic sau prin influx extracelular [6].
1.1.2.2. Sinteza hormonilor steroizi
Hormonii steroizi reprezintă o clasă de hormoni care, spre deosebire de hormonii proteici, sunt lipofili. În general, ei sunt grupați în două categorii: hormoni adrenocorticoizi (glucocorticoizi, mineralocorticoizi) și hormoni sexuali (estrogeni, androgeni, progesteron). Toți hormonii steroizi prezintă în molecula lor un schelet comun alcătuit din 17 atomi de carbon derivat de la colesterol. Deși steroizii pot fi sintetizați de novo în celulă pornind de la acetat, majoritatea hormonilor steroizi sunt formați pornind de la colesterol care este sintetizat în ficat. Lipoproteinele cu densitate mică pătrund în celula secretoare de steroizi în urma interacțiunii cu un receptor de membrană. Sub acțiunea lizozomilor, din veziculele lipoproteice este eliberat colesterolul care este utilizat imediat în sinteza de hormoni steroizi sau stocat sub forma unor vezicule în celulă. Primul pas în sinteza tuturor hormonilor steroizi este clivajul catenei laterale a colesterolului cu formarea pregnenolonului, ceea ce are loc în mitocondrii. Următoarele etape ale sintezei de steroizi se pot desfășura în mitocondrii sau pot implica mișcarea în alte compartimente celulare. Controlul mișcarii steroizilor între diferite compartimente celulare este încă insuficient cunoscut [25].
Sinteza diferitelor tipuri de hormoni steroizi este condiționată de prezența unor enzime specifice în fiecare tip de celulă. De exemplu, numai celulele din corticosuprarenală conțin hidroxilazele a căror activitate determină hidroxilarea nucleului steranic la C-11 și C-21 în vederea sintezei de glucocorticoizi și mineralocorticoizi. Biosinteza steroizilor sexuali presupune modificarea pregnenolonului cu trecerea prin stadiile de progesteron, androgeni și, în final, estrogeni. Celulele care sintetizează androgeni (de exemplu, celulele Leydig din testicol) posedă enzimele pentru formarea pregnenolonului și a progesteronului precum și enzimele necesare transformării progesteronului în androgeni dar nu posedă enzimele necesare pentru convertirea androgenilor la estrogeni. Celulele care sintetizează hormoni steroizi sexuali nu posedă enzimele pentru sinteza de hormoni corticosuprarenalieni, în schimb, corticala suprarenală conține sistemele enzimatice pentru sinteza atât a steroizilor sexuali cât și a corticosteroizilor, cei din urmă fiind predominanți. Aceasta face ca glanda corticosuprarenală să producă în mod normal o cantitate redusă de steroizi sexuali, cantitate care crește considerabil în condiții patologice.
Hormonii steroizi nu sunt depozitați în celula secretoare; ei sunt eliminați imediat din celulă prin simplă difuziune transmembranară datorită proprietăților lor de liposolubilitate. Astfel, sinteza hormonilor steroizi este strâns legată de excreția acestora, rata de secreție hormonală fiind controlată de rata sintezei. Singura formă de stocare a steroizilor în celula secretoare este molecula precursoare, colesterolul [10].
1.1.2.3. Transportul sanguin al hormonilor proteici
Formele de transport sanguin al hormonilor diferă cu solubilitatea acestora în plasmă. Hormonii proteici și cei peptidici sunt hidrofili și sunt transportați în plasmă sub formă dizolvată. Hormonii proteici pot circula sub formă monomerică (o singură subunitate) sau sub formă polimerică (mai multe subunități, de exemplu, insulina). Hormonii care au subunități pot să apară în circulație sub formă de subunități, deși aceasta reduce puterea biologică a moleculei.
1.1.2.4. Transportul sanguin al hormonilor steroizi și tiroidieni
Transportul hormonilor steroizi și al celor tiroidieni este mult mai complicat decât al hormonilor proteici, deoarece acești hormoni sunt lipofili, ceea ce le conferă insolubilitate în soluții apoase. Acești hormoni sunt transportați în sânge pe diferite suporturi proteice. Unele proteine care leagă hormoni steroizi prezintă o afinitate deosebită pentru un anumit hormon steroid. De exemplu, o globulină denumită transcortină are o mare afinitate pentru cortizol și corticosteron, dar servește ca suport și pentru transportul progesteronului, deși pentru acest hormon prezintă o afinitate mai scăzută. Proteinele de transport care prezintă o mare afinitate prezintă în schimb o slabă capacitate de transport. Albuminele plasmatice prezintă o afinitate scăzută pentru homonii steroizi dar au o capacitate mare de transport datorită concentrației lor mari în plasmă [29].
Hormonul trebuie să fie sub formă liberă sau nelegat atunci când pătrunde în celula țintă pentru a-și exercita rolul biologic. Aceasta impune stabilirea unui echilibru între forma legată și forma liberă a hormonului în plasmă. Obișnuit, forma liberă reprezintă doar 1% din totalul unui hormon în plasmă (o excepție o constituie cortizolul, a cărui formă liberă în plasmă poate atinge 10%). Utilizarea celulară a formei libere determină disocierea hormonului legat de pe proteina transportoare și completarea rapidă a procentului de hormon liber. Obișnuit este reprezentată cantitatea totală de hormon (liber și legat), excepție facând hormonii tiroidieni iodurați. Așa după cum a fost arătat deja, sinteza și eliberarea hormonilor steroizi sunt strâns legate. Cum rata de clearance metabolic este relativ constantă, concentrația plasmatică a steroizilor reflectă fidel rata secreției. În anumite condiții fiziologice, cum ar fi gestația la femeie, metabolismul estrogenilor poate fi intensificat datorită unei cantități mai mari de proteine transportoare [6].
1.1.3. Efectul cascadă al activității hormonale
Controlul funcțiilor metabolice de către sistemul endocrin poate conduce la o amplificare de tip cascadă sau „pas cu pas” a efectelor hormonale ceea ce face posibil controlul unui proces metabolic final prin intermediul unei cantități reduse de hormon. Un exemplu este cel prezentat în fig. 4: o cantitate infimă de corticotropin-releasing hormone (CRH) determină o serie de evenimete care au ca finalitate depozitarea unei cantități imense de glicogen în ficat. În exemplul respectiv, cantitatea de glicogen depozitat este de 56.000 de ori mai mare decât cantitatea de CRH care a determinat formarea acestui depozit [24].
1.1.4. Interacțiunea hormon-celulă
O problemă centrală a endocrinologiei a constituit-o cercetarea modalităților de interacțiune specifică dintre hormoni și celulele țintă. Problema este aproape covârșitoare pentru hormonii steroizi care, fiind liposolubili, sunt capabili să penetreze toate celulele corpului. Soluția interacțiunii specifice hormon-celulă este prezența receptorilor specifici pe membrana celulelor țintă. Receptorii pentru hormonii steroizi sunt localizați în citoplasma sau nucleul celulelor țintă în timp ce receptorii pentru hormonii proteici și cei peptidici sunt localizați pe membrana celulară. În plus, receptorii prezintă un grad înalt de afinitate pentru hormonul lor specific. Aceste caracteristici ale receptorilor permit hormonilor ca, în concentrații scăzute în sânge, să obțină răspunsuri tisulare semnificative.
Cu cât afinitatea receptorului pentru hormon este mai mare, cu atât răspunsul biologic este de mai lungă durată. Încheierea acțiunii hormonului impune obișnuit disocierea hormon-receptor. Aceasta se produce cel mai adesea ca rezultat al scăderii concentrației plasmatice a hormonului. Legătura hormon-receptor fiind necovalentă, scăderea concentrației plasmatice a hormonului determină deplasarea echilibrului în favoarea disocierii. Încheierea acțiunii receptorului poate apare și ca rezultat al internării complexului hormon-receptor printr-un proces de endocitoză. În acest caz, hormonul este degradat de către enzimele lizozomale în timp ce receptorul, protejat de membrana veziculară, poate fi reciclat către plasmalemă.
Numărul receptorilor prezenți pe membrana celulară este mult mai mare decât cel necesar pentru exercitarea rolului biologic al hormonilor. Un grad de ocupare a receptorilor sub 50% este obișnuit suficient pentru exercitarea unui efect biologic maxim. Chiar astfel, reducerea numărului de receptori poate reduce sensibilitatea celulei, astfel că legarea hormonului să nu mai determine efectul biologic maxim. Schimbarea numărului de receptori modifică probabilitatea interacțiunii hormon-receptor. Stimularea sintezei de receptori poate fi determinată de un hormon diferit de cel care interacționează cu receptorul respectiv. De exemplu, receptorii pentru LH de pe celulele granuloasei ovariene predomină față de cei pentru FSH în ultima perioadă a fazei foliculare, ca urmare a influenței FSH. Aceasta permite foliculului să treacă de sub controlul FSH sub controlul LH, ceea ce facilitează ovulația și formarea corpului galben. Invers, numărul de receptori poate să scadă datorită unei interacțiuni hormon-receptor prelungite. Aceasta apare deseori în legătură cu administrarea unui antagonist cu afinitate mare pentru receptor sau în situații în care cantitatea de hormon este crescută patologic. În această situație, numărul de receptori scade. În final, animalul devine refractar la tratamentul cronic cu hormonul în cauză [6].
1.1.5. Răspunsul celular la interacțiunea hormon- receptor
Evenimentele care urmează după legarea hormonului de receptor depind de tipul de hormoni (proteici sau steroizi) implicați. Hormonii proteici necesită un intermediar pentru a interacționa cu interiorul celulei deoarece ei nu sunt capabili să penetreze plasmalema; această substanță intermediară este cunoscută sub numele generic de mesager secundar. Cel mai cunoscut mesager secundar este adenozin monofosfatul ciclic (AMPc). AMPc este produs prin activarea unei enzime, adenilat ciclaza, în urma interacțiunii hormonului cu receptorul. Activarea adenilat ciclazei și sinteza AMPc au ca efect fosforilarea protein-kinazei, care este responsabilă de răspunsul biologic.
Rolul de mesager secundar al AMPc a fost descoperit ca urmare a studiilor efectuate asupra acțiunii adrenalinei asupra ficatului, unde adrenalina determină eliberarea de glucoză (fig. 5).
În acest caz, fosforilaz kinaza activată de protein kinază catalizează formarea fosforilazei a active, enzima cheie în activarea glicogenului în vederea hidrolizei acestuia. Alți mesageri secundari sunt calciul citosolic, calmodulina, inozitoltrifosfatul și diacilglicerolul, ultimii doi provenind din metabolismul fosfatidil-inozitolului. Inozitoltrifosfatul determină eliberarea calciului intracelular. Diacilglicerolul activează fosfolipaza A și formarea acidului arahidonic, ceea ce duce la formarea de prostaglandine. Răspunsul biologic la interacțiunea hormon proteic-receptor este mult mai rapid decât în cazul steroizilor deoarece în acest caz sunt activate enzime deja preexistente, comparativ cu hormonii steroizi, care necesită sinteza proteinelor enzimatice.
În cazul hormonilor steroizi, aceștia sunt capabili să interacționeze cu interiorul celulei datorită abilității lor de a penetra plasmalema. Interacțiunea receptorului cu hormonul steroid duce la activarea complexului, care pătrunde în nucleu și interacționează cu situsuri cromatinice specifice. Rezultatul este sinteza de ARNm care, translocat pe ribozomi, direcționează sinteza de proteine ce produc efectul biologic dorit [18].
1.1.6. Metabolismul hormonilor
Activitatea hormonală este limitată de catabolizarea hormonilor respectivi. Catabolizarea steroizilor implică obișnuit reducerea moleculei lor și conjugarea lor cu sulfați sau glucuronizi, ceea ce crește solubilitatea lor în apă, permițând excretarea prin urină. Ficatul este principalul organ responsabil de conjugarea steroizilor. Hormonii tiroidieni iodurați sunt inactivați prin eliminarea din molecula lor a iodului. Hormonii proteici sunt hidrolizați de proteaze, după reducerea, eventual, a punților disulfidice din molecula lor. Majoritatea produșilor de catabolism hormonal au activitate biologică mult mai slabă decât hormonii din care provin; unii steroizi conjugați prezintă, însă, o activitate biologică semnificativă. Un exemplu îl constituie conversia testosteronului la dihidrotestosteron. Considerat o formă de catabolizare a testosteronului, dihidrotestosteronul este de fapt mai potent biologic decât testosteronul. Un alt exemplu este conversia 17-estradiolului la estronă, în țesuturile periferice, inclusiv celulele adipoase. Considerată tot o formă de catabolism, estrona este un estrogen natural relativ potent. În general, catabolizarea hormonilor este un proces relativ constant, astfel încât concentrația plasmatică a hormonilor reflectă relativ fidel rata sintezei acestora. Rata de clearance hormonal poate fi modificată: ea poate să scadă ca rezultat al unei concentrații plasmatice mărite a proteinelor de transport hormonal, sau să crească datorită unei concentrații reduse a proteinelor transportoare [25].
1.1.7. Mecanisme de control feedback al secreției de hormoni
Efectele hormonilor sunt proporționale cu concentrațiile lor sanguine. Astfel, controlul concentrațiilor hormonale plasmatice este de importanță deosebită în reglarea funcțiilor fiziologice. Așa după cum a fost prezentat, unul din importanții factori care afectează concentrația hormonilor în sânge este rata secreției acestora. Un mecanism de control al concentrației hormonale este așa-numitul mecanism feedback, în care concentrația de hormon este monitorizată la o anumită valoare prin creșterea sau scăderea ratei de secreție de către un anumit organ. Cel mai obișnuit sistem feedback este feedback-ul negativ, în care monitorizarea continuă permite sistemului să contracareze variațiile de secreție hormonală sau să mențină un mediu relativ constant.Un exemplu de feedback negativ este prezentat în fig. 6. Hipotalamusul controlează secreția anterohipofizară de hormoni tropi prin intermediul hormonilor de eliberare. Sub acțiunea hormonilor de eliberare hipotalamici, anterohipofiza secretă hormoni tropi cu efect stimulator asupra diferitelor glande endocrine țintă (suprarenală, gonade, tiroidă). Hipotalamusul prezintă celule care pot analiza concentrațiile sanguine ale hormonilor glandelor țintă ale anterohipofizei (suprarenală, gonade, tiroidă). Creșterea concentrației sanguine a hormonilor glandelor țintă are efect inhibitor asupra secreției hipotalamice de hormoni de eliberare. Astfel, în cazul acestui sistem de control feedback negativ, o creștere a concentrației hormonilor glandelor țintă determină o scădere a secreției de hormoni hipotalamici de eliberare și o scădere a hormonilor tropi hipofizari.
Există și mecanisme de control feedback negativ în care creșterea concentrației unei substanțe din sânge, de exemplu glucoza, stimulează creșterea secreției unui hormon, insulina, cu rol important în metabolizarea glucozei. Stimularea secreției de insulină de către glucoza sanguină este considerată tot un sistem feedback negativ deoarece concentrația sanguină a glucozei este scăzută către valorile normale prin acțiunea insulinei.Sistemele de feedback pozitiv sunt mult mai rare decât cele de control feedback negativ. Un exemplu de control feedback pozitiv este creșterea secreției de LH în timpul ultimei faze de evoluție a foliculului ovarian sub influența secreției crescute de estrogeni. Secrețiile homonale pot fi modificate și în afara mecansimelor feedback. Unele secreții hormonale se modifică ritmic la intervale de circa 24 de ore, constituind bioritmuri circadiene sau diurnale [11].
1. 2. Fiziologia tiroidei la mamifere și păsări
1.2.1. Secreția de hormoni tiroidieni – mecanisme
Tiroida este cea mai importantă glandă endocrină cu rol in reglarea metabolismului. În structura sa, tiroida prezintă celule foliculare și parafoliculare. Celulele foliculare sunt aranjate pe un singur strat in jurul unor cavități pline cu lichid, cu care formează foliculii tiroidieni.Aceste celule au o formă diferită astfel, pot fi cuboidale când secreția tiroidiană este bazală și alugite când glanda este stimulată în vederea eliberării hormonale. Lichidul folicular rezultat este singura formă de depozitare a hormonilor tiroidieni si contine o substanță coloidală ce se coloreză omogen. Celulele parafoliculare sau celulele C se gasesc între foliculi și secretă calcitonină, un hormon neiodurat cu rol în metabolismul calciului.
Sinteza hormonilor tiroidieni iodurați se realizează pe baza a două molecule: tirozină si iodul. Tirozina face parte din lanțul de aminoacizi ai tiroglobulinei (proteina TBG,thyroxine bilding globuline), ce este sintetizată în celulele foliculare și secretată în lumenul folicular. Iodul provine din aport exogen , absorbit la nivel intestinal sub formă de iodură și trasportat la nivelul tiroidei de către sânge. Captarea iodurii de către celulele foliculare se realizează printr-un transport activ trasmembranar,astfel se ajunge la concentrații de 25 până la 250 de ori mai mari ale iodului in celulele foliculare decât in sânge. Aici iodul este oxidat la iod elementar care va fi legat la inelul de tirozil, ce poate lega ori un singur atom de iod și se numește monoiodotirozină (MIT) sau doi atomi de iod și se numește diiodotirozină (DIT). Tirozinaza catalizează iodinarea restului tirozil din structura TBG și odată astfel formate ele se pot condensa: o moleculă de DIT cu o moleculă de MIT ducănd la formarea triiodotironinei (T3) sau doua molecule de DIT între ele ducănd la formarea de tetraiodotironină (T4). Rezultă hormonii tiroidieni, singurii hormoni care au în structura lor o moleculă de halogen și anume, iodul. În acest proces de sinteză un rol importat îl are enzima tiroperoxidaza si un oxidant, peroxidul de hidrogen.
Depozitarea lui T3 și T4 are loc in mod neobișnuit, fiind vorba de o depozitare extracelulară în lumenul creat prin aranjarea circulară a celulelor glandulare. Hormonii rămân în lumenul folicular până când celula foliculară este stimulată pentru eliminarea lor. Stocarea are loc sub formă coloidală și permite glandei formarea unor mari rezerve de hormoni ceace permite animalelor traversarea unor perioade lungi de privare a aportului de iod fară efecte imediate asupra producței de hormon tiroidieni.
Pentru eliberarea hormonilor tiroidieni în sânge aceștia trebuiesc translocați înnapoi în celulele foliculare și anume la nivel lizozimal, unde are loc clivarea globulinei TBG pe care sunt atașate moleculele de MIT, DIT, T3 și T4. Aici are loc atât clivarea moleculelor de tirozină iodinată cât și cea de tirozină neiodinată din molecula tiroglobulinei. MIT și DIT sunt deiodinate de către o enzimă numită iodotirozin dehalogenază iar iodul și tirozina eliberate sunt recirculate pentru formarea a noi molecule de hormon în asociere cu tiroglobulina. Numai T3 și T4 parăsesc celula prin polul bazal al acesteia, printr-o liberă trecere [29].
La nivel sanguin cea mai mare cantitate de T3 nu provine de la nivelul tiroidei, ci prin “formarea” la nivelul altor țesuturi. Are loc de fapt o deiodinizare a inelului fenolic interior al T4, rezultând un compus denumit reversT3 (rT3), realizată numai de către enzimele extratiroidiene deiodinatoare (nu prin activitatea glandei tiroide) și prezintă slabe efecte biologice. Enzima împlicată în îndepărtarea unui ion de iod din restul fenolic exterior al T4 este numită 5’-monodeiodinaza. Cea mai mare cantitate de enzime deiodinatoare se găsesc la nivelul ficatului și rinichi, deși țesutul care necesită cea mai mare cantitate de T3 este mușchiul.
Hormonii tiroidieni sunt hormoni liposolubili de aceea tronsportul lor sanguin se face prin legarea acestora de o proteină transportoare. Există mai multe tipuri de proteine trasportoare pentru hormonii tiroidieni iodurați cu o mare varietate în funcție de specie. Cea mai importantă este globulina trasportoare de tiroxină (TBG) care prezintă o afinitate crescută pentru T4, dar cu capacitate scăzută de transport datorită concentrației sale redusă în plasma sanguină. Aceasta este un bun trasportor și pentru T3 și a fost identificată la majoritatea speciile de animale, cu excepția pisicii. Altă proteină împlicată în trasportul lor este albumina, cu afinitate scăzută, dar capacitate ridicată datorită concentrației crescute în plasmă. Pentru transportul T4 a fost identificată la toate speciile o a treia proteină plasmatică,pre-albumina trasportoare de tiroxină,cu specificitate și afinitate intermediară între albumina trasportoare și TBG. Deci majoritatea T3 și T4 sunt legați de proteinele trasportoare și numai o cantitate mică se află liberă dar aceasta este cea care interacționează cu receptorii celulelor țintă. Cantitatea de hormoni tiroidieni iodurați afați liber în plasmă este extrem de mică: la om,0,03% pentru T4 și 0,3% pentru T3; la câine 0,15 pentru T4 și ceva peste 1% pentru T3 (cantitatea puțin mai crescute se datorează unei afinități mai scăzute a proteinelor plasmatice pentru hormonii respectivi). Echilibrul între hormonii liberi si cei legați este ușor modificat de diferite situatii fiziologice și farmacologice. Estrogenii, de exemplu, determină sinteza unor cantități mari de TBG hepatice deplasând echilibrul sanguin al hormonilor tiroidieni iodurați în favoarea formei legate. Aceasta presupune intervenția imediată a mecanismelor reglatoare in vederea menținerii constante a formei libere, pentru a evita scăderea ratei metabolice.
Principala formă de catabolizare a hormonilor tiroidieni iodurați este deiodinarea. Cele două enzime împlicate în sinteza T3 și rT3, 5’-deiodinaza și 5-deiodinaza sunt implicate și în catabolizarea hormonilor tiroidieni. Aceste două enzime sunt suficiente pentru catabolizare deoarece ele nu diferențiază între pozițiile trei și cinci din inele fenolice ale tiroinei. Mușchii scheletici, ficatul și rinichii sunt cele mai importante țesuturi implicate în catabolismul prin deiodinare al hormonilor tiroidieni iodurați. O a doua formă de inactivare a hormonilor tiroidieni iodurați este cojugarea cu sulfați și glucuronizi, în princial în ficat și rinichi. Conjugarea este o cale de inactivare mai puțin activă decât deiodinarea . O a treia formă de catabolizare a hormonilor tiroidieni iodurați este modificarea radicalului analinic al tironinei prin transaminare sau decarboxilare. Formele deiodinate și cele conjugate ale tironinei sunt eliminate în special prin urină iar tironina nemetabolizată se elimiă în special prin bilă. În intestin, din formele conjugate degradate este eliberat iodul care în parte este reabsorbit ca parte a ciclului enterohepatic. Recuperarea intratiroidiană și enterohepatică a iodului este mai eficientă la om decât la câine.
Unul dintre cele mai interesante aspecte ale hormonior tiroidieni este timpul de înjumătățire lung, T3 are un timp de înjumătățire de 1 zi iar T4 de 6-7 zile, în timp ce majoritatea celorlați hormoni au timp de injumătățire de secunde sau minute. O cauză a acestui lung timp de înjumătățire este concentrația plasmatică mare a hormonilor tiroidieni legați de proteine care îi protejeajă împotriva degradării. Timpul de înjumătățire mai lung al T4 față de T3 se datorează legăturii mai strănse a T4 cu proteina transportoare [6].
1.2.2. Mecanisme de reglare a secreției hormonilor tiroidieni iodurați
Cel mai important mecanism reglator al secreției de hormoni tiroidieni iodurați acționează prin intermediul axei hipotalamo-hipofizare. Unul din pricipalii factori neurogeni de stimulare a secreției hipotalamice de TRH (thyrotropin-releasig hormone) este frigul. TRH stimulează secreția hipofizară de tirotropină sau hormon tirostimulator (TSH, thyro-stimulating hormone). TSH acționează asupra celulelor foliculare tiroidiene prin inițierea formării de AMPc (adenozine 3’,5’-cyclic-monophosphate) și fosforilarea protein kinazei. Secreția de TSH este reglată și de nivelul hormonilor tiroidieni printr-un mecanism feedback negativ de inhibiție a secreției hipotalamice de de TRH și a secreției hipofizare de TSH. Ablația hipofizei inhibă formarea tiroxinei , cu acumularea de coloid în foliculi. Expunerea la frig stimulează în final secreția de hormoni tiroidieni crescănd consumul de oxigen și metabolismul bazal. Reacțiile psihoemoționale inhibă secreția de TRH și TSH concomitent cu reducerea fenomenelor de predomonanță simpatică generalizată.
În hipertiroidism, glanda tiroidă marită de câteva ori în volum secretă hormoni tiroidieni în cantități de 5 până la 15 ori mai mari decât normal. Nivelul sanguin al TSH este normal sau scăzut uneori până la zero. O cauză a hipertiroidismului este un anticorp globulinic plasmatic care se leaga de receptorii pentru TSH determinând producera prelungită a hormonilor tiroidieni. Hipertiroidismul se manifestă prin intoleranța la căldură, scădere în greutate, grade variate de diaree, slăbiciune musculară, exoftalmie, creșterea ratei metabolismului bazal [11].
In hipotiroidism, producția scăzută de hormoni tiroidieni determină acumularea de coloid în foliculii tiroidieni. Producția exagerată de coloid tiroidian se datorează efectului stimulator al TSH hipofizar asupra sintezelor celulelor foliculare tiroidiene, lipsind din sânge hormonii tiroidieni care să determine inhibiția secreției de TSH. Acumularea de coloid determină creșterea în dimensiuni a glandei de până la 10 ori față de normal, ceace este cunoscut sub numele de gușă. În unele regiuni ale globului, în special Alpii elvețieni și regiunea [NUME_REDACTAT] din [NUME_REDACTAT], solul conține cantități insuficiente de iod, determinând astfel instalarea semnelor carențiale la animale și oameni pe zone geografice întinse (gușa endemică). Corectarea deficiutului de iod se face prin consumarea de sare iodată.
Gușa coloidală poate să apară și în condițiile unui aport normal de iod, în caz de tiroidite, afectarea sistemelor enzimatice cu scăderea sintezei de hormoni tiroidieni sau ingestia unor furaje vegetale care conțin substanțe antitiroidiene. Printre plantele care conțin substanțe gușogene se numără napul, varza, conopida și rapița (din [NUME_REDACTAT]). Aceste plante conțin pregoitrină, substanță care în tubul digestiv este convertită la goitrină. Goitrina interferează legarea organică a iodului. Unele plate gușogene conțin tiocianați, substanțe care interferează captarea tiroidiană a iodului. Administrarea în exces de iod în furaje poate acoperi efectele tiocianaților dar nu poate acoperi efectele goitrinei. Unii tiocianați sunt utilizați în tratamentul hipertiroidismului. Cei mai puternici sunt tiocarbamații (tiourea și tiouracilul). Alte substanțe medicamentoase cu efect antitiroidian sunt sulfinamidele, acidul ρ-aminosalicilic, amfenonă, fenilbutazonă și clorpromazină. Hipotiroidismul se caracterizează prin somnolență, scăderea debitului cardiac și a volumului sanguin, constipație, scăderea capacității mintale, insuficiența multor funcții trofice ale organismului evidențiată prin scăderea creșterii părului și descuamarea pielii, iar în cazurile grave, edemațierea întregului corp (mixedem).
Dintre toate animalele domestice, câinele este cel mai adesea afectat de un sindrom de hipotiroidism. Cauza pare a nu fi alimentară ci se datorează prezenții în plasmă a anticorpilor antitiroglobulinici. La pisică, hipotiroidismul este mai fregvent la vârste înnaintate, fiind cauzat de tumori. În diagnosticarea cauzelor hipotiroidismului se utilizează testul de stimulare cu TSH a secreției tiroidiene, cu măsurarea ulterioară a concentrației T3 sau T4 din plasmă. În hipotiroidismul primar, de origine tiroidiană, răspunsul la TSH este diminuat. Determinarea concentrației plasmatice a T3 si T4 prezintă importanță în diagnostic, când valorile sunt de regulă peste limitele normale.
Tabelul 1
Valorile serice medii și limitele de variație (în paranteze) ale T4 și T3 la căteva specii de animale domestice (Cunningham,J.,1992, după Reap M.,Cass C. și Hightover D.:Thyroxine and triiodothyronine levels in ten species of animals, [NUME_REDACTAT]. 31:31,1978)
Trebuie subliniat, însă, că exită o mare variabilitate a concentrațiilor T3 șiT4, în funcție de vârstă, rasă, temperatură ambiantă, stare de sanătate. Astfel, valorile obținute trebuiesc interpretate cu precauție.
1.2.3. Efectele biologice ale tiroxinei
Hormonii tiroidieni la nivel celular interacționează direct cu nucleul pentru a iniția transcripția ARNm, dar receptori pentru T3 au fost identificați și pe mitocondrii. Pătrunderea în celulă se bazează pe faptul că acesti hormoni, fiind lipofili, pot penetra membrana celulară. Multe din efectele metabolice ale hormonilor tiroidieni iodurați au fost evidențiate prin creerea experimental de stări de hipo- și hipertiroidism, deoarece aceștia par a fi determinanți primari ai metabolismului general fiind dificil de identificat efectele lor fiziologice.
În legatură cu metabolismul glucidelor, hormonii tiroidieni, cresc absorția intestinală a glucozei si facilitează trecerea glucozei în mușchi și țesutul adipos. De asemenea facilitează prelurea insulin-mediată a glucozei de către celule iar în doze mici facilitează depunerea glucozei sub formă de glicogen în timp ce dozele mari favorizează glicogenoliza [11].
Metabolismul proteic este afectat atât în sensul intensificării proceselor catabolice, de degradare și uzură, cât și al celor anabolice, de sinteză, creștere și dezvoltare. Astfel, împreună cu hormonul de creștere, sunt necesari pentru creșterea normală realizată în parte prin stimularea preluării aminoacizilor de către celule și sistemele enzimatice implicate în sinteza de proteine. Un rol important le revine și în sinteza de protein-enzime: un experiment realizat prin administrarea timp de o săptămână a hormonilor tiroidieni a arătat o creștere a peste o sută de enzime intracelulare, chiar și enzimele mitocondriale sunt crescute și mult mai active. De asemenea mitocondriile cresc în dimensiuni și număr, in vederea formării unei cantități mai mari de ATP și a energizării funcțiilor celulare [10].
Metabolismul lipidic este afectat de hormonii tiroidieni în toate aspectele sale, dar cu o predominanță mai mare asupra lipolizei. Prezintă o particularitate hormonii tiroidieni și anume tendința de reducere a colesterolului plasmatic, prin creșterea preluării celulare a particulelor de lipoproteine cu densitate mică (LDL, low-density lipoproteins), asociate cu transportul moleculelor de colesterol, dar și prin intensificarea degradării colesterolului și a LDL. Aceste efecte ale metabolismului lipidic se întâlnesc în cazul hipersecreției tiroidiană hormonală, care are ca mecanism general și asupra celorlalte metabolisme intensificarea catabolismului. Ele se traduc prin creșterea metabolismului bazal și a consumului tisular de oxigen și, ca rezultat, creșterea producției de căldură, cunoscut sub denumirea de efect calorigen. Efectele calorigene ale hormonilor tiroidieni se exercită prin activarea pompei Na+,K+ -ATP-azice membranare si al transportului cuplat al ionilor de sodiu și potasiu cu cel al glucozei si aminoacizilor, în vederea formării și utilizării crescute de ATP. Ca urmare a intensificării reacțiilor oxidative, metabolismul bazal poate crește cu 60-100% față de valorile normale. Ca și context general se constată o scădere în greutate, uneori chiar o stimulare a peristaltismului gastrointestinal producând diaree, dar, și o stimulare a secrețiilor de enzime digestive, a apetitului și a digestiei care poate cotrabalansa scăderea în greutate determinată de creșterea ratei metabolice. În cazul hipotiroidismului apar fenomene inverse și anume de creștere în greutate datorate în special retenției de apă și acumulărilor de lipide nemetabolizate [6]
Hormonii tiroidieni prezintă importante legături și cu alte sisteme. Astfel la sistemul nervos simpatic se produce o stimulare a receptorilor β-adrenergici din celulele care sunt țintă pentru catecolamine: adrenalină și noradrenalină. În cea ce privește sistemul nervos central, hormonii tiroidieni sunt importanți pentru dezvoltarea normală a țesuturilor nervoase ale fetusului și nou-născutului. La om insuficiența secreției de hormoni tiroidieni în perioada de dezvoltare duce la retardare mintală. Invers hipersecreția de hormoni tiroidieni asupra SN la om se traduce prin fenomene de hiperexcitabilitate, emotivitate, creșterea capacitații de raspuns, ideație și învățare, hiperreflexie cu scurtarea perioadei de latență, nervozitate, tremor, anxietate și insomnie [18].
Asupra sistemului cardiovascular, hormonii tiroiodurați cresc fregvența cardiacă și forța de contracție a cordului, probabil pe baza interacțiunii lor cu catecolaminele. Această interacțiune este determinată probabil de creșterea răspunsului celular prin inducerea de β-receptori catecolaminici. Presiunea sângelui este crescută pe baza creșterii presiunii sistolice, fără modificarea presiunii diastolice, efectul final fiind creșterea debitului cardiac. Efectul probabil asupra activității cardiovasculare ar fi menținerea contractilității normale a mușchiului cardiac. Toate aceste răspunsuri pot fi observate în situațiile de creștere a activității secretorii tiroidiene.
La mormoloci administrarea de hormoni tiroidieni grăbește fenomenul de metamorfoză în timp ce tiroidectomia duce la întârzierea acestuia. Stimularea metamorfozei este întâlnită numai la batracieni, la celelalte clase de animale hormonii tiroidieni stimulând diferențierea sub diferitele ei aspecte.
2. PARTEA A DOUA:
CERCETĂRI PROPRII
2.1. Organizarea experimentelor
Experiențele au fost organizate în biobaza Disciplinei de Fiziologie din cadrul Facultății de [NUME_REDACTAT] a U.S.A.M.V. București. Materialul biologic a fost reprezentat de găini rasa [NUME_REDACTAT] alb, în vârstă de 16 săptămâni, cu o greutate medie de 1.650 ± 55 g, provenind de la [NUME_REDACTAT] „Avicola” București, S.A. Au fost constituite două loturi: un lot martor și un lot experimental care a fost supus unui tratament cu tiroxină (tablete Eutyrox, Merk, de câte 10 mg), administrată per os, în doză de 0,5 mg/kg/zi timp de 10 zile, în vederea reproducerii experimentale a hipertiroidismului. Pe parcursul perioadei experimentale, animalele au fost hrănite cu furaj combinat din rețeta comercială 21-6, specifică acestei categorii de găini (tineret în pregătire pentru intrarea în ouat) au beneficiat de apă ad libitum , iar iluminatul încăperii a fost natural. Animalele au fost întreținute în cuști suspendate (sistem baterie). Atât la începutul perioadei experimentale cât și pe parcursul acesteia loturile au fost supravegheate clinic, au fost cântărite și li s-au prelevat probe de sânge prin puncție capilară și venoasă în vederea efectuării analizelor de laborator.
2.2. Materiale și metode
2.2.1. Determinarea numărului de eritrocite
Principiul: Se numără eritrocitele dintr-un volum cunoscut de sânge diluat într-o anumită proporție și se raportează rezultatul la un milimetru cub de sânge integral.
Necesar: Microscop, pipeta Potain pentru eritrocite, hemocitometru Tϋrk, sticlă de ceas, ac pentru puncție, alcool sanitar, vată, lichid de diluție Natt-Herrik modificat de Prochaska (NaCl 3,88g; Na2SO4 2,50g; Na2HPO4 2,91g; KH2PO4 0,35g; formol 40% 7,5ml, albastru de cresyl brillant 0,25g, apă distilată până la 1000ml).
Notă: [NUME_REDACTAT]-Herrik protejează toate elementele figurate sanguine (eritrocite, leucocite, trombocite) și colorează nucleul acestora, permițând numărarea pe același câmp atât a eritrocitelor cât și a leucocitelor, deosebirile fiind efectuate pe baza insușirilor lor morfologice.
Mod de lucru: Se pregătesc microscopul și hemocitometrul după tehnica obișnuită.
În sticla de ceasornic se pun 2-3 ml lichid de diluție. Se dezinfectează creasta sau bărbițele cu alcool și se lasă să se zvânte. Se puncționează cu acul pe o adâncime de 3-4 mm.
Se îndepărtează prima picătură de sânge și se recoltează din următoarea cu pipeta Potain sânge până la diviziunea 0,5. Se completează pipeta cu lichid de diluție până la diviziunea 101, se omogenizeză ușor și se lasă în repaus pe masă în poziție orizontală pentru câteva minute.
După câteva minute se omogenizează din nou conținutul pipetei, se înlătură primele 2 picături și apoi se umple camera de numărat, lăsând lichidul să pătrundă prin capilaritate între lamă și lamelă. Se așteaptă câteva minute pentru depunerea elementelor figurate pe suprafața rețelei [13].
Se numără eritrocitele ca la mamifere și se aplică aceeași formulă de calcul.
Este de reținut că identificarea eritrocitelor trebuie făcută pe baza aspectului lor morfologic (forma ovală a celulei și a nucleului), pentru a le diferenția de trombocite și de leucocite.
Valori normale (106/mmc): găină – 3,0; gâscă – 3,0; rață – 3,8.
2.2.2. Dozarea hemoglobinei
2.2.2.1. Determinarea conținutului în hemoglobină al sângelui prin metoda cu cianmethemoglobină
Principiul: Hemoglobina formează cu o soluție de cianură de potasiu și fericianură de potasiu un compus denumit cianmethemoglobină, a cărui intensitate de culoare se determină spectrofotometric.
Necesar: [NUME_REDACTAT] (fericianură de potasiu 0,02g; cianură de potasiu 0,05g; bicarbonat de sodiu 1g; apă distilată ad 1000ml), etalon de hemoglobină (soluție de cianmethemoglobină 0,06g%), pipetă capilară de 0,02ml, pipetă gradată de 5ml, spectrofotometru, proba de sânge (recoltat pe anticoagulant uscat Windrobe sau EDTA) sau sânge proaspăt recoltat din locul de elecție specificat la eritrogramă.
Mod de lucru: Se pipetează 0,02ml sânge într-o eprubetă conținând 5ml reactiv Drabkin. Se lasă în repaus 30 minute pentru hemoliză totală. Se citește la un spectrofotometru extincția față de soluția Drabkin (martorul alb) la 540nm.
Calcul: Hb (g/dl sânge) = Extincția x f x 250 (diluția sângelui).
Determinarea factorului f: Se fac 3 diluții succesive ale etalonului în reactivul Drabkin, astfel:
Soluție etalon [NUME_REDACTAT] Concentrația
C1 = soluție etalon 0,06g%
C2 = 4,15ml 0,85ml 0,05g%
C3 = 2,20ml 1,70ml 0,04g%
Cu fiecare concentrație C1, C2, C3 se citesc extincțiile Ex față de reactivul Drabkin.
Factorul f = C / [NUME_REDACTAT] efectuează media pentru C1, C2, C3 obținându-se f final.
În lipsa unui standard de cianmethemoglobină se poate calcula conținutul în hemoglobină pe baza coeficientului molar de extincție (Σ = 11,0103) și a greutății moleculare a hemoglobinei (16114):
gHb / dl = [(Extincție probă x 16114) / 11000] x 10-1 x 5,02 / 0,02 = Extincție probă x 36,8
Coeficientul de 36,8 trebuie însă verificat în fiecare laborator, utilizând probe de sânge al căror conținut în Hb a fost determinat cu precizie pe baza comparării cu un standard de cianmethemoglobină [23].
2.2.3. Întocmirea formulei leucocitare
Formula leucocitară reprezintă raportul procentual al categoriilor de leucocite determinat pe frotiu de sânge periferic (după examinarea a cel puțin 200 de elemente figurate albe).
Necesar: Materiale pentru recoltarea sângelui prin puncție capilară, lame de microscop degresate, coloranți [NUME_REDACTAT]-Giemsa, microscop.
Realizarea frotiului: Se recoltează o picătură de sânge pe marginea unei lame șlefuite care se aplică pe o altă lamă, orizontală, în așa fel încât picătura de sânge să se întindă prin capilaritate pe linia de contact dintre cele două lame care fac un unghi de aproximativ 30 grade. Se imprimă apoi lamei șlefuite o mișcare de translație ușoară, ceea ce permite sângelui să se întindă într-un strat subțire. Imediat după întindere, frotiul se zvântă prin agitarea lamei în aer. În lățime, frotiul trebuie să prezinte două margini paralele, ceea ce se obține folosind pentru întindere o lamă cu colțurile rupte. Suprafața frotiului trebuie să fie omogenă (fără goluri sau straturi groase de sânge). Frotiul trebuie colorat cât mai curând întrucât în lamele nefixate și necolorate celulele se alterează pierzându-și afinitatea tinctorială.
[NUME_REDACTAT] Grümwald Giemsa de colorare a frotiului de sânge:
Reactivi și materiale necesare: [NUME_REDACTAT] Grumwald: eozinat de albastru de metil 1g; glicerină neutră p.a. 50ml alcool metilic p.a. 100ml); soluție Giemsa (eozinat de aur de metilen 3g; azur de metilen 0,8g; glicerină neutră p.a. 250ml; alcool metilic 200ml), apă distilată neutră (pH 7-7,2; obișnuit, pH-ul se controlează prin adăugarea a câtorva cristale de hematoxilină, care se colorează galben în mediu acid, roz în mediu neutru și violet-albastru în mediu alcalin; apa distilată fiind de obicei acidă, pH-ul ei se neutralizează adăugând câteva picături dintr-o soluție slabă de carbonat de sodiu 1% la 500ml apă), pipete Pasteur, pipete gradate.
Fixarea: se acoperă frotiul cu un număr cunoscut de picături din soluția [NUME_REDACTAT] și se lasă 2-3 minute.
Colorarea: Se adaugă peste soluția [NUME_REDACTAT] un număr egal de picături de apă tamponată, se omogenizează și se lasă astfel 2-3 minute pentru colorare;
Tabelul 2
Rezultatele colorării frotiului de sânge
prin metoda May Grümwald-[NUME_REDACTAT] varsă soluția de pe lamă și, fără să se spele, se acoperă cu soluție Giemsa diluată în proporție de 1 picătură soluție Giemsa pentru 1ml apă tamponată. Se lasă în repaus 20 minute pentru colorare, apoi lama se spală la robinet sub jet puternic de apă. Se zvântă și se examinează. Dacă elementele figurate sunt slab colorate, frotiul se recoltează cu soluție Giemsa diluată în proporție de 2 picături la 1ml apă. Dacă apa folosită este acidă, eritrocitele se colorează în roșu aprins, iar dacă este alcalină, eritrocitele se colorează în albastru. În ambele cazuri, granulațiile sunt necorespunzător colorate. Colorarea trombocitelor se face prelungind timpul de colorare cu Giemsa la 45 minute.
Modul de lucru pentru determinarea formulei leucocitare
Se folosește microscopul cu obiectiv de imersie, diafragma deschisă și condensatorul ridicat. Se examinează în zig-zag marginile frotiului (în sensul lungimii), deplasând lama într-o singură direcție. Pe măsură ce apar în câmpul microscopic, leucocitele se identifică pe baza însușirilor morfologice și tinctoriale și apoi se înscriu într-un tabel, sub forma unor bare așezate în grupuri sau casete de câte 5, pe 10 coloane a câte 20 leucocite fiecare. Se examinează astfel 200 de elemente figurate albe, după care se efectuează totalul pentru fiecare categorie de leucocite în parte și, în final, exprimarea procentuală a fiecărei categorii față de total [17].
2.2.4. Determinarea hematocritului
Principiul determinării: Elementele figurate se separă de plasmă prin centrifugare standardizată. Înălțimea coloanei de hematii se raportează la cea a coloanei sângelui și apoi se înmulțește cu 100.
Necesar:
– material necesar pentru recoltarea sângelui prin puncție venoasă;
– anticoagulant care nu modifică pH-ul sângelui (heparină, EDTA, amestec Wintrope);
– tuburi de hematocrit (în lipsa lor, tuburi improvizate din pipete Westergreen închise la un capăt, lungi de 10 cm);
– centrifugă, hârtie de filtru, pipete Pasteur (sau seringă cu ac lung).
Mod de lucru (macrometoda Wintrope) :
– se recoltează sânge în flacoane sau eprubete pe pereții cărora s-a aplicat anticoagulant;
– se umple tubul de hematocrit cu sânge cu ajutorul pipetei Pasteur (sau al seringii cu ac lung), începând cu fundul tubului și evitând întreruperea coloanei de sânge cu bule de aer;
– se introduc tuburile în cupele de centrifugă, se echilibrează la balanță, apoi se centrifughează la 5000 rotații/min. timp de 20 min. până când, în principiu, volumul eritrocitelor din tub nu mai scade;
– se măsoară înălțimea (h) coloanei de elemente figurate (se neglijează stratul de trombocite și leucocite, fiind sub 1%) și înălțimea (H) a coloanei totale de sânge cu ajutorul unei rigle. Dacă tubul este gradat, citirea se face direct [33]:
2.2.5. Numărarea trombocitelor
Datorită aglutinării, fragmentării si dezintegrării rapide a trombocitelor, tehnicile utilizate, au prezentat dificultăți în aplicarea lor. Sunt posibile 2 tipuri de metode: indirecte și directe. În cazul experimentului nostru a fost folosită metoda directă. Numărătoarea trombocitelor prin metoda directă se face pe hemocitometru.
Se recoltează sânge cu pipeta de eritrocite, până la 1, și lichid de diluție până la 101 (diluția 1:100). Se agită pipeta 1 minut și se lasă apoi în repaus 30 minute pentru producerea hemolizei. Se agită din nou 2-3 minute, se aruncă apoi primele picături si după aceea se umple camera de numărat.
Din numeroasele formulele utilizate pentru lichidul de diluție, recomandăm formulă:
Na2EDTA 0,01 g
Oxalat de amoniu 1 g
Apa distilată 100 ml.
Oxalatul de amoniu este un agent eritrocitolizant exelent, iar Na2EDTA o substanta anticoagulantă care conservă și impiedică aglutinarea trombocitelor ; hemoliza este perfectă, lăsând în câmpul microscopic numai trombocite clare și neaglutinate; durata de păstrare este lungă, fără condiții speciale. Diluția se poate efectua și în pipete Potain pentru leucocite.
Pentru examenul microscopic se vor utiliza obiectiv 40 si ocular 10, prin diafragmare sau coborârea condensatorului realizându-se un câmp cenușiu închis pe fondul căruia trombocitele apar ca mici sfere strălucitoare. Având dimensiunile de 2-4 μ si aflându-se într-un spațiu de 100μ (înalțimea camerei) trombocitele se află la diferite niveluri, necesitând mișcarea vizei micrometrice în timpul numărării, pentru a putea observa toate trombocitele de pe retea.
Calculul se efectueaza ca și în cazul celorlalte elemente sangvine aplicând corecția de diluție și înălțime a camerei de numărat [23].
2.2.6. Calculul constantelor sanguine și al unor indici eritrocitari derivați
Cu ajutorul unor calcule matematice se pot determina mărimea, forma si încărcarea cu hemoglobină a eritrocitelor, rezultatele fiind exprimate sub formă de cifre absolute (constante) sau relative față de normal (indici).
Pentru calculul a trei dintre constantele eritrocitare recomandate pentru practica curentă (VEM, HEM, CHEM) este nevoie de următoarele date:
numărul de eritrocite/ mm3 de sânge, exprimat în milioane (E x106/mm3)
hemoglobina în grame/100ml sânge (Hb)
hematocritul în % (Ht)
A. Volumul eritrocitar mediu (VEM). VEM reprezintă volumul mediu al eritrocitelor și se calculează după formula :
Rezultatele se exprimă în microni cubi (m3).
B. Hemoglobina eritrocitară medie (HEM). HEM reprezintă conținutul mediu de hemoglobină al eritrocitelor, stabilit prin formula:
Rezultatele se exprima micromicrograme(μμg) sau picograme (pg) pe eritrocit (1g=1000mg=106μg=1012μμg)
C. Concentratia în hemoglobină ertrocitară medie (CHEM). CHEM reprezintă concentrația medie de hemoglobină pe unitate de volum (100 ml) de masa eritrocitară, se calculează prin formula:
Rezultatele se exprimă în grame/100 ml masă eritrocitară (g/100ml) [25].
2.2.7. Determinarea activității transaminazelor serice ALT și AST
Transaminazele (aminotransferaze) catalizează transferul grupării NH2 de la un acid alfa-aminat la un acid alfa-cetonic.
Principiul: TGP transferă gruparea NH2 de la alanină la alfa-cetoglutarat, rezultând glutamat și piruvat. Piruvatul reacționează cu 2,4 dinitrofenilhidrazina dând dinitrofenilhidrazona colorată care se măsoară fotometric. Din producția de piruvat pe minut se deduce activitatea transaminazică din serul de lucru [35].
Reactivi:
Reactiv nr. 1 – substrat pentru TGP: DL-alanină 200 mM, acid alfacetoglutaric 2 mM în tampon pH = 7,3, 3 fiole sau 6 fiole x 200 ml;
Reactiv nr. 2 – reactiv de culoare: 2,4 dinitrofenilhidrazină 1-2 fiole x 20 mg.
Conținutul unei fiole se dizolvă cantitativ în 100 ml HCl d = 1,19, după dizolvare (aproape completă) se adaugă 80 ml de apă bidistilată, se încălzește ușor pe baia de apă (dacă dizolvarea nu s-a făcut) și apoi se aduce la 100 ml cu apă bidistilată. Soluția obținută se conservă la temperatura camerei și la întuneric.
Reactiv nr. 3 – standard piruvat de Na 1 sau 2 fiole x 2 ml.
Observație:
Pentru utilizarea acestui kit este necesar să se prepare în laborator NaOH 0,4 N [35].
2.2.7.1. Determinarea activității alanin-aminotransferazei (ALT, GPT)
Se realizează astfel: se pipetează într-o serie de eprubete probele (P) un standard (S), un blanc de reactivi (BR) și un blanc al fiecărei probe (BP), conform schemei din Tabelul 3.
După 5 minute de la adăugarea hidroxidului de sodiu, conform schemei din Tabelul 3, se măsoară extincția probelor (EP), a standardului (ES), a blancului probelor (EBP), a blancului de reactivi (EBR), față de apă la 520 nm în cuvă la 1 cm.
Calcul: Se calculează producția de piruvat, X (în µmoli/min.):
X = EP-EBP/ES-EBR x 2 x103 x 1/30 adică
X = EP-EBP/ES-EBR x 66,7
2.2.7.2. Determinarea activității aspartat-aminotransferazei
(GOT)
Principiul: GOT transferă gruparea NH2 de la aspartat la alfa-cetoglutarat rezultând glutamat și oxalacetat.
Oxalacetatul trece spontan în piruvat care reacționează cu 2,4 dinitrofenilhidrazină dând dinitrofenilhidrazonă colorată care se măsoară fotometric. Din producția de piruvat pe minut se deduce activitatea transaminazică din serul de lucru.
Reactivi
-Reactiv nr. 1-substrat pentru GOT acid DL aspartic 100 mM, acid cetoglutaric 2 mM în tampon pH = 7,5, 3 fiole sau 6 fiole x 20 ml;
-Reactiv nr. 2 – reactiv de culoare: 2,4 dinitrofenilhidrazina 1 sau 2 fiole x 20 mg; conținutul unei fiole se dizolvă cantitativ în 10 ml HCl d = 1,19, după dizolvare se adaugă 20 ml apă bidistilată, se încălzește ușor pe baia de apă și apoi se aduce la 100 ml cu apă bidistilată. Soluția obținută se conservă la temperatura camerei și la întuneric.
-Reactiv nr. 3 –standard piruvat de sodiu 1 sau 2 fiole x 2 ml.
Mod de lucru: Se pipetează într-o serie de eprubete probele (P), un standard (S), un blanc reactiv (BR) și un blanc al fiecărei probe (BP). Se realizează o schemă de lucru conform Tabelului 3.
După 5 minute de la adăugarea hidroxidului de sodiu se măsoară extincția probelor (EP), a standardului (ES), a blancului probelor (EBP), a blancului de reactivi (EBR), față de apă la 520 nm în cuvă la 1 cm.
Calcul: Se calculează producția de piruvat: x (în µmoli/min.).
X = EP-EBP/ES-EBR x 2 x103 x 1/60 adică
X = EP-EBP/ES-EBR x 33,3
Tabelul 3
Schema de lucru pentru prelucrarea probei (P), a standardului (S), a blancului reactivilor (BR) și a blancului probei (BP) în vederea determinării activității aspartat-aminotransferazei serice (după Șerban și col., 1993)
2.2.8. Determinarea activității gamma-glutamiltransferazei (GGT)
Principiu: – Glutamiltransferaza (- GT) catalizează transferul acidului glutamic de pe un donor ( – glutamil-p-nitroanilidă), pe un acceptor (glicilglicină). În urma reacției se formează p-nitroanilidă, colorată în galben (mM = 9,9).
Reactivi: – substrat sub formă de comprimate, fiecare comprimat servind la 5 determinări în sistemul cinetic sau 13 determinări în sistemul static;
– tampon Tris-HCl;
– acid acetic.
Se toarnă conținutul sticluței într-un cilindru gradat de 500 ml și se completează cu apă la 400 ml. Concentrația acidului acetic este 1 N.
Pregătirea soluției de substrat:
La 1,5 ml soluție Tris-HCl se adaugă 6,5 ml apă. Amestecul se încălzește la 45-50°C pe baia de apă după care se introduce un comprimat a cărui dizolvare are loc în mai puțin de 1 minut. Soluția poate fi păstrată la 25°C timp de 24 de ore sau la 4°C timp de 4 zile.Serul de analizat nehemolizat, poate fi utilizat într-un interval de o săptămână de la data recoltării cu condiția să fie păstrat la 4°C.
Tehnica de lucru:
Testul cinetic: în cuva de 1cm a spectrofotometrului se pipetează 1,5 ml substrat în Tris-HCl și 0,1 ml ser. Atât substratul, cât și serul trebuie preîncălzite la 25 °C. La exact 1 minut după amestecare se citește extincția la 405 nm. față de apă (se poate reduce diferența de citire când aceasta este mai mare de 0,6 adăugând în cuva martor 1-2 picături soluție acid picric 1%). Se repetă citirile la intervale de 1 minut timp de alte trei minute. Se calculează valoarea medie E/min.
Testul static: pentru fiecare determinare se pregătesc 2 tuburi de hemoliză (probă și martor) în care se pipetează următorii reactivi și se procedează conform schemei de mai jos:
Se citește extincția probei față de martor la 405 nm în maximum o oră de la adăugarea ultimului reactiv.
Calculul activității – GT: 1 Ul GT este cantitatea de enzimă care catalizează transferul a 1µmol de acid glutamic de pe donor pe acceptor la temperatura de 25°C în timp de un minut. Activitatea enzimei serice se exprimă în U/L.
Test cinetic: GT(U/L) = 1616 x E405/minut
Test static: GT(U/L) = 460 x E405/20 minute.
2.2.9. Determinarea activității fosfatazei alcaline
Principiu: Fosfataza alcalină este o fosfomonoesterază care catalizează reacții de forma R-O-PO3 + H2O R-OH + H3PO4 .
Enzima este puțin specifică, acționând asupra diferiților esteri ai acidului fosforic. Dintre aceștia p-nitrofenilfosfatul, compus incolor, eliberează prin hidroliză p-nitrofenolul care în mediu alcalin este colorat în galben (coeficientul milimolar de extincție la 405 nm este 18,5).
Reactivi: p-nitrofenilfosfat, fiecare comprimat conține substrat și tampon pentru 12 determinări.
Pregătirea reactivilor:
– Soluție substrat: se dizolvă un comprimat de p-nitrofenilfosfat în 5 ml apă bidistilată. Soluția stabilită la 4°C timp de o săptămână, are concentrația de 5,5 mM p-nitrofenilfosfat la pH 10,5.
– NaOH 0,02 N: se cântăresc 0,8 g NaOH p.a. și se dizolvă în 1000 ml apă bidistilată.
Tehnica de lucru: pentru fiecare determinare se pregătesc 2 tuburi de hemoliză (martor și probă) în care se pipetează următorii reactivi și se procedează conform schemei de mai jos:
Se citește extincția probei față de martor la 405 nm, în cuvă de 1 cm.
Calculul activității: o unitate de fosfatază alcalină este cantitatea de enzimă care catalizează hidroliza unui micromol de substrat în timp de 1 minut la 37°C în condițiile prevăzute. Activitatea enzimei serice se exprimă în U/L.
Fosfataza alcalină (U/L) = 245 x E 405 nm
2.2.10. Dozarea calciului seric
Dozarea calciului seric se realizează prin metoda titrimetrică
Principiul metodei: Ionii de calciu, în mediu alcalin se titrezã cu etilendiaminotetra-acetat disodic (EDTA) în prezența murexidului ca indicator. Indicatorul fixeazã ionii de calciu (soluție violacee), care sunt complexați cantitativ de EDTA, eliberând indicatorul care coloreazã soluția în violet [171, 172].
Reactivi:
– soluție EDTA 0,01 N: se dizolvã 1,86 g EDTA în 1000 ml apã bidistilatã;
– murexid solid;
– hidroxid de sodiu 9 N;
– soluție standard de calciu: 0,2 g carbonat de calciu se aduc cantitativ la balon cotat de 100 ml cu acid clorhidric 1 N pânã la completa dizolvare a substanței (cca 10 ml acid clorhidric 1 N), apoi se aduce la semn cu apã bidistilatã. Titrul soluției astfel preparate este de 0,8 mg Ca ionic/1 ml.
Materialul supus examinãrii
– Prelevarea probelor de sânge se face prin puncționarea marilor vene, după o prealabilă pregătire a locului de elecție (tundere, dezinfecție cu vată și alcool sau tinctură de iod).
– Prelevarea sângelui este bine sã se facã înainte ca animalul sã-și consume rația alimentarã.
– Timpul scurs de la executarea stazei pânã la prelevare nu trebuie sã fie mai mare de 2 minute, întrucât se produce hemoconcentrația progresivã.
– Când sângele se recolteazã în seringã, înainte de a se goli seringa în tubul de recoltare, se scoate acul pentru a evita hemoliza sângelui forțat sã treacã prin ac, conținutul seringii fiind golit ușor pe peretele tubului. Tot pentru a evita hemoliza, sângele va fi prelevat în eprubete perfect uscate și curate.
– Tuburile vor fi bine închise, altfel evaporarea determinã hemoconcentrația, constituind sursã de erori.
– Sângele va fi individualizat pe eticheta tubului și tabelul anexat, în care trebuie sã se consemneze proveniența, specia, categoria de vârstã sau starea fiziologicã.
– Probele sunt lãsate sã coaguleze la temperatura camerei, se decoleazã, se centrifugheazã și se preleveazã serul recoltat.
– Pentru conservarea integritãții probelor, serul se va pãstra la frigider pânã în momentul examinãrii acestora.
– Pe timpul transportului, conservarea probelor se face în aceleași condiții, la 4 C.
Modul de lucru
Determinarea factorului soluției de EDTA corespondent în ioni de calciu
Într-un balon Erlenmayer de 50 ml se pipeteazã 25,5 ml apã bidistilatã, 0,5 ml soluție standard de calciu, 0,2 ml NaOH 9 N, apoi se adaugã câteva cristale de murexid solid.
Amestecul astfel obținut se titreazã cu EDTA pânã la virajul caracteristic.
Calculul factorului
Presupunând cã la titrare s-au folosit 2 ml EDTA rezultã:
2 ml EDTA…………………………0,4 mg Ca ionic
1 ml EDTA…………………………..X
–––––––––––––––––––––––––
X = 0,2 mg Ca ionic/1 ml EDTA
Pentru exprimare procentualã, factorul de EDTA este 0,2 x 100 = 20
Dozarea calciului seric
Se lucreazã identic cu standardul dar pipetând 25 ml apã bidistilatã și 1 ml ser.
Calcul rezultatelor și modul de exprimare
Ca (mg/dl) = V x F
în care:
V = volumul soluției EDTA folosit la titrare exprimat în ml
F = factorul de transformare EDTA – calciu
Valori normale pe specii (mg/dl)
– bovine: 9-11,1
– ovine: 9,0-11,5
– porcine: 8,0-11,0
– pãsãri: gãini ouãtoare 25-35; tineret 16 sãpt. 11,6-12,4; pui carne 10,0-15,0; curci 10,6-13,4 [33].
2.2.11. Dozarea fosforului seric
Dozarea fosforului seric prin tehnica reducerii complexului fosfomolibdenic de cãtre acidul ascorbic.
Principiul metodei: anionul fosforic, în prezența acidului molibdenic, trece într-un complex fosfomolibdenic care este redus la albastru de molibden de către acidul ascorbic.
Materiale necesare:
Reactivi
– soluția pirosulfit – borax:
– pirosulfit de sodiu .. 0,9 g
– borax ………………… 1,0 g
Se cântãresc la balanța tehnicã și se dizolvă cu apã bidistilatã în cilindru de 50 ml. Soluția se preparã extempore.
– soluția de acid molibdenic
– molibdat de amoniu 5 g
– acid sulfuric 1,2 N (3,48 ml H2SO4 concentat ad.100 ml apã bidistilatã)
Molibdatul de amoniu se cântãrește la balanța tehnicã și se aduce la balon cotat de 100 ml cu acid sulfuric 1,2 N.
– soluția de acid ascorbic 10% în apã bidistilatã; se preparã ex tempore.
– soluție carbonat – sulfit:
– sulfit de sodiu cristale 0,7 g
– carbonat de sodiu anhidru 4,2 g
Se aduce la cilindru gradat de 100 ml cu apã bidistilatã.
– soluție standard fosfor 5 mg %: fosfat diacid de potasiu 0,022 g
Se cântãrește la balanța analiticã și se aduce cantitativ la balon cotat de 100 ml cu apã bidistilatã și 5 ml acid sulfuric 1 N
Materialul supus examinãrii
– Prelevarea probelor de sânge se face prin puncționarea marilor vene, dupã o prealabilã pregãtire a locului de elecție (tundere, dezinfecție cu vatã cu alcool sau tincturã de iod).
– Prelevarea sângelui este bine sã se facã înainte ca animalul sã-și consume rația alimentarã.
– Timpul scurs de la executarea stazei pânã la prelevare nu trebuie sã fie mai mare de 2 minute, întrucât se produce hemoconcentrația progresivã.
– Când sângele se recolteazã în seringã, înainte de a se goli seringa în tubul de recoltare, se scoate acul pentru a evita hemoliza sângelui forțat sã treacã prin ac, conținutul seringii fiind golit ușor pe peretele tubului. Tot pentru a evita hemoliza, sângele va fi prelevat în eprubete perfect uscate și curate.
– Tuburile vor fi bine închise, altfel evaporarea determinã hemoconcentrația, constituind sursã de erori.
– Sângele va fi individualizat pe eticheta tubului și tabelul anexat, în care trebuie sã se consemneze proveniența, specia, categoria de vârstã sau starea fiziologicã.
– Se lasã probele sã coaguleze la temperatura camerei, se decoleazã se centrifugheazã și se preleveazã serul rezultat.
– Pentru conservarea integritãții probelor, serul se va pãstra la frigider pânã în momentul examinãrii acestuia.
– Pe timpul transportului, conservarea probelor se face în aceleași condiții, la 4C.
Modul de lucru
Conform schemei din Tabelul 4.
După realizarea schemei de lucru din Tabelul 4 probele se lasă în repaus 15 min. Citirea extincției se face la Spekol la 660 nm, în cuva de 1 cm (drumul optic).
Calculul rezultatelor și modul de exprimare
C (mg fosfor la 100 ml ser) =E x F
C =concentrația probei; E =extinctia probei
F =Cs/Es
F =factor de pantã; Es =extincția standardului; Cs=concentrația standardului; Valori normale pe specii (mg/dl):
– bovine 5,5-9,4; ovine 5,0-7,7; porcine 6,0-11,0; pãsãri 5,1-8,0
Tabel 4
Schema modului de lucru pentru determinarea concentrației plasmatice a fosforului
2.2.12. Dozarea magneziului seric
Dozarea magneziului seric se realizează prin metoda cu galben de titan. Tehnica se aplică în domeniul biochimiei veterinare.
Principiul metodei
În soluieție puternic alcalină, ionii de magneziu din ser reacțționează cu colorantul galben de titan cu care formează un complex de culoare roșie, care este stabilizat cu alcool polivinilic și fotometrat la 540 nm.
Materiale necesare
Reactivi:
– soluție stoc galben de titan: se dizolvă 0,5 g galben de titan în 100 ml apă bidistilată; reactivul se păstrează în flacoane de polietilenă;
– reactiv galben de titan, solutie de lucru: 2 ml soluție stoc se aduc la balon cotat de 100 ml cu apă bidistilată;
– hidroxid de sodiu soluție 7,5 % în apă bidistilată;
– alcool polivinilic soluție 0,1 %: se dizolvă 1 g alcool polivinilic în 400 ml apă bidistilată, încălzită ușor; se răcește și se aduce la 1000ml cu apă bidistilată; soluția se păstrează în flacoane de polietilenă;
– standard de magneziu – soluția stoc: se dizolvă 0,507 g sulfat de magneziu hidratat cu 7 molecule de apă, în apă bidistilată și se aduce la balon cotat de 100 ml;
– standard de magneziu – soluție de lucru: 0,1 ml soluție stoc se aduc la 10 ml cu apă bidistilată (2,5 mg Mg/100 ml); se prepară ex tempore.
Materialul supus examinării
– Prelevarea probelor de sânge se face prin puncționarea marilor vene, după o prealabilă pregătire a locului de elecție (tundere, dezinfecție cu vată cu alcool sau tinctură de iod).
– Prelevarea sângelui este bine să se facă înainte ca animalul să-și consume rația alimentară.
– Timpul scurs de la executarea stazei până la prelevare nu trebuie să fie mai mare de 2 minute întrucât se produce hemoconcentrația progresivă.
– Când sângele se recoltează în seringă, înainte de golirea acesteia în tubul de recoltare, se scoate acul pentru a evita hemoliza sângelui forțat să treacă prin ac, conținutul seringii fiind ușor golit pe peretele tubului. Tot pentru a evita hemoliza, sângele va fi prelevat în eprubete perfect uscate șI curate.
– Tuburile vor fi bine închise, altfel evaporarea determină hemoconcentrația, constituind sursă de erori.
– Sângele va fi individualizat pe eticheta tubului șI tabelul anexat, în care trebuie să se consemneze proveniența, specia, categoria de vârstă sau stare fiziologică.
– Se lasă probele să coaguleze la temperatura camerei, se decolează, se centrifughează și se prelevează serul rezultat.
– Pentru conservarea integrității probelor, serul se va păstra la frigider până în momentul examinării acestora.
– Pe timpul transportului, conservarea probelor se face în aceleași condiții, la 4°C [35].
Modul de lucru
Se lucrează în paralel probele, un standard și un martor, conform schemei din Tabelul 5.
Tabel 5
Schema de lucru pentru dozarea magneziului seric
Calculul rezultatelor și modul de exprimare:
C (mg/dl) = E x F
în care: C = Concentrația probei; E = Extincția probei; F = Factorul de pantă
F = Cs/Es unde: Cs = Concentraia ția standard iar Es = Extincția standard
Valori normale, de referință la animele adulte, pe specii (mg/dl): bovine 2,3±0,5; porcine 2,5±0,5; ovine 3,0±1; păsări 3,2±0,5.
2.2.13. Dozarea tiroxinei
A fost determinată concetrația totală a tiroxinei (T4) din sânge utilizând IMMULITE Analyzer, dispozitiv automat pentru determinarea T4.
Principiul: chemiluminiscența amplificată enzimatic pe bază de dioxietan adamantilfosfat.
Durata de incubație: 30 minute.
Probe biologice: plasmă obținută din sânge heparinizat, ultracentrifugat pentru clarificarea lipidică, nehemolizat.
Volmul de ser necesar: 15 microlitri (proba trebuie să conțină cel puțin 100 microlitri).
Depozitarea reactivilor: 2 – 8ºC.
Precauții: substratul pentru chemiluminiscență – a se evita contactul direct și acțiunea razelor solare.
Apă: se utilizează apă distilată și deionizată.
Modul de lucru: conform instrucțiunilor din manualul de utilizare IMMULITE .
Factor de conversie: micrograme/dl x 12,87 = nmoli/L.
Sensibilitate analitică: 0,4micrograme/dL (5 nmoli/L).
2.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII
În urma administrării tiroxinei, la lotul experimental a fost realizat un nivel sanguin al T4 de 6,3 g/dl, față de martor, la care nivelul T4 în sânge a avut valori sub 1 g/dl. Acest fapt a condus atât la modificări ale evoluției greutății corporale, cât și la modificări ale unor parametri hematologici, după cum urmează.
[NUME_REDACTAT] 6 este prezentată evoluția greutății corporale a lotului de găini tratat cu tiroxină comparativ cu lotul martor. Din datele prezentate în Tabelul 6 se constată că lotul de găini tratat cu tiroxină a prezentat o greutate corporală cu 50 grame mai mare decât la începutul tratamentului, în timp ce lotul martor a prezentat o greutate corporală mai mare decât la începutul perioadei experimentale cu doar 13 grame. Prelucrate statistic, diferențele de greutate dintre loturi sunt semnificative, ceea ce ne îndreptățește să afirmăm că tiroxina a determinat o stimulare a creșterii în greutate a lotului respectiv.
Efectul tiroxinei asupra masei musculare și, deci, asupra sporului ponderal este explicat de efectele metabolice ale acestui hormon: în general, hormonii tiroidieni sunt implicați în reglarea metabolismului proteinelor, glucidelor și lipidelor. Aceste efecte se reflectă la nivel de fibră musculară scheletică, unde acești hormoni cresc nivelul ARN, ceea ce se traduce printr-o îmbunătățire a sintezei de proteine (Brown s.a., 1981). Având în vedere efectele de stimulare a sintezei de enzime litice, intensificatoare a arderilor metabolice, și, deci, al consumului de proteină, creșterea sau scăderea în greutate a unui lot tratat experimental nu poate fi decât rezultatul predominenței unuia sau al altuia dintre cele două categorii de procese stimulate de către hormonii tiroidieni: de sinteză sau de liză. Urmare a rezultatelor obținute de noi în experimentul de față, se constată că la păsări sunt predominante efectele de stimulare a sintezelor, de stimulare a proceselor anabolice, asupra celor de liză, catabolice. În doze mari, însă, hormonii tiroidieni (în special T3) stimulează cu preponderență procesele catabolice, ceea ce explică miopatia asociată tirotoxicozei.
Numeroase date obținute in vivo demonstrează importanța hormonilor tiroidieni în dezvoltarea postnatală a țesutului muscular. Scow (1951) a stabilit pentru prima dată că acești hormoni participă la reglarea creșterii musculaturii scheletice. Într-adevăr, la șobolan, tiroidectomia neonatală reduce raportul masă musculară/masă corporală, comparativ cu animale martor, hrănite ad libitum. Acțiunea trofică a acestori hormoni în cantități fiziologice se realizează printr-o creștere a diametrului și a numărului fibrelor musculare, fapt dovedit la șobolan și găină. Invers, tiroidectomia neonatală este însoțită de o reducere a sintezei și a acumulării de proteină musculară, în special miozină (Scow, 1953). Influența stimulatoare a hormonilor tiroidieni asupra numărului fibrelor musculare pare a se exercita încă din perioada dezvoltării embrionare, prin creșterea numărului de celule precursoare ale țesutului muscular (Marchal et al, 1996).
Influența pozitivă a hormonilor tiroidieni asupra numărului de fibre, pare să fie rezultatul unei influențe precoce în cursul dezvoltării embrionare a fătului. Marchal și colaboratorii (1996), au sugerat că influența pozitivă a acestor hormoni s-ar explica printr-o creștere a numărului de celule precursoare ale țesutului muscular la un stadiu precoce al dezvoltării, ca și al capacității lor de a fuziuona la un stadiu mai întârziat.
Privind contractibilitatea fibrelor musculare, studiile au arătat că hormonii tiroidieni influențează compoziția fibrelor mușchilor schletici. La șobolan, o hipertiroidie de lungă durată crește proporția fibrelor rapide II în detrimentul fibrelor lente I (Fish și col.1980, Caiozza și col. 1993). Este observată și o creștere a numărului de fibre hibride (Fish și col.), sugerându-se că intervine fenomenul de conversiune al fibrelor. Invers, tiroidectomia la șobolan induce o diminuare a proporției fibrelor II în favoarea fibrelor I (Nwoge și col.1982) care poate fi compensată prin administrarea de T3 (Montgomery 1992). O hipotiroidie moderată induce aceleași efecte în 10 zile la purcei (Harrison și col.1996).
Hormonii tiroidieni reglează expresia fenotipică a izoformelor lanțului greu al miozinelor (Izumo și col.1986); în particular, ei stimulează trecerea de la forma neonatală la forma adultă (Whalden și col.1981). În plus, un tratament cu T3 modifică conținutul în MHC în mușchiul soleus al șobolanului, diminuând acumularea de MHC I (Larsson și col.1995), mărind pe cea de MHC IIa și MHC IIx. Tot el aticipează expresia lui MHC IIb în perioada perinatală la șobolan (Russel și col.).
In inimă, hormonii tiroidieni cresc reprezentarea procentuală a lanțului greu al miozinei a cardiace și diminuează pe cea a lanțului greu al miozinei b cardiace. Totuși, cu toate că T3 reglează de manieră țesut-specific abundența ARN mesager a numeroaselor izoforme de lanțuri grele de miozină în diferitele tipuri de mușchi (Izumo și col.1986), nici un efect direct n-a fost pus în evidență în muschiul scheletic.
În general, hormonii tiroidieni sunt implicați în reglarea metabolismelor proteic, glucidic și lipidic. Aceleași efecte sunt observate la nivelul mușchilor scheletici. Astfel, acești hormoni măresc procentul de ARN în mușchii scheletici și în inimă, ceea ce se traduce printr-o creștere a sintezei de proteine (Brown și col.1981). Totuși, T3, în doză puternică stimulează în mod egal catabolismul proteinelor, ceea ce explică miopatiile asociate cu tirotoxicoze. În plus T3 crește glicoliza stimulată de insulină, oxidarea glucozei și fosforilarea hexozelor în mușchiul soleus al șobolanului (Dimitridis și col.1988). Acest hormon crește în mod egal captarea glucozei bazale sau stimulată de insulină. Aceasta este consecința unei creșteri a numărului de transportori de glucoză GLUT-4 și al translocării transportorilor spre membrana plasmatică (Weinstein și col.1994). Pe de altă parte, acest hormon stimulează captarea trigliceridelor și inhibă activitatea lipoproteinei lipazei în mușchiul soleus al șobolanului, invers decât este observat în inimă (Kaciuba-Uscilka și col. 1980). T3 joacă și un rol major și în reglarea multiplicării mitocondriilor, al metabolismului mitocondrial, în particular a fosforilărilor oxidative. Ea exercită deci, după toate aparențele, o influență asupra diferențierii metabolice, care este asociată unei mari diferențe în numărul de mitocondrii după tipul fibrelor (Scherzwmanu și col.1989).
Efectele biologice ale hormonilor sunt schimbate prin intermediul receptorilor activ biologic T3. Acești receptori, localizați în nucleu, sunt codați de două gene omoloage c-erbAa și c-erbAb. Prima genă codează pentru receptorul de tip a1 și la mamifere pentru două proteine a2 și a3 nefixând T3. Al doilea codează pentru alți doi receptori b1 și b2. Receptorii a și b sunt prezenți precoce în cursul dezvoltării la păsări și rozătoare. La șobolan, receptorul de a1 constituie izoforma majoritară exprimată în mușchii rapizi. Din contră, izoforma b1 ar fi prezentă în mușchii lenți (Hoffman și col.1994). Nu există date privind expresia izoformilor receptorilor conform tipului de mușchi după naștere. Totuși, diverse lucrări au pus în evidență o sensibilitate a hormonilor tiroidieni variabilă după tipul de mușchi. La șobolan, captarea acestor hormoni este mai importantă în mușchii oxidativi decât în mușchii glicolitici ([NUME_REDACTAT] și Kassenaar, 1978). La păsări, numărul de receptori ar fi mai ridicat în mușchii rapizi decât în cei lenți (Dainat și col.1986).
Un receptor al T3 de tip a, a fost pus recent în evidență la mitocondrii și ar putea să constitue un factor de transcriere al genomului mitocondrial (Wrutniak și col.1995). Acesta aduce un element pentru a înțelege rolul acestor hormoni în reglarea metabolismului mitocondriilor și în consecință în reglarea propietăților metabolice a fibrelor.
[NUME_REDACTAT] 7 sunt prezentate efectele tratamentului experimental cu tiroxină asupra principalilor parametri biochimci sanguini: numărul de eritrocite, hemoglobina, hematocritul, numărul de plachete sanguine, precum și parametrii eritrocitari derivați: VEM, HEM și CHEM. Din analiza datelor prezentate în Tabelul 7 se constată că tratamentul experimental cu tiroxină nu a indus modificări semnificative asupra parametrilor hematologici determinați. Astfel, numărul de eritrocite a fost de 2,47 x 106/mmc la martor și ușor scăzut la lotul tratat cu tiroxină: 2,30 x 106/mmc. De asemenea, hemoglobina a fost în cantitate de 11,93 g/dl la martor și 10,6 g/dl la lotul experimental. .
Tabelul 6
Evoluția greutății corporale (în grame) la găini tratate experimental cu tiroxină în doză de 5 mg/kg greutate vie timp de 10 zile, comparativ cu un lot martor
Această situație a fost reflectată în valorile hematocritului, care s-a cifrat la 140,3% la martor și 137,6% la lotul cu hipertiroidism experimental, precum și în valorile parametrilor eritrocitari derivați: VEM, HEM și CHEM. Valorile VEM au fost doar cu circa 3 microni cubi mai scăzute decât la martor, valorile HEM au fost cu 2,4 gamma mai scăzute decât ale martorului iar valorile CHEM s-au cifrat la 34,7% la martor și 33,6% la lotul cu hipertiroidism experimental. Menținerea în limite normale a valorilor principalilor parametri hematologici, de bază și derivați, denotă o slabă influență a tiroxinei în exces asupra procesului ce hematopoeză, deși datele din literatură relevă instalarea anemiei (și, în consecință, scăderea hemoglobinei și a hematocritului) în condiții inverse, ale hipotiroidismului [15].
Tabelul 7
Efectele tratamentului experimental cu tiroxină asupra unor constante hematologice la găini tratate experimental cu tiroxină (5 micrograme / kg greutate vie), timp de 10 zile, comparativ cu un lot martor
Legendă:
Xsx = Media ± eroarea standard a mediei
Hg = hemoglobină
VEM = volumul eritrocitar mediu
HEM = hemoglobina eritrocitară medie
CHEM=concentrația în hemoglobină eritrocitară medie. .
Slaba influență negativă, de scădere a valorilor numărului de eritrocite, hemoglobină și hematocrit, ar putea fi determinată de reducerea metabolismului proteic în măduva hematogenă.
[NUME_REDACTAT] 8 este prezentată formula leucocitară la cele două loturi: lotul martor și lotul tratat cu tiroxină. Din analiza datelor prezentate în Tabelul 8 se constată o creștere a procentului de limfocite și de eozinofile, ceea ce este caracteristic hipertiroidismului, diferențele fiind distinct semnificative față de martor (P<0,01).
Astfel, procentul de limfocite a fost cu 6,4% mai mare la lotul tratat cu tiroxină în timp ce procentul de eozinofile a fost mai mare cu 3,6% la același lot experimental comparativ cu lotul martor. Se constată, de asemenea, că procentul de limfocite și cel de eozinofile au crescut pe seama scăderii numărului de neutrofile, a căror valoare s-a cifrat la 52,0% la lotul tratat cu tiorxină, față de 63,3% la martorul netratat. Creșterea procentului de eozinofile nu este în acord cu datele publicate de literatura de specialitate: Guyton și col. au constatat eozinofilie și granulocitopenie în tratamentele umane prelungite cu tiouracil (substanță goitrogenă) [18].
[NUME_REDACTAT] 9 sunt prezentate rezultatele determinărilor biochimice (enzime serice) la lotul de găini tratat cu tiroxină, comparativ cu martorul netratat. A fost determinată activitatea următoarelor enzime serice: glutamat oxaloacetat-transaminaza (GOT), glutamat-piruvat-transaminaza (GPT), gamma-glutamiltransferaza (GGT) și fosfataza alcalină (FA). Activitatea acestor enzime constituie un etalon al intensității metabolismului proteic din organism, în special din ficat. Din analiza datelor prezentate în Tabelul 9 se constată că activitatea enzimelor respective a fost modificată după cum urmează:
Tabelul 8
Efectele tratamentului experimental cu tiroxină asupra raportului procentual al elementelor figurate, la găini tratate experimental cu tiroxină (5 micrograme/kg greutate vie), timp de 10 zile, comparativ cu un lot martor
Legendă:
X±sx = Media ± eroarea standard a mediei
– activitatea transaminazelor serice a fost ușor intensificată, fiind cu 0,6 UI mai mare la lotul tratat cu tiroxină, față de lotul martor, pentru GPT și cu 2,4 UI mai mare la același lot experimental față de martor, pentru GOT. Aceste diferențe între activitatea lotului martor și cea a lotului tratat cu tiroxină s-au dovedit semnificative în urma prelucrărilor statistice (P<0,05). Transaminazele serice provin în principal din sinteză hepatică. Nivelul lor în sânge, în condiții normale poate fi zero. În condiții patologice, reprezentate de afectarea celulei hepatice, transaminazele serice difuzează în sânge, creșterea nivelului lor fiind un indicator al gradului de afectare a hepatocitului. Și în condiții fiziologice poate crește în oarecare măsură nivelul acestor enzime în ser, relevând o intensificare a activității proteosintetice a ficatului. Creșterea activității transaminazelor serice este explicată de intensificarea metabolismului proteic, materializată într-un turn-over mai ridicat al acestei categorii de substanțe, proteinele.
– activitatea gamma-glutamiltransferazei (GGT), enzimă implicată în metabolsimul glutationaului și în transportul transmembranar al aminoacizilor, a fost mai ridicată cu 2,5 U/L la lotul tratat cu tiroxină (unde a fost găsită o valoare de 46 U/L), comparativ cu lotul martor (la care a fost determinată o activitate de 43,5 U/L). Creșterea activității GGT în hipertiroidism și scăderea activității acestei enzime în hipotiroidism reprezintă teste biochimice de bază pentru diagnosticarea disfuncțiilor tiroidiene, alături de alte teste cum ar fi dozarea nivelului plasmatic al T3 și T4.
– fosfataza alcalină este enzima a cărei activitate a fost modificată în cel mai înalt grad, activitatea acestei enzime crescând la 515,8 U/L la lotul tratat cu tiroxină, față de 353,5 U/L la lotul martor. Prelucarea statistică a datelor a relevat diferențe distinct semnificative între loturile respective (P<0,01). Creșterea activității fosfatazei alcaline la lotul tratat cu tiroxină este explicată de intensificarea activității metabolice a organismului în general și a enzimelor metabolice în special. Se cunoaște că, la mamifere, tiroxina activează un set de peste 100 de enzime, printre care și fosfataza alcalină. În plus, fosfataza alcalină este principala enzimă secretată de osteoblaste, creșterea activității ei relevând intensificarea proceselor de remaniere osoasă sau de creștere osoasă.
Tabelul 9
Efectele tratamentului experimental cu tiroxină asupra activității unor enzime serice la găini tratate experimental cu tiroxină (5micrograme/kg greutate vie), timp de10 zile, comparativ cu un lot martor
Legendă:
X sx = Media ± eroarea standard a mediei
GOT (AST,ASAT)=Transaminază glutamic-oxalacetică
GPT (ALT, ALAT)=Transaminază glutamic-piruvică
GGT = Gamma-glutamiltransferaza
FA = Fosfataza alcalină
Legendă :
GOT (AST,ASAT)=Transaminază glutamic-oxalacetică (în U.I.)
GPT (ALT,ALAT)=Transaminază glutamic-piruvică (în 1/10 U.I.)
GGT = Gammaglutamiltransferaza (în U/I)
FA = Fosfataza alcalină (în 1 x 10 U/I)
[NUME_REDACTAT] 10 sunt prezentate rezultatele determinărilor privitoare la unii parametrii biochimici sanguini: proteinemie totală, albuminemie, globulinemie, precum și nivelul calciului, fosforului și raportul Ca/P. Ca și în cazul parametrilor eritrocitari, parametrii biochimici sanguini sunt slab modificați, în sensul reducerii nesemnificative (statistic) a proteinelor totale. Astfel, proteinemia totală a fost cu 0,57 g/dl mai redusă la lotul tratat cu tiroxină, comparativ cu lotul martor, această reducere realizându-se atât pe seama fracției albuminice cât și a fracției globulinice. Fracția albuminică a protenielor serice a fost cu 0,33 g/dl mai redusă la lotul tratat cu tiroxină, iar fracția glubulinică a fost mai redusă cu 0,31 g/dl. Scăderea nivelului proteinemiei pe seama albuminelor este caracteristică în hipertiroidism la mamifere [ 4]. Rezultatele obținute de noi în experimentul de față relevă că și la păsări (respectiv găină) hipertiroidismul experimental are efecte asemănătoare, de scădere a proteinelor serice pe seama albuminelor.
În cea ce privește nivelul sanguin al calciului, se constată o ușoară creștere, valorile fiind cu 0,18 mg/dl mai mari decât la martor, cea ce constitue diferențe nesemnificative (P>0,05). Pe de altă parte, însă, nivelul sanguin al fosforului este mai scăzut decât al martorului, cu 0,47 mg/dl. Acest fapt conduce la o valoare semnificativ mai crescută a raportului Ca/P : 4,34, față de 3,60 la martor.
Este binecunoscut că tiroxina înfluențează metabolismul calciului indirect: acest hormon stimulează activitatea enzimelor implicate în absorția intestinală a calciului și, de asemenea, stimulează sinteza de fosfatază alcalină, așa după cum s-a constatat și în prezentul experiment. Rolul fosfatazei alcaline în mineralizarea osoasă este de asemenea binecunoscut. Tiroxina influențează metabolismul calciului și pe calea stimulării secreției de estrogeni.
Cu toate acestea, la om, tratamentele prelungite cu tiroxină nu influențează mineralizarea osoase, excluzându-se riscul osteoporozei [18].
Serakides et al. (2000) au cercetat interrelația dintre tiroidă, gonade și metabolismul osos pe femele șobolan intacte sau castrate, în condiții de hipertiroidism sau eutiroidism [31]. Autorii au constatat că hipertiroidismul a indus hiperfosfatemie și hipocalcemie, în timp ce hipogonadismul a avut un efect redus asupra nivelurilor de fosfor dar a potențializat efectele hipertiroidismului în ceea ce privește hiperfosfatemia și hipocalcemia. Hipertiroidismul a redus și efectul hipoganadismului asupra activității fosfatazei alcaline [31].
Kaasik et al. (1997) arată că hormonii tiroidieni stimulează eliberarea ionilor de calciu din reticulul sarcoplasmic, efect bazat pe activarea în mai mare măsură a pompei reticulare de calciu [19]. .
Tabel 10
Nivelul unor parametri biochimici sanguini la găini tratate experimental cu tiroxină (5 micrograme/kg greutate vie), timp de 10 zile, comparativ cu un lot martor
Legendă;
X±sx = Media ± eroarea standard al mediei
CONCLUZII
Tratamentul experimental cu tiroxină al găinilor în vârstă de 16 săptămâni a condus la modificări ale sporului ponderal precum și ale metabolismului principalelor categorii de substanțe din organism (proteine, glucide și lipide), materializate în modificări ale principalilor parametri biochimici sanguini, după cum urmează:
asupra sporului ponderal, la păsări, spre deosebire de majoritatea mamiferelor, tiroxina are efecte stimulatoare, explicate de intenificarea anabolismului proteic, intensificare materializată în creșterea secreției de enzime digestive;
dintre parametrii biochimici sanguini se remarcă intensificarea activității transaminazelor serice (ALT, AST) precum și a activității gamma-glutamiltransferazei, ceea ce duce la un turnover ridicat al proteinelor și, deci, la un metabolism proteic intensificat. De asemenea, activitatea fosfatazei alcaline a fost aproape dublă față de martor, relevând intensificarea proceselor de remaniere osoasă;
parametrii hematologici principali (numărul de eritrocite, nivelul hemoglobinei, hematocritul etc. ) sunt nesemnificativ modificați în urma tratamentului experimental cu tiroxină la păsări;
metabolismul calciului și al fosforului sunt, de asemenea, influențate în oarecare măsură sub acțiunea tiroxinei. [NUME_REDACTAT]/P este, însă, semnificativ crescut sub influența tratamentului cu tiroxină, comparativ cu lotul martor.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Cercetari Privind Efectele Hipertiroidismului Experimental la Gaina (ID: 1055)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.