Studii Privind Efectul Antioxidant AL Unor Alimente Vegetale Bogate In Tocoferoli

=== l ===

CUPRINS

Partea I

Studiu bibliografic

Listă abrevieri………………………………………………………………………………………………4

Introducere………………………………………………………………………………………………….6

Capitolul 1 STRESUL OXIDATIV…………………………………………………………..7

1.1 Radicalii liberi ai oxigenului…………………………………………………………….7

1.1.1 Oxigenul singlet……………………………………………………………………..10

1.1.2 Peroxidul de hidrogen……………………………………………………………..12

1.1.3 Radicalii hidroxil…………………………………………………………………….13

1.1.4 Peroxizii…………………………………………………………………………………15

1.2 Nocivitatea stresului oxidativ………………………………………………………….22

1.2.1 Efectul SO asupra hematiilor…………………………………………………….22

1.2.2 Efectul SO asupra ficatului……………………………………………………….25

Capitolul 2 ANTIOXIDANȚI………………………………………………………………….28

2.1 Considerații generale………………………………………………………………………28

2.2 Antioxidanți naturali enzimatici……………………………………………………….29

2.2.1 Superoxid-dismutaza……………………………………………………………….29

2.2.2 Catalaza…………………………………………………………………………………35

2.2.3 Glutation-peroxidaza……………………………………………………………….36

2.2.4 Glutation-transferaza……………………………………………………………….37

2.3 Antioxidanți neenzimatici………………………………………………………………..37

2.3.1 Glutationul……………………………………………………………………………..38

2.3.2 Vitamina E……………………………………………………………………………..39

2.3.3 Acidul ascorbic……………………………………………………………………….41

2.3.4 Seleniul………………………………………………………………………………….41

2.4 Antioxidanți vegetali………………………………………………………………………42

2.4.1 Produse vegetale cu compuși polifenolici…………………………………..42

2.4.2 Produse vegetale cu vitamina C……………………………………………….43

PARTEA II

Contribuții personale

SCOPUL ȘI OBIECTIVUL LUCRĂRII…………………………………………………………..50

Capitolul 3 DETERMINAREA INDICELUI PEROXIDIC……………………………51

3.1 Metode și tehnici de lucru………………………………………………………………51

3.2 Rezultate experimentale și discuții………………………………………………….53

Capitolul 4 DETERMINAREA UNOR PARAMETRI AI SO………………………..57

4.1 Modelul experimental……………………………………………………………………..57

4.2 Determinarea activității catalazei…………………………………………………….63

4.3 Dozarea superoxid-dismutazei…………………………………………………………66

Concluzii……………………………………………………………………………………73

Bibliografie………………………………………………………………………………75

LISTĂ DE ABREVIERI

aa = aminoacizi

AA = acid ascorbic

AG = acizi grași

AGPN = acizi grași polinesaturați

AO = antioxidanți

ATP = adenozin trifosfat

Cu+ = cationul cupros

Fe+2 = cationul feros

γ-GT = γ- glutamil transpeptidaza

GSH = glutation (forma redusă)

GSSG = glutation (forma oxidată)

Hb = hemoglobina

HbO2 = hemoglobina oxidată

H2O2 = peroxid de hidrogen

HO = radicalul hidroxil

LDH = lactat dehidrogenaza

MDA = malonil dialdehida

1O2 = radicalul oxigen singlet

O·2¯= radicalul superoxid

O22¯ = radicalul peroxid

RES = rezonanța electronică de spin

RL = radicali liberi

RLO2 = radicalii liberi ai oxigenului

SO = stres oxidativ

SOD = superoxid dismutaza

PARTEA I

STUDIU BIBLIOGRAFIC

INTRODUCERE

Secolul al XX – lea constituie o perioadă foarte importantă, din punct de vedere al descoperirilor, pentru științele biologice și medicale. Această descoperire a adus importante modificări în actul medical.

Studiile amănunțite efectuate asupra acțiunii radicalilor liberi au evidențiat mai multe lucruri care au uluit cercetătorii pasionați de medicină, nu numai prin faptul că majoritatea xenobioticilor (substanțe medicamentoase, substanțe aromatizante introduse în organism odată cu alimentele, noxele din atmosferă, sol, etc.) acționează asupra organismului viu legându-l prin intermediul radicalilor liberi, ci și prin faptul că aceștia sunt produși chiar în interiorul organismului, în anumite condiții, provocând leziuni nocive.

Uimitor este și faptul că organismul viu a găsit mecanisme de neutralizare a excesului de radicali liberi.

Numeroase cercetări au evidențiat existența stresului oxidativ care de fapt reprezintă totalitatea deteriorărilor oxidative produse de radicalii liberi ai oxigenului la nivel celular și a întregului organism.

Această lucrare încearcă să elucideze principalele mecanisme și căi de apărare împotriva stresului oxidativ.

Între posibilitățile de apărare ale organismului împotriva stresului oxidativ se situează și utilizarea unor antioxidanți naturali prin alimentație (vitaminele A, C, E, minerale Cu, Se, Zn ) din plante sau sub formă medicamentoasă ( aspirina, acidul ascorbic etc).

CAPITOLUL 1

STRESUL OXIDATIV

Această noțiune a fost propusă simultan de mai mulți cercetători cum sunt: H. Sies (1985), T.F. Slater, S. Orrenius, R. Sohal (1982), deosebindu-se între ei mai mult prin aprecierea extinderii acestui fenomen. [NUME_REDACTAT] (H. Sies , M. E. Murphy, 1991) stresul oxidativ (SO) cuprinde toate deteriorările oxidative produse de radicali ai O2. Numeroase lucrări au arătat că spre deosebire de acțiunea oxidativă in vitro a radicalilor O2 asupra unor molecule de interes biologic (proteine, aminoacizi etc.) stresul oxidativ se ocupă mai ales de efectele de la nivelul celulei sau a întregului organism. Deci în acest sens, intră în sfera stresului oxidativ procesele biologice complexe cum sunt inflamațiile, cancerogeneza chimică, senescența sau boala de iradiere.

1.1 RADICALII LIBERI AI OXIGENULUI

Factorul principal agravant, care determină creșterea intensității formării radicalilor liberi (RL) este activitatea oxigenului. Datorită prezenței acestui element nu numai în atmosferă, dar și în aproape toate substanțele care compun organismul, interacțiunea radicalilor liberi cu oxigenul este inevitabilă. Conținutul în O2 este indicat în tabelul 1.1.

Tabelul 1.1 Conținutul în O2 din atmosferă și organism

Datele din acest tabel arată convingător conținutul important în O2 nu numai din organism, dar și din atmosferă și pământ.

A doua caracteristică a O2 este legătura sa electronică deosebită. Astfel, O2 are pe ultimul strat doi electroni neparticipanți, fiecare localizat pe câte un orbital n* ( R. Olinescu, 1982 ).Acești doi electroni au același număr cuantic de spin, astfel că dacă O2 încearcă să oxideze un compus acceptând doi electroni, aceștia trebuie să fie cu numărul de spin paralel, pentru a putea ocupa spațiile libere din orbitalii n*. Se știe că într-un orbital atomic, o pereche de electroni au spini antiparaleli ( +1/2 și -1/2 ). Această particularitate impune o restricție asupra oxidărilor, determinând ori o reactivitate mică ori una foarte mare, în funcție de natura donorului de electroni.

Structura electronică a O2 , așa cum este cunoscută, explică de ce acest element, deși poate fi socotit un diradical liber (datorită prezenței a doi electroni impari) are o reactivitate mică. Pentru ca un donor de electroni să fie oxidat, trebuie să aibă loc o inversie de spin, fapt posibil ori prin reacția O2 cu metale tranziționale, paramagnetice ( Cu, Fe, Mn )sau prin reducerea univalentă, în două etape, a câte unui electron. Toate oxidările din natură se bazează pe aceste două căi, chiar dacă formele pot apărea foarte variate.

Metalele tranziționale formează centrii activi ale unor enzime redox, iar oxigenazele sunt capabile de a cataliza reduceri de câte un electron. Însă, așa cum este prezentat în fig.1.1, reducerea univalentă a O2 produce radicali liberi reactivi. Creșterea reactivității O2, pe măsura activării sale, se datorează creșterii distanței între atomii de oxigen, de la 1,12 Å la O2 , la 1,33 Å pentru O2¯ în 1,49 Å în cazul O2 2¯ (peroxid). În același sens scade și energia de legătură O−O în ordinea menționată 118 > 64 > 51 Kcal / mol ( Halliwel B. 1988, R. Olinescu, 1982, Sies H. 1985 ).

Pe măsura creșterii reactivității O2 prin activare, acest prin radicalii liberi formați va reacționa cu apa, extrăgând un proton și formând alte specii reactive cum sunt HO2; H2O2 și mai ales HO (hidroxil). Activarea oxigenului are loc la nivelul orbitalului n*2p producând mai multe specii reactive, dintre care unele au caracter net de radical liber. Aceste specii reactive moștenesc caracterul paradoxal al O2. Ținând seama de frecvența mare a reacțiilor de trecere de la o specie la alta, termenul de specii reactive ale oxigenului ar fi cel mai adecvat ( Bhunyan D.K. 1983 , Halliwel B. 1988 , Olinescu R. 1989 ). Cu toate acestea, în literatura medicală și chiar cea biochimică se folosește termenul de RL și O2, ( RLO2 ) prin care sunt incluse toate speciile respective, indiferent de caracterul de radical liber ( Krinsky N.I. 1984, Terao J. , Matsushita S.,1988 ).

După datele clasice, reducerea O2 la 2H2O necesită 4 electroni, iar reducerea univalentă are loc etape succesive de 1 electron cu producerea de specii reactive. Toxicitatea O2 are loc pe această cale.

În fig.1.1 este prezentată schema reducerii univalente a O2, cale prin care se produc RLO2 cu mare toxicitate, in special al HO. Pe cale evolutivă, organismele au favorizat totuși o reducere tetravalentă a O2 laH2O prin reacția catalizată de citocrom oxidaza, care nu produce RL. Se apreciază că, reducerea univalentă a O2 reprezintă, filogenetic, aproximativ 5% din cantitatea totală de oxigen,cifră rezonabilă, ținând seama de toxicitatea RLO2(Cadens E., 1989).

Fig.1.1 Schema reducerii univalente a O2 și formarea radicalilor liberi ai oxigenului (RLO2)

1.1.1 OXIGENUL SINGLET

Oxigenul poate exista in două forme singlet ,reactive, constituind a treia cale de a evita restricția de spin. Cea mai puțin importantă formă, O21Σg are un timp de viață extraordinar de scurt și nu contează. În schimb 1Δg sau 1O2 are o stabilitate ceva mai mare ( 22 Kcal/mol, față de 37 Kcal / mol al primei forme ). Ambele forme singlet constituie stări ale excitației electronice și provine prin absorbția unei cuante de energie și saltul unui electron pe un nivel energetic, (Olinescu R., 1982 ). 1O2 intervine în fenomenul chimiluminescență, emisia având două maxime. Un maxim este situat la 1268 nm )emisie monomolară ) și altul la 634 nm (emisie dimolară ).Cu toată existența foarte scurtă, 1O2 a putut fi detectat spectroscopic prin iluminarea flavinelor, porfirinelor, clorofilei sau a cloroplastelor, retinei și cristalinului din ochiul mamiferelor ( B. Halliwell, 1988).

1O2 are un caracter electrofil, reacționând cu mulți compuși organici cum sunt acizii grași polinesaturați, colesterol, oleine formând hidroperoxizi sau cu compuși organici conținând atomi de S sau N producând oxizi. ( A.Singh, A.Petkau, 1977). În 1990, Kanofsky de la [NUME_REDACTAT], Maywood, J.J. Kanofsky, 1991) folosind un spectometru pentru fosforescență cuplat cu un laser cu coloranți ( R. Olinescu; M. Greabu, 1987) a găsit că 1O2 poate fi detectat în plasma umană, având o viață de 1,4±0,03 µs. După datele lui Kanofsky, 1O2 în plasmă este stins de majoritatea antioxidanților, dar mai ales de albumină cu o constanta de 7×108 Mˉ1sˉ1.Această constatare dovedește în plus multiplele sisteme defensive față de această specie reactivă. În timp ce O2 nu reacționează cu aminoacidul binecunoscut, histidina, la temperatura de 20ºC, 1O2 descompune acest compus cu o viteză de 6×107Mˉ1sˉ1. Datorită marii sale reactivitați, studiile asupra 1O2 au utilizat pe scară largă inhibitori specifici cum sunt: 1,3 − difenilizobenzofuran, 2,5 − difenilfuran, 2,5 − dimetilfuran, 1,4 − diazi-biciclo (2,2,2) octan. Dintre antioxidanți, α-tocoferolul, caroteni și bilirubina posedă de asemenea capacitatea de a stinge oxigenul în stare singlet (R. Olinescu, M. Greabu, 1987; A. Singh, A. Petkau, 1977)

Triptofanul este principalul aminoacid care reacționează rapid cu 1O2 și principalele efecte ale fotosensibilizării sau ale fotodinamicii includ această reacție. În acest sens s-au publicat lucrări atestând implicarea singletului O2 în fotodermite produse de unele medicamente, cosmetice, toxine din plante sau porfirine (B. Halliwell, J.M.C. Gutterige,1989) iar cataracta este cazul cel mai evident. De asemenea fototerapia include, după toate aparențele, 1O2 ca mecanism de acțiune în tratamentul cancerului pulmonar cu derivați ai hematoporfirinei. Deși nu s-a precizat care antioxidanți sunt cei mai eficienți printre produșii naturali, pacienții cu fotodermite beneficiază de o ameliorare prin dieta bogată în caroteni. Tot în același sens, pare să existe o relație inversă între conținutul ridicat de caroteni din dietă și frecvența cataractei și a cancerului cutanat ( B.Halliwell, J.M.C. Gutterige, 1989; J.Hidalgo, 1991).

1.1.2 PEROXIDUL DE HIDROGEN

Adiția unui al doilea electron la O2ˉ produce ionul peroxid, O22 ˉ, care nu are electroni impari și nici un caracter de radical liber. În organism, orice peroxid format va trece în forma cunoscută de H2O datorită valorii foarte mari a ph. H2O2 se formează rapid prin reacțiile de dismutare ale O2ˉ . Ca și O2, H2O2 este un agent oxidant slab acționând mai ales asupra compușilor nesaturați (eteri) și triptofan. Principalele reacții ale H2O2 au loc cu ionii metalici. Probabilitatea realizării lor cu Fe2+ și cu Cu+ este destul de mare ținând seama de frecvența acestor metale și a formării H2O2 (de exemplu prin fagocitoză). În acest sens, ținând seama de activitatea unor oxidaze care produc H2O2 (glicolat, monoamine) cât și de transportul electronic mitocondrial, s-a apreciat de către Williams și Chance ( L.Packer, 1984) o formare de 82 nmoli H2O2/g țesut/min. În ochiul uman (cristalin) se formează H2O2 în concentrații micromolare, același nivel fiind observat și în aerul expirat. Devine evident că în cursul evoluții vieții, pentru neutralizarea H2O2 s-a utilizat tot reacția Fonton, dar cu aceeași ioni în starile superioare de valență și sub forma unor enzime (catalaza, peroxidaza).

2H2O2 Cu2+,Fe3+ O2+2H2O (1)

Comparativ cu radicalii liberi nocivi formați în alte reacții, reacția de mai sus este foarte favorabilă vieții. Variantele acestei reacții sunt:

CATALAZA−Fe+3 H2O2+H2O2 O2+2H2O

PEROXIDAZĂ

H2O2+H2R R+2H2O (2)

Cu toată reactivitatea relativ scăzută a H2O2, existența acestor enzime în cantitate apreciabilă în mai toate celulele aerobe pledează pentru importanța necesității neutralizării acestui compus. Dintre toate speciile reactive ale O2, H2O2 este cel mai stabil și mai ușor de măsurat, astfel că prezența acestui peroxid în toate formele existente a fost demonstrat de mult. A doua constatare mai greu de explicat este că reactivitatea H2O2 din produsele comerciale este mai mică de 4 ori decât cea produsă in vivo. Această toxicitate ar putea fi explicată, atât prin conversia in alți radicali ai O2 (indirectă) sau printr-un efect direct asupra unor structuri celulare. Strâns legată de celelalte două trăsături este cea de-a treia, că H2O2 pare a fi o armă citolitică univalentă în lumea celulară și pluricelulară. Sensibilitatea unor bacterii la H2O2 a devenit un criteriu de selecție a bacteriilor și evoluează în paralel cu conținutul în catalază (pneumococ).

1.1.3 RADICALUL HIDROXIL

Alături de 1O2 radicalul OH este cea mai puternică specie a O2. Potențialul cuplului OH/OH¯ este de 1,4V. Metoda cea mai simplă de formare a OH este prin hemoliză sau scindarea oxidativă a HO−OH sub influența căldurii sau a radiațiilor UV și ionizate. În organisme, căile cele mai probabile provin din reacțiile de interconversie ale O2¯ și H2O2 mai ales în prezența ionilor metalici. Radicalul hidroxil, OH reacționează cu viteze mari (constante de viteză, bimoleculare între 107 − 1010 M¯ 1 s¯1)cu absolut orice moleculă organică (RH) (glucide, aminoacizi, lipide, acizi nucleci, acizi organici).

OH·+RH→OH¯+RH+ SAU R· +H2O (3)

Prin această reacție generalizată se subliniază o proprietate esențială a OH care constă în producerea altor radicali liberi (R) cu structuri variate. Astfel, cităm extragerea unui H din metanol (CH3OH) sau acizi organici:

CH3OH·+OH·→CH2OH·+H2O (K=2×109 M¯1s¯1) (4)

sau transfer de electroni pentru compuși organoclorurați sau ioni de clor:

Cl¯+OH·→Cl·+OH¯ (5)

Tot prin dovezi experimentale (H.M. Hassan, 1984; D. Tanotti, 1986) s-a dovedit că însăși OH acționează direct sau prin intermediul altor radicali ai O2. În sprijinul unui efect direct prezentăm un tabel comparativ.

Tabelul 1.2 Constantele de viteză ale reacțiilor unor radicali ai O2 cu unii compuși (W.A. Pryor, 1976)

Reactivitatea extraordinar de mare a OH devine foarte evidentă, mai ales când se compară cu cea a superoxidului. Indiferent de acțiunea directă sau indirectă, formarea radicalului OH foarte aproape de molecule critice ca ADN sau enzime reglatorii, la distanțe adecvate ( 5diametre moleculare sau – 20 Å) poate avea efecte distructiv oxidative (D.I. Thurnan, 1988).

Indiferent de acțiunea directă sau indirectă a radicalului OH, acesta odată format va produce și radicali peroxil, ROO(RO2) conform reacției:

O2

R-H+OH·→H2O+R· ROO· (6)

1.1.4 PEROXIZII

Peroxizii, ca produși rezultați din activarea O2, au fost studiați foarte mult. Acest lucru se datorează mai multor cauze. În primul rând, dintre toate speciile active ale O2, peroxizii și produșii lor de descompunere sunt cei mai stabili și universal răspândiți. În al doilea rând, peroxizii apar nu numai în organisme, dar și în obiectele din jur cum sunt plastice, cauciuc, vopsele, carburanți etc. ( R.Olinescu, 1982). În al treilea rând, din cauza implicațiilor economice și chiar militare, cercetările asupra cauzelor și prevenirii peroxidării sub diferite forme (râncezire, îmbătrânirea plasticelor etc.) au luat o amploare deosebită în cursul celui de-al doilea război mondial și în anii următori. Implicațiile peroxizilor în consecințele expunerii la radiații (UV și ionizante) au trezit interesul cercetătorilor în anii ’50 -’60, urmând ca pe măsura acumulării de noi date să se descopere noi domenii aplicative.

SOD

[NUME_REDACTAT] O2¯ [NUME_REDACTAT]

redox

Fe H2O2

[NUME_REDACTAT]

Scăderi ale OH

GSH, NADH

Reacții cu ADN, lipide, glucide

Amplificarea dete-

Riorărilor tisulare(variația Ca2+)

Radicali peroxi, ROO¯,(RO2)

Fe

PEROXIZI

Fe

(Produși de descompunere)

aldehide, hidrocarburi

Fe

A LIPOFUSCINA

H2O2 OH2

DISTRUGERI

O·¯ 2 TISULARE RO·2

1O2 ROOH

B

Fig.1.2 Schema evolutivă a RLO2 cu factorii stimulatori, interferenți și inhibitori (A),cât și interacțiile dintre speciile reactive ale O2 (B).

Formarea peroxizilor cuprinde următoarele etape: de inițiere, propagare și de descompunere (R. Olinescu, 1982). Din reacțiile menționate anterior și din figura 1.2A, rezultă că peroxizii sunt produși direct prin intermediul OH ; dovezile experimentale directe sau indirecte o confirmă. Peroxizii pot fi însă și din singlet 1O2, dovedit experimental prin adiție la duble legături ale acizilor grași la acizi grași polinesaturați olefine, compuși aromatici ca triptofan (Bhungan D.K., 1983; R. Olinescu, 1982). Procesul de peroxidare mai are o caracteristică extrem de importantă rezultând din generarea unor catalizatori proprii, formați din radicali liberi sau produși de degradare, care amplifică sau ramifică reacțiile oxidative astfel că pot cuprinde toate structurile favorabile. Aceste structuri cuprind acizi grași polinesaturați, hemoproteine, acizi nucleici, glucide și steroizi. Odată formați, peroxizii (RO2) vor reacționa cu o gamă mare de substanțe prin reacții de tipul:

a) extragerii unui atom de H din hidrocarburi benzilice și alilice;

RO·2RH·→ROOH+R· (7)

RO·2+R·SH→ROOH+RS· (8)

Aldehide, fenoli, compuși tiolici și aromatici producând hidro-peroxizi

b) transfer de electroni, în special cu ioni metalici;

RO·2+Fe2+→RO2¯+Fe3+ (9)

c) auto-oxidări ale peroxizilor care constituie faza de propagare;

RO·2+RO·2→2RO·+O2

RO·2+RO·2→ROOR+O2

RCH−OO·+RCH–OO·→RC=O+RCHOH+O2 (10)

d) reacții cu diverse proteine, enzime care au loc la nivelul grupărilor SH, hem, triptofanului sau a altor aminoacizi.

Caracteristica de bază a peroxidării constă în producerea unor reacții în lanț, în cursul cărora pot apărea un amestec foarte complex de peroxizi( hidroperoxizi, endoperoxizi ciclici) și de produși de descompunere ( aldehide și cetone).

Pentru producerea unei peroxidări in vitro sau in vivo, trebuie îndeplinite condițiile favorabile care constau în raporturi existente pro-oxidanți / antioxidanți substraturi favorabile / nefavorabile. Chiar și in vitro ( condiții de laborator, în sisteme sau prin depozitarea unor conserve, ori a unor plastice etc.) procesul de peroxidare este foarte complex, cu perioadele de inițiere și evoluție imprevizibile, datorită atenuării și a altor substanțe prezente în mediu.

Surse de producere a radicalilor liberi inițiatori se găsesc atât în mediul ambiant cât și în organism, având forma R, ROO, 1O2. Aceștia vor ataca mai ales pro – oxidanții existenți, substanțe sau ioni pentru care radicalii liberi au, mare afinitate. Acțiunea radicalilor liberi asupra pro – oxidanților este însă contracarată de antioxidanți sau de reacții ale radicalilor liberi de disipare sau de descompunere.

Tabelul 1.3 Principalii pro – oxidanți și antioxidanți naturali

K1= viteza acidului linoleic ( moli acid / moli compus / oră).

Din tabel se pot trage două concluzii :

sistemele enzimatice sunt cele mai eficiente atât în favorizarea cât și în combaterea peroxidării;

substanțe ca acidul ascorbic sau compuși conținând hem (hemoglobină sau mioglobină) pot acționa atât ca prooxidanți (concentrații mici) sau ca antioxidanți (concentrații mari), (B. Halliwell, 1991; R.Olinescu, 1982).

În plus, unii cercetători au evidențiat ca radicalii liberi atacă antioxidanții producând alți radicali liberi specifici (tocoferol) dar cu reactivitate scăzută, ce participă mai puțin în reacțiile de inițiere a peroxidării (E. Cadenas, 1989). Acest context devine explicabil atâtor variante experimentale ale producerii peroxizilor cu rezultate adesea contradictorii. Atât în producerea peroxizilor din acizii grași polinesaturați (AGPN) lipozomi, mitocondrii sau microzomi din ficat ce creează condiții artificiale în care substanțele respective pot fi contaminate cu urme de peroxizi, pro – oxidanți, ioni metalici etc. În acest sens, de asemenea, devine plauzibilă existența unora în exploatarea condițiilor de peroxidare de la acizii grași polinesaturați la microzomi, la nivelul unui organism în totalitate, astfel încât să apară peroxizi în circulația sanguină. Faptul că acești peroxizi lipidici cât și produșilor de descompunere au fost evidențiați prin diverse metode la oameni și animale în condiții de sănătate, pledează puternic în favoarea existenței proceselor generatoare de radicali liberi și de peroxizi în organism (R. Olinescu, 1982; B. Halliwell, 1988). Odată procesul de peroxidare declanșat se creează condiții pentru generarea propriilor catalizatori (R*, ROO*, OH*) evoluția fiind foarte greu de controlat.

Așa cum se observă chiar din prima reacție a procesului se creează, caracteristic, un sistem de duble legături conjugate, numit conjugarea dien, care determină o absorbție specifică la 235 nm. Acest maxim poate fi masurat atât în sisteme simple (AGPN peroxidați) cât și lipide extrase din sânge de la pacienți (Bhunyan D.K. , 1983). În sisteme simple, procesul de peroxidare evoluează atât prin producerea de maxim la 235 nm (conjugarea dien ) dar și a altor maxime în regiunea UV apropiată a spectrului ( 250 – 300 nm) în care sunt implicați radicali R*, ROO2* sau radicali liberi legați cu structuri lipoproteice.

Cazul lipoxigenazei este deosebit de interesant în sensul că inițial s-a crezut în existența ei doar la plante, dar a fost descoperită și în numeroase celule ( leucocite și trombocite) sau fracțiuni subcelulare ( mitocondrii, microzomul di testicul), (W.A.Pryor, 1976). Această enzimă ce conține Fe2+ neheminic, cu spin înalt, catalizează peroxidarea acizilor grași polinesaturați în hidroperoxizi (trans) într-o reacție , din care se formează radicali liberi (detectabil prin rezonanța electronică de spin ) dar și prin chemiluminiscență datorită formării unor derivați carbonilici în stare triplet și a 1O2. După cum arăta Cadenas E. (1989) intensitatea fotoemisiei și cantitatea de O2 consumat sunt corelate liniar cu numărul dublelor legături din substratul AGPN. Deci enzima este implicată atât în inițierea peroxidării dar și în cea a descompunerii lor. Odată hidroperoxizii formați, având caracter electrofilic, ei vor reacționa cu alți RL sau ioni metalici perpetuând ciclul.

ROO+Fe3+→ROO·+Fe2++H+

ROOH+RO·→ROO·+ROH

ROOH+ROO·→ROO·+ROOH (11)

Reacția de disproporționare a radicalului peroxid, ROO* este exotermică (aproximativ 150 kcal) fiind favorizată obținerea unor stari excitate a fragmentului carbonil din substrat ( necesitând 80 kcal). Fragmentarea catenei substratului ( de exemplu AGPN ) are loc prin radicalii ROO*.

ROO·+ROO·→ROH+3RO·+3O2 (12)

Formându-se compuși excitanți în stare triplet dar care în final va duce la apariția O2 în stare singlet, permițând continuarea ciclului:

ROO·+ROO·→ROH+RO·+1O2 (13)

Așa se explică producerea unei chemiluminiscențe atât în peroxidare catalizată de lipogenază, dar și în cea inițială de Fe+ – bleomicină sau de compuși conținând gruparea hem.

Complexitatea procesului de peroxidare se oglindește și în multiplele posibilități de determinare. Diferitele referate sau cărți ( B. Halliwell, 1989; N.I. Krinski, 1984) care tratează această problemă subliniază necesitatea utilizării mai multor tehnici ce folosesc principii diferite. În timp ce în domeniul industrial se folosesc tehnici chimice sau fizico – chimice ce măsoară peroxizii în totalitate, în probele biologice s-au utilizat metode indirecte, care pun în evidență produșii de descompunere ( aldehide, malon – dialdehide, MDA ) sau mai recent hidrocarburi inferioare ca pentan.

Astfel, auto-oxidarea linoleatului de metil fără catalizatori durează peste 200 de ore în cursul cărora se pot diferenția fazele de inițiere (1) conjugare dien (2) și de descompunere în aldehide (3,4). În schimb, măsurând consumul de O2 și sub influența pro-oxidantă a hemoproteinelor, peroxidarea durează câteva minute (R. Olinescu, 1982).

Majoritatea lucrărilor experimentale referitoare la peroxidarea in vitro folosesc doar câteva variante ale inițierii peroxidării efectuându-se pe cromozomi, determinându-se concentrația de malon-dialdehide rezultată prin incubarea suspensiei cu diverse sisteme peroxidante.

În următorul tabel se pot observa diferențele mari între peroxidarea din ficat și cea din epidermă.

Tabelul 1.4 Peroxidarea lipidică în suspensie de microzomi ( R.Dixit, H. Mukhtar, 1983; N.I. Krinsky, 1984)

1.2 NOCIVITATEA STRESULUI OXIDATIV

Datorită reactivității mărite, radicalii au fost incriminați în foarte multe acțiuni nocive organismului. În anii ´60 s-a demonstrat că radicalii sunt implicați în deteriorări induse de radiațiile ionizate si UV determinând modificări calitative, produse ale radicalilor asupra proteinelor acizilor nucleici și mai ales asupra substanțelor ce conțin gruparea sulfhidril (SH), cum sunt cisteina și glutatiolul. Abia în anii '70 s-a dovedit că ținta principală a radicalilor este constituită din membranele biologice celulare, cu consecințe precoce sau tardive asupra organismului.

1.2.1 EFECTUL STRESULUI OXIDATIV ASUPRA HEMATIILOR

Lipsa unui nucleu, a mitocondriilor și a altor organite, cu viața relativ lungă de 120 zile constituie factori avantajoși. Prin obținerea lor rapidă în stare pură s-au creat modele experimentale ieftine, simple, foarte utile pentru studiul metabolizării unor medicamente, reglarea unor procese metabolice sau interacțiunea unor xenobiotice. Un avantaj mare al acestui studiu asupra hematiilor îl constituie faptul că aceste celule reacționează la acțiunea oxidantă a unei substanțe într-un anumit domeniu de concentrație. În acest sens, o gamă largă de medicamente, poluanți chimici sau substanțe toxice acționează asupra membranei hematiei sau asupra hemoglobinei producând radicali intermediari ce determină methemoglobinizare, modificări calitative structurale și hemoliza. Această acțiune poate fi totală și rapidă (fenilhidrazina sau nitriți) ori parțială, treptată, în funcție de concentrație, când pot apărea reacții ale hematiei, de apărare sau de neutralizare a stresului oxidativ. Așa se explică introducerea curentului stres, când, pentru un anumit domeniu de concentrație al noxei, celula poate supraviețui. Un exemplu îl constituie acțiunea vitaminei K3 (menadiona, 2 – metil, 1 , 4 – naflochinona) asupra unei suspensii de hematii la concentrații mari, 10-3M, va predomina acțiunea methemoglobinizată, de inhibare a glicolizei și de oxidare a glutationului și a altor proteine ce conțin gruparea SH (R. Olinescu, E. Tomas, 1967)

După cum se știe, pentru concentrații de vitamina K3 mai mici de 5×10-4M, methemoglobina va scade ca urmare a activării glicolizei, furnizare de NADH necesară methemoglobin reductazei. Glutationul oxidat va fi recuperat de către reductaza NADPH dependentă. Reacțiile sunt următoarele:

Hemoglobina+VitaminaK→Methemoglobina+Vit.K–epoxid (1) Hemoglobina reductaza Methemoglobina (2)

Glucoza →Acid lactic+NADH(+NADPH prin sunt) (3)

GSSG reductaza 2GSH (4)

Se observă în acest complex de stres oxidativ că supraviețuirea celulei și păstrarea hemoglobinei ( Hb-Fe2+) în stare redusă depinde de concentrația substanței agresante (vit. K3). Numai în concentrații mici, reacțiile (3) și (4) pot fi activate, furnizând condiții pentru reversibilitatea reacțiilor (1) și (2). O explicație practică, clinică, constă în administrarea albastrului de metilen în unele cazuri de methemoglobinemii, prin care se urmărește activarea șuntului pentozofosfat ( o ramură a glicolizei) și reducerea methemoglobinei de către glutation ( R. Olinescu, 1982; J. Feroo, 1988). În acest sens, se sugerează mecanisme diferite ale efectelor unui oxidant de SO în funcție de concentrație. ATP necesar menținerii unei structuri ordonate a membranelor va fi indirect implicat. Pentru înțelegerea mecanismului implicării RL in SO cercetările laboratorului de [NUME_REDACTAT] din [NUME_REDACTAT], SUA au demonstrat prin studii de compuși aromatici (anilina, nitrobenzen), clorometil-nitrozoureea, peroxizi organici, endoperoxizi ca 15- HPETE se pot detecta în sângele animalelor, radicalul tioil derivat din grupările – SH ale hemoglobinei (K. R. Maples, P. Eyer, R. P. Mason, 1990).

Atacarea hemoglobinei de către metaboliții compușilor toxici are loc la nivelul grupărilor SH din pozițiile β-cisteina -93, 112 și α-104, care prin oxidare determină formarea hemicromilor ireversibili și precipitate sub forma corpusculilor Heinz. Glutationul poate oferi protecție numai înainte de atacarea Hb și numai la un anumit nivel de concentrație, probabil legat de activitatea peroxidazei și transferazei dependente.

În condițiile actuale, datorită unor poluanți chimici în mediul ambiant astfel de SO au loc continuu în organism, care face față pentru un anumit nivel al concentrației SO. În schimb, în deficite enzimatice congenitale, cum sunt cele implicând glucozo-6-fosfat dehidrogeneza, GSH reductaza, talasemia, anemia prin hematii în formă de seceră se conferă hematiilor o sensibilitate față de SO. Frecvența globală a acestor deficite este aceeași cu cea a malariei. S-a demonstrat că parazitul implicat este foarte sensibil la SO astfel că celulele gazdă la persoanele normale au o protecție crescută prin creșterea mecanismelor biochimice.

1.2.2 EFECTUL STRESULUI OXIDATIV ASUPRA FICATULUI

Un domeniu cu largi reverberații pentru SO îl constituie ficatul și rolul lui major în metabolizarea unui număr enorm de compuși endogeni și exogeni. Recent s-a arătat (R. Olinescu, M. Greabu, 1987) ca ficatul este supus unui SO continuu prin implicarea unor metaboliți cu caracter oxidant proveniți prin metabolizarea compușilor organici, hidrocarburilor cancerigene, unele medicamente etc. Compușii chinoidici (Vitamina K2) au un caracter electrofil astfel ca atacă preferențial substanțe nucleofile din componenta celulară.

Menadiona se combină preferențial cu glutationul redus (GSH), centrul electrofilic este reprezentat de dublele legături activate. Reactivitatea mare a complexelor glutationului-hidrochinone pot produce un număr mare de reacți:auto-oxidări, disproporționarea RL. formați, oxidări încrucișate etc .Complexele prezentate pot participa în reacții de transfer al unui electron sau cicluri redox catalizate de diaforaze demonstrate în cazul medicamentelor citostatice de tip antrachimic.

Un alt aspect surprinzător al formării RL în cursul SO hepatic este producerea unor stări electronic excitate demonstrate prin perfuzia ficatului sau metabolizarea prin hepatocite izolate. Chemiluminiscența observată este de lungă durată și a putut fi înregistrată și in situ de o echipă a [NUME_REDACTAT] cu o aparatură adecvată, încă din 1977 (R.Olinescu, M.Greabu, 1987). Emisia chemiluminiscență se datorește unor chinone în stare triplet cu o reactivitate asemănătoare radicalilor deoxil.Formarea chinonelor excitate presupune reacția semichinonelor cu OH. Principalele sisteme protectoare ale ficatului față de stresului oxidativ GSH și enzimele dependentă (peroxidaza, transferaza) și superoxid dismutaza. Aceasta din urmă enzimă pare să catalizeze neutralizarea semichinonelor prin reacția:

Q¯+O2¯+2H+ SOD QH2+O2 (5)

Identificarea RL proveniți din metabolizarea unor poluanți chimici prin RES și marcheri de spin a permis obținerea unei reacții cantitative clare între formarea RL, scăderea GSH și eliberarea unor enzime intracelulare (LDH). În astfel de cazuri (CCl4) se formează RL al substanței respective care poate produce distrugeri tisuale fără implicarea formelor activate ale O2. Afinitatea mare a oxidanților chimici se produce RL pentru GSH hepatic a fost demonstrată de o grupă de cercetători de la laboratorul de [NUME_REDACTAT] din [NUME_REDACTAT] Park, Nc, SUA care au evidențiat prin semnale RES reacția RL a CCl4 cu GSH din microzomii hepatici. SemnaleleRES pot fi comparate cu cele obținute de colegii din același institut dar cu alți oxidanți. Afinitatea RL al CCl4 pentru GSH este atât de mare încât unele GSH din microzomi sunt suficiente.

Tabelul 1.5 Variația unor parametri biochimici în ficatul șobolanilor intoxicați cu alcool etilic (1,5 mmol / kg) și rolul protector al tocoferolului ( H. D. Connor, 1990)

GPTS= transaminaza glutamat – piruvica din ser;

"*" = semnificativ diferit față de valorile inițiale (0) pentru p< 0,05

Se poate observa evident în tabelul 2.1 că după o oră de la intoxicație au loc modificări semnificative în sensul scăderii GSH, vitaminelor C și E concomitent cu formarea de peroxizi lipidici (MDA) și necroza celulară (GPTS).

Concentrațiile locale în GSH și ale oxidantului sunt principalii factori care permit activarea sau inhibarea altor sisteme care sunt vitaminele C și E care par să mențină glutationul în stare redusă.

CAPITOLUL 2

ANTIOXIDANȚI

2.1 CONSIDERAȚII GENERALE

În primele capitole au fost prezentate variate spectre ale măririi RL, evoluția lor și modificările adeseori distructiv – oxidative pe care le produc asupra organismelor vii. Secretul supraviețuirii organismului, al adaptării lor până la nivelul reglării și inducerii RL, al formării lor în concentrații limitate, ușor controlabile constă în găsirea și adoptarea substanțelor oxidante (AO).

Deși structura chimică a AO este total diferită, clasificarea lor este relativ mai simplă așa cum reiese din fig. 2.1.

Vitamina C,E Crategus sp.

[NUME_REDACTAT] C. polifenolici Cynara

scolimus

Sintetici butilhidroxitoluen

ANTIOXIDANȚI

SOD

[NUME_REDACTAT]

Glutation – peroxidaza

Fig. 2.1 Clasificarea antioxidanților

În cazul AO naturali, neenzimatici, se mai deosebesc cei hidrosolubili, ca vitamina C (acid ascorbic) sau liposolubili ca vitamina E (tocoferol).

Marea eficiență a AO constă tocmai în sinergismul acțiunilor, a însumării acțiunii lor combinate, fiecare funcționând după mecanisme diferite și la nivele variate ale lanțului evoluțiilor radicalilor liberi în organism. Fig. 2.1 evidențiază faptul că AO acționează la variate nivele creând posibilitatea reglării și limitării excesului de radicali liberi sau de specii reactive ( peroxizi ). În acest sens organismul și-a creat sistem AO variat ca structură și mod de acțiune, capacitatea potențială de acțiune. Această conectare este legată de acțiunea GSH – peroxidaza asupra peroxizilor, în timp ce SOD și catalaza funcționează singure, dar în medii mai puțin complexe, respectiv citoplasma sau spațiul celular.

Tot în interesul creșterii eficienței, antioxidanții naturali sunt localizați în mai multe componentei ale celulei (membrană, citoplasmă, reticul endoplasmatici), acționând asupra mai multor specii de radicali liberi, de exemplu vitaminele C și E sau GSH peroxidaza. De asemenea, nu întâmplător enzimele cu caracter AO, SOD și catalaza posedă cele mai mari viteze de reacție, aproximativ 2×109 M-1 s-1, fapt ce le permite nu numai o eficiență maximă dar și posibilitatea de a acționa independent de furnizarea unor substraturi sau coenzime.

2.2 ANTIOXIDANȚII NATURALI ENZIMATICI

2.2.1 SUPEROXIDUL DISMUTAZA (SOD)

Primul antioxidant enzimatic este superoxidul dismutaza (SOD) una din cele mai interesante enzime.

În urma efectuării unor experimente legate de reducerea citocromului C de către xantin oxidaza, în 2 aprilie 1968 s-au pus bazele unui domeniu nou, cel al activării O2¯ și a existenței SOD. Prin admiterea producerii O2¯ in vivo, cercetătorii: Mc. Carol și I. Fridavick au admis în plus și existența unei enzime, SOD, care descompune rapid radicalul O2¯.

Cercetătorii americani au demonstrat existența SOD în organism chiar în depozite mari, ce fuseseră catalogate ca incluziuni sau forme de înmagazinare pentru Cu, eritrocupreina (hematii) ,hepatocupreină (ficat) și cerebrocupreina ( creier). Ulterior s-a demonstrat că SOD există în orice celulă aerobă, ba chiar și în bacteriile facultativ aerobe ( J.A.Fee; J.S.Valentine, 1977; H.M.Hassan, 1984).

După cum s-a menționat anterior, viața pe pământ a început să evolueze după ce O2 din atmosferă ajunsese la nivelul 0,0001din cea actuală, iar baceriile fotociansintetice și-au elaborat un tip de SOD conținând Mn în centrul activ. Odată cu evoluția formelor de viață a apărut necesitatea elaborării altor tipuri de SOD conținând Fe, Cu sau Zn. Elementul senzațional al SOD este dat în primul rând de substratul acestei enzime, O2¯, un radical liber ce nu poate fi păstrat sau comercializat ca în cazul tuturor enzimelor cunoscute.

Reacția catalizată de SOD are forma:

2O·2+2H+ SOD O2+H2O2 (1)

Cercetările cristalografice cu raze X pe Cu –Zn au arătat existența a două substanțe polipeptidice, fiecare având o structură β de-a lungul unui cilindru și având legate covalent prin interacțiuni hidrofobe.

Atomii metalici sunt legați puternic prin atomii de N ai ciclului imidazol derivat din histidină în pozițiile 44, 46, 61, și 118 (Cu) și cele 61,68,78 și aspartat 81 (Zn)de lanțurile polipeptidice

Tabelul 2.1 Câteva caracteristici structurale ale superoxidului dismutazei

În general, SOD acționează independent de PH, în domeniu 5-9. Această enzimă rezistă surprinzător la variații de căldură sau agenți chiotropici (8 M uree, 4% Na, dodecil sulfat). Pe când Fe – SOD se găsește mai ales la organisme inferioare, cele superioare conținând Cu –Zn în citoplasmă, iar Mn – SOD în mitocondrii.

SOD este o enzimă inductibilă în sensul accelerării biosintezei ei în prezența unor concentrații crescute de O2, demonstrat la bacterii ca Streptococcus, E.coli, Saccharomyces cerevisiae sau chiar la mamifere. Lucrările recente (O. I. Aruoma, 1991; C. C. Wynterbourn, 1988) au arătat că in vitro, Cu-Zn SOD acționează paradoxal în cazul unui stres oxidativ al unei suspensii de hematii, în prezența unor compuși oxidativi ca fenilhidrazină, nitriți, polifenoli. Acești compuși acționează asupra hemogoblinei (Hb) conform reacțiilor:

HbO2 OXIDANT metHb + O·¯2 (2)

HbO2+O·¯2→ met Hb + H2O2 (3)

Dacă luăm în considerare și reacția (1) catalizată de SOD, devine evident că in vitro SOD nu protejează hematiilor de prezența oxidanților, ci din contra accelerează producerea methemogoblinei.

Importanța acestor cercetări constă în demonstrarea producerii H2O2 prin stresul oxidativ și necesitatea cuplării SOD cu catalaza, enzimă ce descompune H2O2. Acest tandem de enzime acționează și in vivo, ambele enzime caracterizându-se prin viteze mari de reacție.

Prezența celor două enzime este legată direct de implicarea relației:

O·2 + H2O2 →OH· + OH¯ +O2 (4)

SOD acționează nu numai prin descompunerea excesului de O¯, dar poate inhiba 1O2 și indirect peroxidarea AGPN, protejând față de ozon ( M. Sies, M. E. Murphy, 1991)

Reglarea biosintezei SOD este intens studiată. Astfel, recent H. M. Hassan (1984) a arătat că a izolat genele care controlează biosinteza Cu – Zn – SOD la bacterii, studiind efectul stimulator al oxidanților ce produc O2¯.

Transferarea genei SOD umane la mutanți E.coli a permis creșterea rezistenței bacteriilor la O2. Dar cele mai interesante experimente s-au efectuat pe Cu –SOD. Viteza biosintezei acestui tip de SOD este proporțională cu cea a creșterii și a respirației. Mai mult, H. M. Hassan a demonstrat influența Fe asupra biosintezei Mn – SOD astfel că Fe+2 are efect regulator represiv asupra inducției declanșată prin adăugarea erbicidului (compuși redox) la o suspensie de E. coli.

Prin acțiunea reglatoare a ionilor Fe+2 asupra biosintezei Mn – SOD, se explică de ce chelazorii specifici acestui metal ( dipiridil, fenontrolina )cresc biosinteza enzimei de 3 -7. probabil că medicamentul românesc Rodimelid ce conține EDTA și cisteină acționează asemănător.

o

SOD [NUME_REDACTAT]

Cu-Cu oxidaza [NUME_REDACTAT] proteine

[NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]

Primordiala respiratorii [NUME_REDACTAT].2.2 Reglarea biosintezei SODde către substrat (O2)(A) cât și variația sistemului AO în cursul evoluției (B)

A-gena reglatoare, P-promotor, O-gena operator, GS- gena structurală, RP- receptor activat după [NUME_REDACTAT] 2.2 Boli în care scade activitatea SOD în sânge

Datele din acest tabel relevă mai multe informații. În primul rând, scăderea SOD este foarte variată, de la valori normale până la activități reduse. În al doilea rând, 98% din activitatea SOD din sânge se găsește în hematii, unde pot fi întâlnite valori normale, dar în schimb, enzima să fie scăzută, în anumite focare cum sunt: inflamații, tumori, cataracte și în ischemiile unor organe mari(inima, creier). Mai nou se încearcă introducerea SOD purificată în tratamentul unor boli. Încă de acum 6-8 ani în urmă s-au comercializat medicamente conținând SOD purificat, cum sunt: Orgotein (SUA), Peroxinorom (Germania), Epurox (România) sau preparate nutritive de tip Barley-green essentials. Pe baza celor menționate mai sus se poate spune că SOD este principalul agent antiinflamator natural. În tratamentul unor boli cu SOD se pune problema legată de administrare, deoarece SOD este o proteină metabolizată(t½=2 ore în sânge după administrare s.c ori i.m )are o penetrabilitate scăzută fiind necesară transportarea ei spre focar (ținta). Din acest motiv s-a încercat încapsularea ei in lipozomi sau recent legarea cu polietilenglicol (O.I.Aruoma,1991). Principalele efecte interesante observate în utilizarea SODau fost protejarea limfocitelor de producerea unor sciziuni cromozomale, micșorarea chemotoxismului LPMN dependentă de O2¯, reducerea simptomelor gastrointestinale.

În tabelul 2.2 nu au fost incluse unele boli congenitale, foarte rare, de obicei fatale chiar din prima decadă a vieții. Astfel de boli au un caracter autosomal recesiv , cum sunt lipofuscinoza ceroidă neuronală, anemia Franconi, distrofia Duchenne, fibroza cistică etc.

2.2.2 CATALAZA

Această enzimă este de asemenea prezentă în toate celulele aerobe, fiind mai ales localizată în mitocondrii și peroxizomi. Catalaza descompune H2O2 extraordinar de eficient (K=10-1M-1s-1)acționând:

– fie catalazic:

H2O2+H2O2→O2+2H2O (5)

– fie oxidazic:

H2O2+R—CH2OH→2H2O+R—CHO (6)

Cantitatea mare de catalază din hematii și ficat justifică implicarea ei în procese unde se produc cantități mari de H2O2. Formarea H2O2este atât de riguros controlată în organisme, încât pentru descompunerea acesteia acționează trei enzime:catalaza, GSH peroxidaza și peroxidazele, toate având o foarte mare viteză de reacție (R. Olinescu, 1982). Așa se explică de ce în deficite congenitale ale biosintezei unuia dintre ele, persoanele respective nu au prea mult de suferit. Acest deficit devine decelabil chimic în condiții de stres oxidativ, infecții, când se produc afte sau ulcerații în cavitatea bucală din cauza dezvoltării unor bacterii ce secretă mult H2O2, astfel ca capacitatea AO enzimatică este depășită.

2.2.3 GLUTATION PEROXIDAZA

GSH peroxidaza catalizează reacția (7) în care R – OOH

R – OOH + 2GSH→ R – OH + GSSG (7)

Pot fi H2O2 și orice tip de peroxizi organici ( ai purinelor, AGPN, steroizi) în, schimb specificacitatea pentru GSH este foarte mare. GSH peroxidaza acționează strâns legat de procesele metabolice dependente de glicoliza. Acumularea formei oxidate a glutationului, GSSG, format atât di acțiunea GSH peroxidazei sau neenzimaticpare să fie un indice al stresului oxidativla nivel celular ( J. D. Adams, 1985) cu atât mai mult cu cât R. Olinescu (1982) și alți cercetători au observat inhibarea activității catalazei de către GSH. În acest context, schemele din fig. 3.3 ilustrează competiția dintre cele trei enzime pentru neutralizarea excesului de H2O2 și alți peroxizi, având posibilitatea sistemelor feed-back asemănătoare celor cibernetice, să acționeze reglator eficient.

Intracelular , catalaza este localizată în mitocondrii și peroxizi în tandem cu GSH peroxidaza, pe când, în citoplasmă, GSH peroxidaza este cuplată cu SOD. În acest fel prin cuplajul a două enzime și a unor AO neenzimatici se asigură atât protecția structurilor subcelulare și reglarea activității O2, evitându-se formarea radicalului OH*.

Localizarea GSH peroxidazei în membranele mitocondriale pare să asigure de asemenea o protecție față de acțiunea pro-oxidantă a GSH. Acest reducător, în mod paradoxal în concentrații mici, determină producerea de O2¯ și peroxizi urmate de umflarea mitocondriilor și eliberarea GSH peroxidazei din membrane (H. Esterbauer, 1982; H. Sies, 1985).

2.2.4 GLUTATION TRANSFERAZA

Pe lângă GSH peroxidaza ce nu conține Se și care posedă și activitate transferazică, s-a mai izolat și situat o grupă de enzime denumite GSH-S-transferaze , care catalizează conjugarea GSH cu o mare varietate de compuși organici electrofili, inițiind formarea acizilor nercopturici, o formă importantă a detoxifierii în organism.

În ficat, GSH-S-transferaza formează 5-10% din proteinele solubile citoplasmatice iar în rinichi și mucoasa intestinală această enzimă reprezintă aproximativ 2% din proteinele solubile.

GSH-S-transferaza are o masă moleculară de aproximativ 40.000, cunoscându-se cel puțin 5 izomeri. Diverse experimente au evidențiat că ficatul, suprarenala, testiculele și ovarul sunt organele cu activitatea cea mai mare dar și cea mai variată la diferite substanțe.

După cum s-a arătat în figurile capitolelor anterioare, aldehidele reprezintă compuși finali ai evoluției RL și peroxizilor din organism. Acești compuși foarte reactivi sunt descompuși de aldehide oxido-reductaza sau de GSH-S-transferaza conform reacției:

GSH+R–CH=CH–COR GSH-T R–CH(SG)–CH2-COR (8)

Aceste aldehide, α, β nesaturate de tipul acroleinei și metil vinilcetona sunt extrem de reactive, produc inhibarea sintezelor acizilor nucleici și a proteinelor, a glicozei și a respirației mitocondriale, având în acest sens activitate antivirală, anti-microbiană și anti-canceroasă.

2.3 ANTIOXIDANȚI NEENZIMATICI

Antioxidanții neenzimatici cuprind un număr foarte mare de substanțe. În unele cazuri, anumiți AO de referință, ca GSH, ascorbatul sau vitamina E în anumite condiții pot reacționa ca pro-oxidanți.

2.3.1 GLUTATIONUL

Acest tripeptid (L-γ-glutamil-L-cisteinil-glicocol) este principalul AO neenzimatic, fiind și forma de transport al grupărilor sulfhidril (-SH) libere. Sub forma redusă GSH, acest tripeptid este implicat în foarte multe reacții și procese în mare parte încă necunoscute. Includerea grupării –SH în centrul activ al multor enzime din vecinătatea acestuia sau ca reziduu al cisteinei în structura tridimensională proteică conferă acestuia o poziție unică în reacțiile biochimice. În acest sens, nu este de mirare că RL, prin reactivitatea lor mare vor ataca grupările SH libere din vecinătatea lor. Spre deosebire de grupările SH aparținând unor enzime, care sunt protejate oarecum de lanțul polipeptidic, cele care fac parte din structura GSH sau a cisteinei vor constitui prima “țintă” a RL. Așa încât, prin modificarea reacției de bază a glutationului:

2GSH + 2R→ GSSG + 2RH (9)

RL vor acționa direct sau indirect asupra multor procese metabolice.

Fig.2.3 Glutationul, biosinteza și principalele funcții și conexiuni metabolice

γ-glutamil transpeptidoza este localizată în membrane și catalizează transportul jumătății γ-glutamil spre aminoacizi, formând γ-glutamil-aminoacizi, care sunt transfocați prin membrane în celulă. Această enzimă este foarte răspândită în organisme, fiind localizată la mamifere mai ales în mucoasa intestinală, tubii contorti renali, celule epiteliale și reticulul endoplasmatic. Rinichiul este principalul organ cu reglare al nivelului GSH plasmatic datorită marii cantități de γ-glutamil. Diferite comunicări mai vechi, au susținut existența unei GSH oxidaze (cistein oxidaze) care s-a dovedit să fie tot o funcție a γ-glutamil, conform reacțiilor următoare:

GSH + Cisteinilglicocol +O2 γ-GT Cistinilbis – glicocol GSH + Cistinilbis – glicocol → GSSG

Glutationul reacționează enzimatic sau neenzimatic atât cu o gamă de compuși organici, cât și cu derivații lor ( RL, explozivi, peroxizi). Studiile de hepato-toxicitate au arătat că instalarea leziunilor nefrotice, a infiltrării grave hepatice sunt precedate de scăderea dramatică a concentrației GSH din ficat. Aceste leziuni sunt prevenite prin administrarea unor compuși care donează grupări SH in vivo așa cum sunt: cisteina, metionina, cistamina.

2.3.2 VITAMINA E (α –TOCOFEROL)

Dacă GSH este principalul AO neenzimatic hidrosolubil, vitamina E trebuie admisă ca cel mai important AO liposolubil, al cărui rol de bază este păstrarea integrității membranelor. Disputa asupra rolului vitaminei E se datorează demonstrării evidente a capacității mari AO în experimentele in vitro, utilizând celule omoge sau izolate (hematii sau hepatocite) și lipsa unor dovezi privitor la scăderea concentrației fiziologice în diferite boli. În acest sens citam boala lui Batten (hipofuscinoza ceroidă neurală) caracterizată printr-o deficiență mintală progresivă datorită unor leziuni cerebrale și depuneri masive de pigmenți lipofuscfinici , despre care s-au admis creșteri ale tocoferolului.

Așa cum s-a admis la cele două conferințe organizate de Academia de Medicină din SUA (1972-1982) asupra acestui subiect, în cazurile de deficit în vitamina E (cu foarte mari variații individuale) se constata o sensibilitate la hemoliza, stres oxidativ medicamentos sau toxic. Aceasta sensibilitate crescută a fost demonstrată la animale de experiență, cât și la copii prematuri, în special față de O2 hiperbaric sau ozon (M. J. Green, H. A. Hill, 1984). La copiii prematuri, administrarea vitaminei E (25 mg/kg i.m.) micșorează substanțial icterul și hemoliza și previne complicațiile pulmonare (displazie bronhopulmonară).

Tabelul 2.3 Conținutul în vitamina E (tocoferol) al unor produse alimentare de origine vegetală

*DV=[NUME_REDACTAT] (valoarea zilnică). Valorile zilnice sunt numere de referință stabilite de [NUME_REDACTAT] (FDA) în scopul de a ajuta consumatorii cu privire la conținutul nutritiv al alimentelor pe care le consumă. Valoarea zilnică pentru vitamina Eeste de 30 UI (20 ehivalenți alfa-tocoferol).

2.3.3 ACIDUL ASCORBIC ( VITAMINA C )

Acidul ascorbic este considerat o vitamină cu rol antiinfecțios, de toxifiant și anti oxidant. Vitamina C are numeroase implicații, și anume:

a) rolul antiinfecțios se bazează pe efectele modulare ale acidului ascorbic (AA) în imunitatea celulară, prin stimularea fatocitozei LPNM și a transformării blastice a limfocitelor. Ingerarea a 1-3 gr de ascorbat pe zi determină creșterea mutilității LPNM și a sensibilității limfocitelor la mitogemii. Deci, efectulasupra imunității de tip celular depinde de nivelulplasmatic al vitaminei. Nu trebuie uitat faptul că administrarea unor concentrații mari de AA produce leziuni gastrice;

b) rolul detoxifiant se bazează pe numeroase lucrări asupra accelerării metabolizării substanțelor xenobiotice de către sistemul hidroxilant microzomial din ficat (dar și din alte organe).

2.3.4 SELENIUL

Seleniul este o substanță cu calități AO și mai ales calități protectoare. Această substanță are o activitate vastă, și anume poate acționa prin GSH peroxidaza dar și independent sau în asociație cu vitamina E. implicarea Se în detoxifiere presupune legături atât cu biosinteza citocromului P-450, ca și componentă a GSH peroxidazei, dar și ca agent reglator al metabolismului grupărilor SH. Micșorarea toxicității Se are loc fie prin conjugare cu GSH sau prin legare cu proteine sau aminoacizi. Se în organism exercită efecte benefice într-o zonă de concentrație foarte redusă (0,5-3,5 mg/kg), astfel că la extreme predomină aspectele deficitare sau toxice. Se are efect și asupra imunității de tip celular și umoral. Astfel, în stări deficitare se produce o imunosupresie, cu afectarea calitativă a neurofilelor, proliferarea limfocitelor B si T, producerea de anticorpi și de limfochine. Aceste modificări imunologice complexe dispar prin suplimentarea cu săruri de Se.

2.4 ANTIOXIDANȚI VEGETALI

Dintre antioxidanții vegetali cu utilizare terapeutică polifenolii, fenolii și flavonoizii formează o grupă foarte mare ce posedă atât proprietăți pro-oxidante cât și antioxidante. Dintre aceste substanțe, flavonoizii constituie grupa cea mai promițătoare și interesantă. Flavonoizii produși de diverse plante, constituie o grupă eterogenă având ca proprietăți următoarele:

capacitate antioxidantă;

potențează și protejează acidul ascorbic;

stimulează și protejează colagenul de oxidare degradativă;

inhibă fosfodiesterazele dependente de nucleotide ciclice;

inhibă activarea hidrocarburilor cancerigene;

stimulează epurarea amoniacului la pacienții uremici.

2.4.1 Produse vegetale cu compuși polifenolici

ANGHINAREA

(Cynara scolymus)

(engl. ARTICHOKE)

Anghinarea este o plantă ca un ciulin sălbatic, și de la ea se folosește mai ales floarea. Anghinarea încurajează progresul personal și te protejează de energiile elementale negative. În trecut se credea ca rădăcinile de anghinare au un efect de stimulare sexuală, astfel că femeile tinere erau prevenite să nu le mănânce, ca să nu cadă pradă tentației.

Anghinare – [NUME_REDACTAT]

Cynara scolymus L. (Anghinare )

[NUME_REDACTAT]

Materia primă:

[NUME_REDACTAT] -frunze mari 1-2 penat partite aproape glabre pe fața superioară, tomentos păroase pe fața inferioară, cu lobi neregulat rotunjiți sau ascuțiți, cu sau fără spini. De culoare verde sau verde-albicioasă pe fața superioară și alb-cenușie pe fața inferioară. Fără miros specific cu gust foarte amar.

Acțiune farmacologică:

– frunzele de anghinare conțin cinarină și acid clorogenic, ce stimulează formarea și eliminarea bilei, aceste proprietăți coleretice și colecistokinetice fiind utile în cazul unui tranzit lent. De asemenea totalul principiilor active din frunze determină o foarte bună protecție hepatocelulară.

Indicații:

– colecistite, ciroze hepatice (alcoolică, toxică), convalescență, hepatită cronică, hepatită virală acută.

Compoziția chimică:

– frunzele conțin 0,2-0,3% cinarină, acid clorogenic, polifenoli, flavonozide ( cinarozidă și scolimozidă, luteolin 7- glucozida, luteolin 7- rutozida ), un principiu amar- cinaropicrina, mucilagii, tanoizi, peptine, zaharuri, acid malic, acid lactic, derivați triterpenici, săruri de potasiu și magneziu.

Acțiune farmacodinamică:

– utilizări terapeutice:

-coleretic, hepato -protector, stimulent al metabolizarii colesterolului în ficat, depurativ, contribuie la eliminarea acidului uric, crește funcția antitoxică a ficatului, diuretic și tonic amar.

2.4.2 Produse vegetale în vitamina C

[NUME_REDACTAT] rhamnoides

Fam. [NUME_REDACTAT] și răspândire:

Arbuști spinoși ce cresc în pâlcuri sau tufișuri pe malurile râurilor, în regiunile mlăștinoase pe nisipuri și pietrișuri, mai ales pe formațiunile geologice salinifere.

Pe malul râurilor, în prundișuri, coaste râpoase, crește cătina, numită în unele regiuni și cătina albă.

De la această plantă se folosesc fructele – fructus hippophae – în stare proaspăta sau uscată. Gustul lor este acru – astringet, însa pe măsura coacerii și mai ales după căderea primelor brume devine mai plăcut și capătă un miros asemănător ananasului.

În compoziția chimică a fructelor de cătina predomină vitamina C cu o serie de pigmenți carotinoidici care le dau culoarea portocalie, un ulei gras în care sunt dizolvați acești pigmenți, vitaminele B1 si B2, acid folic, acizi grași și fitosteroli, inozitoli și acid nicotinic, ulei volatil etc. Datorită acestei compoziții chimice complexe, fructele de cătină sunt considerate ca o polivitamină naturală. Ele sunt folosite în multe țări în scopuri terapeutice și alimentare.

Sub formă de suc, gem, marmelada, sirop, vin, lichior etc., ele constituie un aliment accesibil tuturor.

Din fructe de cătină uscate se fac ceaiuri plăcute la gust care se folosesc în avitaminoze. În unele țări ceaiul de cătină se recomandă în diaree, reumatism, în unele boli de piele, urticarie. Decocția de semințe este folosită ca purgativ.

Perioada de recoltare:

– se recoltează fructele cătinei în decursul lunilor august-septembrie.Se recomandă a fi recoltate până la lăsarea primului ger, după care conținutul în vitamina C scade brusc.

Boli în care se utilizeaza:

Uz intern:

– hepatita cronică, urticarie, nevroze, alcoolism, gută, reumatism, ciroză hepatică,ateroscleroză, anemie.

Uz extern:

– la arsuri, degerături, radiații.

Cătina albă – Hippophae rhamnoides – a fost introdusă recent în cultură, una din cele mai mari plantații din țară găsindu-se în apropierea Bacăului. Este un arbust fructifer cunoscut ca făcând parte din flora spontană a României, care se utilizează deopotrivă în industria alimentară, în silvicultură, în farmacie dar și ca plantă ornamentală.

Fructul de cătină conține de doua ori mai multă vitamina C decât măceșul și de 10 ori mai mult decât citricele. În fructele coapte conținutul depășește 400-800 mg la 100 g suc proaspăt. Alte vitamine prezente în fruct sunt A, B1, B2, B6, B9, E, K, P, F. Mai regăsim celuloza, betacaroten (într-un procent net superior celui din pulpa de morcov), microelemente ca fosfor, calciu, magneziu, potasiu, fier și sodiu, uleiuri complexe, etc. Efectele benefice ale acestei plante sunt cunoscute încă din antichitate. [NUME_REDACTAT] de exemplu, medicina tradițională o recomandă în tratamentul bolilor digestive. Pe continentul european, exista însemnări privind importanța cătinei rămase de la Dioscorid și Teophast. În prezent, de la cătină se obțin următoarele produse: ceaiuri din fructe, muguri, frunze și chiar scoarță, siropuri de fructe, ulei de fructe. Acesta din urmă este și cel mai valoros din punct de vedere medical.

Uleiul de cătina este utilizat în tratamentul unor afecțiuni precum: ulcerul gastric și duodenal, alergiile, diareea, urticaria, reumatismul, afecțiunile neuroendocrinologice, circulatorii, hepatice. Are o acțiune reconfortantă, chiar cu efecte ușor narcotice. De asemenea se mai foloseste în alcoolism, anemii, astenie și stres. Se utilizeaza și în geriatrie cu rezultate spectaculoase. Cu cătina se mai tratează afecțiunile oftalmologice, coronariene, hipertensiunea arterială și gingivitele. Prin prelucrări în laboratoarele farmaceutice din cătină se obțin tratamente extraordinare pentru tratarea: depresiilor, bolii Parkinson, tumorilor, adenoamelor și leucemiei. Mugurii de cătină au efect afrodisiac.

Cătina este și un foarte bun antiinflamator și inhibă pofta de mâncare în cazul unor tratamente ale obezității.

ULEI DE CĂTINĂ

Flacoane cu 10 ml; 20 ml ; ±3%, 100ml; 500 ml; ±2% sau capsule cu 0,4 sau 0,6 ml ulei din fructe de cătină ale cărui principii active sunt extrase printr-un procedeu original constituind un concentrat natural alimentar. Compușii liposolubili din uleiul de cătină reprezintă un complex polivitaminic cu acțiune regeneratoare asupra metabolismului celular.

Principiile active conținute sunt, în principal ß- caroteni, vitaminele D, E, F, K, deci toate vitaminele liposolubile, dar și o serie de produși polifenolici cu activitate puternic antiinflamatoare. De asemenea conține lecitine sub formă ușor asimilabilă ( săruri de calciu și magneziu), acizi grași nesaturați din care se remarca acidul ß – linolic ca precursor al multor enzime organice.

ACȚIUNE:

– tonifiant general, antianemic, vitaminizant;

– imunomodulator;

– are acțiune sinergică cu interferonul ; și în special contribuie la sinteza proteinelor – materie primă pentru interferoni;

– protector coronarian;

– antiaterosclerotic;

– încetinește procesul de îmbătrânire prin consumarea radicalilor liberi nedoriți;

– îmbunătățește funcția de detoxifiere a ficatului și asigură troficitatea celulei hepatice;

– prin conținutul mare în ß- caroten, previne apariția cancerului;

– în administrarea externă, este un bun cicatrizant, având un remarcabil efect dermoregenerator, antiinflamator, nutritiv;

– este un excelent protector împotriva radiațiilor solare sau de altă natură.

Uz cosmetic:

este folosit la prepararea cremelor antirid și nutritive, a gelurilor și loțiunilor de protecție și întreținere pentru toate tipurile de ten.

PRECAUȚII

Nu exista date în literatură referitoare la siguranța administrării în sarcină și lactație.

Acțiune farmacologică:

Cătina conține un complex de principii biologic active cu efecte terapeutice dovedite. Astfel, vitamina C are acțiune antiscorbutică, intervine favorabil în respirația tisulară, în buna funcționare a glandelor cu secreție internă, în procesul de eliminare a toxinelor complexul de vitamine B, care intervine în procesele metabolice (B1 în reglarea metabolismului glucidic, B2 în metabolismul proteic, B6 în troficitatea celulei nervoase și a pielii) β – caroten cu rol important în integritatea structurală și funcționala a celulelor epiteliale, vitamina E cu rol de antioxidant, prin captarea speciilor reactive ale oxigenului. De asemenea fructele de cătina conțin acizi grași nesaturați (linoleic si linolenic) cu rol trofic.

Ca tratament al unor boli – sucul de cătină, mai ales atunci când este asociat cu o alimentație lacto-vegetariană, este un elixir regenerant și detoxifiant foarte puternic, cura cu el dând rezultate de excepție în bolile grave. Este indicat în: – boli ale sistemului respirator (bronsita cronica, astm);

– stări depresive;

– cancer cu diverse localizări;

– infecții virale.

PARTEA II

CONTRIBUȚII PERSONALE

SCOPUL ȘI OBIECTIVELE LUCRĂRII

Prezenta lucrare încearcă să elucideze din punct de vedere biochimic mecanismele de producere ale stresului oxidativ și implicațiile biochimice ale acestuia. În acest sens sunt evidențiați, mai întâi, factorii generatori de stres oxidativ, radicalii liberi, punându-se accent pe radicalii liberi ai oxigenului: oxigenul singlet, superoxidul, peroxidul de hidrogen, radicalii oxidril, peroxizii.

Este evidențiat de asemenea, efectul stresului oxidativ asupra hematiilor, ficatului și asupra membranei celulare.

Lucrarea abordează și antioxidanții enzimatici și neenzimatici, care grație structurii chimice prezintă caracter redox, care le facilitează acțiunea de anihilare a radicalilor liberi.

Din punct de vedere experimental prezenta lucrare încearcă să surprindă impactul dintre organismul viu și o clasă de nutrimente cu potențial crescut de producere a stresului oxidativ, și anume: lipidele.

Pentru o realizare eficientă și veridică a stresului oxidativ, lucrarea urmărește studierea mai multor eșantioane de lipide cărora li se determină indicele de peroxid, indice fidel al gradului de perisabilitate și peroxidare al acestora.

Stabilirea probei cu indicele de peroxidare ridicat, constituie un obiectiv prioritar pentru producerea stresului oxidativ.

Scopul principal al lucrării îl constituie aprecierea intensității stresului oxidativ apărut în urma administrării, la animale, a uleiului de floarea soarelui cu indice de peroxidare ce depășește mult valoarea indicată de [NUME_REDACTAT] X.

Aprecierea intensității stresului oxidativ se face prin prisma unor parametri biochimici enzimatici: catalaza și superoxid dismutaza.

CAPITOLUL 3

DETERMINAREA INDICELUI PEROXIDIC

3.1 METODE ȘI TEHNICI DE LUCRU

Indicele de peroxidare (Ip) este utilizat pentru a aprecia perisabilitatea lipidelor, mai exact pentru a evalua gradul de râncezire al lipidelor. Indicele de peroxidare este definit ca fiind numărul de tiosulfat de sodiu 0,01 M/l oxidat de iodul eliberat din acidul iodhidric prin acțiunea peroxizilor aflați în 1 g lipidă.

Principiul metodei

Lipida de analizat dizolvată într-un solvent adecvat (de obicei, cloroform) se tratează cu iodură de potasiu, care este oxidată la iod elementar de peroxizii prezenți în grăsimea analizată. Iodul analizat se titrează în prezența amidonului drept indicator cu soluție molară de tiosulfat de sodiu până la viraj de la albastru la incolor.

Tehnica de lucru

5g probă de analizat, cântărite cu exactitate la balanță analitică se dizolvă prin agitare continuă sau prin încălzire în solventul de dizolvare (amestec de acid acetic și cloroform) într-un flacon iodometric (flacon prevăzut cu dop rodat). După dizolvarea completă, conținutul flaconului se răcește. Se adaugă soluție proaspătă de iodură de potasiu 1:1 și se agită puternic timp de 1-2 minute. Se diluează cu 30 ml. apă distilată, după care se tritează cu soluție de tiosulfat de sodiu 0,01 M, până la colorația galben-pai. Se adaugă 2 ml. soluție 1% de amidon, care are rol de indicator de culoare, datorită proprietății acestuia de a reacționa cu iodul pentru a forma un complex de incluziune de culoare albastră-întunecată. Indicatorul nu se adaugă la începutul titrării, deoarece stabilitatea complexului amidon-iod este ridicată, iar deplasarea iodului din acest complex ar fi greoaie, necesitând un volum mai mare de tiosulfat decât cel real. În felul acesta s-ar obține un rezultat eronat.

După adăugarea indicatorului, adăugare însoțită de apariția colorației albastre, se continuă titrarea cu soluția de tiosulfat până la viraj de la albastru la incolor. Se notează cu V2 volumul de tiosulfat 0,01 M folosit la titrarea probei. În paralel se lucrează o probă-martor, care se obține respectând aceeași tehnică, aceleași volume de reactivi, doar că se exclud cele 5 g. din proba de analizat.

Indicele de peroxid se calculează după formula:

Ip = 10(V2 − V1)

în care: m

Ip = indice de peroxid

V1 = volumul de tiosulfat de sodiu 0,01 M utilizat la titrarea probei-martor (mililitri)

V2 = volumul de tiosulfat de sodiu 0,01 M folosit la titrarea probei de analizat (mililitri)

M = masa probei de lipidă luată în lucru (grame)

Reactivi necesari

• Solvent de dizolvare

Se prepară după următoarea formulă:

Cloroform………………..12 ml

Acid acetic (R)……………18 ml

• Soluție de tiosulfat de sodiu (Na2S2O3) 0,01 M

Se prepară respectând următoarele proporții:

Tiosulfat de sodiu………..1,582 g

Apă distilată……………..1000 ml

• Soluție iodură de potasiu 1:1

Această soluție se prepară în momentul utilizării, prin dizolvarea iodurii de potasiu în apă distilată după formula:

Iodură de potasiu…………….10 g

Apă distilată………………….10 g

• Soluție de amidon

Se respectă proporțiile:

Amidon……………………..1 g

Apă distilată…………………100 ml

Amidonul se titrează la mojar cu 5 ml apă până se obține un amestec omogen. Amestecul astfel obținut se toarnă încet și sub agitare continuă în 100 ml apă la fierbere. Se lasă să fiarbă până la obținerea unui lichid transparent sau ușor opalescent.

3.2 REZULTATE EXPERIMENTALE ȘI DISCUȚII

În scopul găsirii unui eșantion de lipidă cu un indice peroxidic cât mai ridicat valoric, în vederea provocării stresului, s-au luat în lucru 7 probe de ulei cărora li s-a determinat parametrul cerut după tehnica descrisă.

Natura probelor luate în lucru, proveniența lor și data procurării, sunt redate în tabelul următor.

Tabelul 3.1 Proveniența probelor de lipide cărora li s-a determinat [NUME_REDACTAT] masa de 1g ca probă medie, s-a determinat titrimetric volumul de tiosulfat de sodiu 0,01M folosit pentru titrarea probei de analizat (V2) și volumul de tiosulfat de sodiu 0,01 M folosit pentru titrarea probei martor (V1).

Tabelul 3.2 Valoarea indicelui peroxidic pentru probele cercetate

Fig3.1 Valoarea indicelui peroxidic a probelor de analizat

Studiind valorile indicelui de peroxid din tabelul de mai sus, constatăm că toate eșantioanele de ulei de floarea soarelui ([NUME_REDACTAT])prezintă valori ale acestui parametru peste limita recomandată de [NUME_REDACTAT], ediția a x-a (cel mult 10).

Extremele sunt înregistrate de proba P1, ce reprezintă un sortiment de ulei de floarea soarelui “Bunica”, care are valoarea cea mai scăzută Ip=11 și proba P4, eșantion reprezentând un ulei produs de “Unirea S.A. Iași ”, al cărui indice de peroxid este cel mai crescut Ip=120. Existența acestei valori ce se situează cu mult deasupra limitei normale este justificată pe de o parte de faptul că termenul de garanție este depășit cu 14 luni, iar pe de altă parte de păstrarea sa la temperatura laboratorului, unde variațiile de temperatură oscilează între 10-35°C.

În mod surprinzător nici probele de axungia, lanolină și cetaceu nu corespund [NUME_REDACTAT],deși servesc ca baze de unguent, ceea ce impune existența unor valori foarte scăzute ale acestui indice, cu atât mai mult cu cât acestea nu prezintă termen expirat. Pentru experimentul pe animale, în vederea inducerii stresului oxidativ s-a ales proba P4, proba de ulei de floarea soarelui a cărui indice de peroxid are valoarea 120.

CAPITOLUL 4

DETERMINAREA UNOR PARAMETRI

AI STRESULUI OXIDATIV

4.1. MODELUL EXPERIMENTAL

Experimentul a avut ca obiectiv evaluarea antioxidanților de tip nevitaminic și a cuprins 5 loturi de șobolani albi, linia Wistar ( Ratus norvegicus) în vârsta de 6 săptămani cu o masă ponderală medie de 143,55. primul lot a constituit lotul de referință și a fost alcatuit din 3 animale.

Cel de-al doilea lot alcatuit din 5 animale a constituit lotul pe care s-a experimentat producerea stresului oxidativ (lot control 1). În acest scop animalele au fost tratate cu ulei de floarea soarelui ( [NUME_REDACTAT]) cu indice peroxidic ridicat ( Ip=120), proba de ulei fiind selectata din experimentul anterior. Uleiul cu un grad ridicat de oxidare a fost administrat per os, prin ingerare, fiind înglobat în hrană în proporție de 10 g ulei/1000 g nutret.

Cel de-al treilea lot, constituit din 5 șolbolani a fost tratat cu o doză identică de ulei de floarea soarelui 10 ppm și 10 ppm glutation ca antioxidant (lot control 2).

Al patrulea lot (lot experimental 1) alcătuit din 5 șobolani, a primit concomitent doza de ulei peroxidat ca inductor al stresului oxidativ și soluție extractivă apoasă 5% de anghinare (Cynara scolymus) ( Fig. 4.1.).

Fig.4.1 Cynara scolymus

Solutia extractivă apoasă a fost preparata în conformitate cu monografia prevazută de [NUME_REDACTAT], ediția a X (FR X, 1993). Aceasta a fost administrată animalelor în apa de băut.

Ultimul lot ( lot exparimental 2) a primit pe lângă doza de inductor de stres oxidativ (10 ppm ulei de floarea soarelui cu Ip=120) soluție extractivă apoasă 5% de Hippophae fructus, ad libitum în apa de băut Hippophae rhamnoides ( cătina albă) (Fig. 4.2.) .

Fig.4.2 Hippophae rhamnoids

Proprietătile antioxidante sunt imprimate de concentrațiile semnificative de acid ascorbic (600 mg%), flavonoide și carotenoide ( β-caroten, 0,6-10,9 mg%) (Prisăcaru 2002, PrisĂcaru 2005).

Durata experimentului a fost de 4 săptămani, la finalul experimentului prlevându-se sânge pentru investigațiile biochimice necesare aprecierii stresului oxidativ și a efectului protector oferit de glutation.

Ca parametrii biochimici care să furnizeze informații despre intensitatea stresuluii oxidativ, s-au ales catalaza și superoxid dismutaza.

Tabelul 4.1 Modelul experimental

4.2 DETERMINAREA ACTIVITĂȚII CATALAZEI

Catalaza este o enzimă heminică ce face parte din clasa oxidoreductazelor, subclasa hidroperoxidaze, având structură și activitate similară cu peroxidazei. Are ca substrat peroxidul de hidrogen pe care îl descompune cu eliberare de O2 conform recției:

H2O2+H2O2→ H2O+O2

Enzima este localizată în peroxizomii hepatici, mari generatori de H2O2 și în alte țesuturi bogate în dehidrogenaze aerobe: eritrocite, rinichi, măduva osoasă.

Catalaza este o enzimă foarte activă, posedând un înalt grad de specificitate, descompunând la 0°C timp de 1 minut 2 600 000 moli de peroxid de hidrogen.

Deci atribuțiile catalazei se rezumă la două aspecte:

rol detoxifiant: prin descompunerea H2O2 format în celule, sub acțiunea dehidrogenazelor aerobe, protejează celulele de nocivitatea acestui deșeu metabolic ce manifestă un puternic caracter oxidant;

rol de donor de oxigen: în urma reacției de degradare a peroxidului de hidrogen se formează oxigen molecular care a fost folosit pentru oxigenarea țesuturilor.

Valoarea diagnostică

În condiții fiziologice normale, cifra catalazei variază între 12-20.

Creșterea activității catalazei apare în pancreatitele acute, valoarea maximă fiind atinsă după cea a α-amilazei și a lipazei și revine la normal mai repede decât lipaza, dar mai târziu decât α-amilaza.

Activitatea catalazică este scăzută în cancer, ulcerații ale cavității bucale, cașexie, în general în toate maladiile generatoare de stres oxidativ.

S-a constatat existența rară a catalazei la diferite populații, descriindu-se două variante:

varianta japoneză, care prezintă activitate foarte scăzută în eritrocite (0-32% din normal ), însoțită de modificări oxidative accentuate;

varianta suedeză, cu activitate eritrocitară foarte mică (0,5-2% din normal),care nu prezintă semnificație clinică (Filip, 1993).

În industria laptelui, catalaza este indicator al prezenței leucocitelor, iar prezența catalazei în laptele pasteurizat dovedește ineficiența pasteurizării (pasteurizare defectuoasă).

Principiul metodei [NUME_REDACTAT] metodă se bazează pe dozarea excesului de peroxid de hidrogen rămas nedescompus după întreruperea activității enzimei din sânge sau alt produs biologic. Excesul de peroxid de hidrogen se titrează conform permanganometriei în mediu puternic acid.

Reacția de titrare se desfășoară conform următoarei ecuații chimice:

5H2O2+2KMnO4+4H2SO4→2MnSO4+2KHSO4+5O2+8H2O

Făcând diferența între cantitatea de KMnO4 consumat pentru titrarea peroxidului de hidrogen înainte și după intervenția enzimei, aflăm activitatea catalazei.

Reactivi necesari

• Soluție apoasă de H2O2 1% . Se prepară extempore din perhidrol.

• Soluție apoasă de acid sulfuric 10%.

• Soluție de KMnO4, N/10

Preparare:

Se cântăresc 3,160 g permanganat de potasiu, se aduc într-un balon cotat de 1000 ml, se dizolvă cu un mic volum de apă, iar după dizolvarea completă se adaugă apă distilată până la semn. Se stabilește titrul real (Tr) și factorul de corecție volumetrică (f) prin titrare cu soluție titrimetrică N/10 de acid oxalic. Soluția de KMnO4 se păstrează la întuneric și la temperatura camerei, timp de 7-8 zile, după care se decantează într-un flacon de sticlă de culoare brună.

Procesul biologic folosit

Se utilizează hemolizatul obținut prin osmotic în felul următor:

Se măsoară cu micropipeta (0,1 ml), sânge integral (sânge total),proaspăt recoltatși se diluează imediat cu apă distilată într-un balon cotat de 100ml și se agită energic până la producerea hemolizei.

Tehnica de lucru

Se introduc câte 10 ml apă distilată și 1 ml hemolizat în două flacoane Erlenayer de 50 ml. Acest flacon constituie proba martor, iar celălalt constituie proba de analizat. Ambele flacoane se tratează cu 2 ml soluție de H2O2 1% (apă oxigenată), după care se introduc în baia de apă menținută la 17°C și se mai introduc în ambele flacoane câte 5 ml H2SO4, pentru inactivarea catalazei.

Proba martor se titrează cu soluție de KMnO4 0,1 N până la punctul de echivalență, indicat de virajul de la incolor la slab roz. Volumul de KMnO4 0,1 N folosit la această titrare se notează cu N1. Identic se titrează și proba de analizat, notându-se și volumul de KMnO4 0,1N folosit, la apariția colorației roz cu N2.

Calculul rezultatelor

Activitatea enzimei se exprimă în unitatea convențională denumită cifră catalazică.

Calculul rezultatelor se efectuează după următoarea relație:

(N1−N2)×1,7 = cifra catalazică

N1= ml KMnO4 0,1 N utilizați pentru titrarea H2O2 din proba martor;

N2= ml KMnO4 0,1 N utilizați pentru titrarea H2O2 din proba de analizat;

N1−N2= ml KMnO4 0,1 N utilizați pentru titrarea H2O2 descompus de catalaza din sânge.

Se știe că 1ml KMnO4 0,1 N este echivalent cu 1 ml soluție de H2O2 0,1 N, iar 1ml soluție de H2O2 conține 1,7 mg H2O2.

Prin urmare 1,7 = titrul teoretic al KMnO4 exprimat în H2O2.

Valoarea rezultată din calculul de mai sus reprezintă unitatea convențională de exprimare a activității catalazei, unitate ce poartă numele de cifră catalazică.

Cifra catalazică

Cifra catalazică este cantitatea de peroxid de hidrogen exprimată în mg, descompusă de catalază din 0,001 ml sânge la 17°C, timp de 30 minute.

Deoarece cifra catalazică reflectă activitatea catalazei din eritrocite și poate fi influențată de variația numărului de hematii de la individ la individ.

S-a propus eliminarea acestui factor de eroare prin raportarea la numărul de eritrocite. Se obține în felul acesta indicele catalazic:

CIFRA CATALAZICĂ

INDICE CATALAZIC =

NR. ERITROCITE(MILIOANE)

4.2.1 REZULTATE ȘI DISCUȚII

În urma cuantificării activității catalazei s-au obținut valori ce variază mult așa cum reiese din tabelul (4.2) și fig. (1).

Tabelul 4.2 Activitatea catalazei exprimată în cifra catalazică

Figura 4.2 Activitatea catalazei pentru loturile experimentului.

Urmărind evoluția activităților catalazei din sângele animalelor cuprinse în experiment, așa cum indică tabelul 4.2 și fig. 4.2 constatăm o semnificativă diferență valorică între cele trei loturi. Astfel, dacă în sângele animalelor, din lotul de control, activitatea catalazei este 3,01 iar sângele lotului tratat cu ulei oxidat se înregistrează o scădere a activității până la1,29.

Această diminuare a cifrei catalazice pentru lotul care a ingerat timp de 4 săptămâni ulei cu grad de oxidare mare, demonstrează existența unui stres oxidativ, enzima consumându-se în reacțiile redox declanșate de prezența radicalilor liberi peroxidici.

Variația activității catalazice pentru cele două loturi demonstreză implicația enzimei în fenomenele biochimice caracteristice stresului oxidativ. Existența radicalilor liberi în celulă este anihilată de catalază, care catalizează descompunerea lor.

Se presupune că diminuarea activității enzimei de primă fază a apariției radicalilor liberi, generatori de stres oxidativ, are loc o stimulare a sintezei de enzimă, ceea ce duce la o creștere a concentrației de catalază(efect inductiv). Dacă concentrația de radicali liberi este constatată prin apariția de noi radicali liberi, enzima copleșită de cantități crescânde de substrat exogen, înregistrează o diminuare progresivă.

Pentru cel de-al doilea lot apare o creștere a cifrei catalazice (2,91) aproape de valoarea înregistrată la primul lot, ceea ce dovedește intervenția benefică a glutationului. Aportul exogen de glutation, tripeptidă cu funcții multiple, diminuează stresul oxidativ prin gruparea −SH liberă , grupare capabilă să reacționeze cu radicalii periodici .

Evoluția cifrei catalazice (CC) pentru lotul experimental, lot ce a fost tratat cu soluție extractivă apoasă 5% de frunze de anghinare ( Cynarae folium) evidențiază următoarele:

comparativ cu lotul de referință a cărei cifră catalazică se cifrează la 3,01 , cifră catalazică a lotului tratat cu infuzie de anghinare pe fondul stresului oxidativ indus cu ulei peroxidat este nesemnificativ săzută (2,89);

cifra catalazică a lotului experimental (2,89) este semnificativ crescutăfață de a lotului de control a stresului oxidativ (1,29), ceea ce poate sugera o intervenție promptă a flavonoidelor din Cynarae folium asupra radicalilor peroxidici, inductori de stres oxidativ;

față de cifra catalazică a lotului protejat cu glutation drept agent antioxidant (2,91), cifra catalazică a lotului protejat de prezența flavonoidelor din frunzele de Cynarae scolymus este nesemnificativ scăzută (2,89), ceea ce concluzionează faptul că flavonoidele deși acționează antiradicalar, potențialul lor antioxidant este inferior glutationului.

Analizând evoluția cifrei catalazice pentru lotul ce a fost tratat cu fitopreparat de Hippophae fructus se pot constata următoarele :

valoarea cifrei catalazice a lotului experimental 2 (2,99) este semnificativ ridicată față de a lotului pe care s-a reprodus stresul oxidativ (lot control 1, CC = 1,29), ceea ce demonstrează existența acțiunii antioxidante a cătinei;

cifra catalazică a lotului tratat cu infuzie de fruct de cătină (2,99) este ușor ridicată față de cea a lotului tratat cu glutation(2,91);

comparativ cu valoarea omonimă a lotului experimental 1 (lot tratat cu fitopreparat de anghinare, CC = 2,89), cifra catalazică a lotului trata cu Hippophae fructus este ușor crescută (2,99), ceea ce pledează pentru superioritatea potențialului antiradicalar al acesteia ; cifra catalazică a lotuluice a beneficiat de aportul exogen de fitopreparat de Hippophae fructus este cea mai apropiată de a lotului de referință.

4.3 DOZAREA SUPEROXID DISMUTAZEI

Considerații generale

Superoxid dismutaza este o enzimă din clasa oxidoreductazelor, enzimă prezentă în toate celulele aerobe, conținând în centrul său activ fie fier, fie cupru – zinc, fie mangan. Această metaloenzimă acționează asupra radicalilor liberi,O۠2ˉ, pe care îl descompune:

2O˙ˉ2 + 2H +SOD O2 + H2O2

In vivo, această enzimă acționează în tandem cu catalaza, acțiunea antitoxică a superoxid dismutszei nefiind eficientă fără intervenția catalazei care descompune mai departe H2O2 rezultat din acțiunea superoxid dismutazei:

2H2O2 catalaza 2H2O + O2

Activitatea superoxid dismutazei este condiționată de existența în centrul său catalitica unui metal (Fe,Cu – Zn,Mn), metal care datorită capacității sale redox transferă electronii între cele două molecule de O2 (Agoroaie L, 1998).

Valoarea diagnostică

Cu toate că enzima se găsește din abundență în organismul mamiferelor, s-a constatat că în anumite maladii concentrația sa scade dramatic, această scădere datorându-se pe de o parte prezenței unor inhibitori, iar pe de altă parte unei diminuări a biosintezei enzimei.

Tabelul 4.3 Maladii caracterizate de scăderea activității SOD în sânge

Principiul metodei

Metoda spectrofotometrică (descrisă de Fried)cu metasulfat de fenazină(PMS) și nitrobule tetrazolium(NBT) în amestec reacțional, se bazează pe o reacție de culoare,produsul de reacție fiind colorat în violet.

Culoarea produsului de reacție este colorimetrabilă la γ= 540 nm.

Fenozina reduce NBT la formazan, reacția fiind inhibată de SOD.

Reactivi necesari

• Tampon Na2HPO4 0,1 M, p = 7,8 ( 17,8 g Na2HPO4 × 2H2O dizolvat în 1000 ml apă bidistilată )

• Coactil SOD

Se prepară respectând formula:

Tampon ………………….90 ml

Gelatină …………………300ml

NBT……………………..300 ml

EDTA-Na2………………111,6 mg

Metasulfat de fenazină……3 mg

Gelatina cântărită se introduce într-un flacon Erlenmeyer. Se adaugă 45 ml tampon și se agită pe baie de apă, evitându-se fierberea, până la obținerea unui lichid clar. Se lasă să se răcească și se adaugă restul de substanță și restul de tampon. Se agită fără a se încălzi, până la dizolvarea comletă a substanței. Se transferă într-un flacon de culoare brună și se păstrează la frigider (+4°C), la întuneric până a doua zi.

A doua zi se repartizează în flacoane de sticlă în prize a câte 5 ml și se păstrează la congelator, la întuneric. Odată congelat, reactivul este valabil maxim o oră după decongelare. Se recomandă ca reactivul să se prepare cu cel mult o săptămână înainte de utilizare.

• Nicotinamid adenin dinucleotida redusă (NADH)

6,4 Μmoli în tampon pH = 7,8

Tehnica de lucru

Se iau 3 eprubete în care se vor pipeta următorii reactivi:

Se agită puternic conținutul celor trei eprubete și se lasă la întuneric 20 min pentru a avea loc reacția.

Se citește densitatea optică (DO) a probei de analizat și a blancului față de martori la λ = 540 nm (Agaroaie, 1998).

Calcularea rezultatelor

Activitatea superoxid dismutazei se măsoară în unități / g proba.

Unitatea de activitate enzimatică reprezintă cantitatea de enzimă care determină inhibiție de 50% a reacției.

Rezultatele în unități SOD au fost raportate la grame sânge din hemolizat (1ml sânge + 9 ml apă distilată ). Hemolizatul de sânge s-a preparat la fel ca în cazul determinării activității catalazei, ținându-se cont de faptul că ambele enzime sunt concentrate în eritrocite.

DOB − DOP

U SOD/ g probă =

DOB ⁄ 2

unde : DOB = densitatea optică a blancului

DOP = densitatea optică a probei de analizat

DOB ⁄ 2 = densitatea optică a blancului în momentul în care s-a produs 50 % inhibiție a reacției de culoare

4.3.1 REZULTATE ȘI DISCUȚII

Rezultatele înregistrate în dozarea activității superoxid dismutazei sunt redate în tabelul 4.3.1

Tabelul (4.3.1) Activitatea SOD din sângele lotului experimentului

Fig.(4.3) Variația activității SOD pentru cele două loturi experimentale

Studiul acestor rezultate evidențiată o scădere evidentă a activității SOD din sângele animalelor care au fost tratate cu ulei de floarea soarelui cu un conținut ridicat de radicali liberi peroxidici (241,246) față de activitatea SOD din sângele animalelor din lotul de control (352,8 U / g ). Diminuarea de aproximativ de 100 de ori a activității SOD în această situație, este datorată epuizării enzimei în urma asaltului produs de radicalii liberi peroxidici, asalt caracteristic stresului oxidativ.

O ameliorare a activității catalazei se înregistrează la cel de-al treilea lot (293 U / g) care deși a fost tratat cu aceeași doză de ulei rânced, a beneficiat de aportul exogen de glutation. Această substanță antioxidantă intervine în procesul oxidativ, făcând front comun cu celelalte substanțe antioxidante din celulă împotriva radicalilor peroxidici.

Variația activității SOD pentru lotul experimental tratat concomitent cu inductor de stres oxidativ și cu soluție extractivă 5% de Cynarae folium (lot experimental) evidențiază următoarele :

comparativ cu lotul de referință a cărei activitate superoxid dismutazică se cifrează la 352,8 U/g , lotul al patrulea a resimțit prezența radicalilor liberi peroxidici activitatea SOD fiind semnificativ diminuată (271,8 U/g);

activitatea SOD din sângele animalelor lotului experimental este crescută cu 30,6 U/g (271,8) față de a lotului de control a stresului oxidativ (lot control 1), ceea ce sugerează manifstarea efectului antiradicular al flavonoidelor din frunzele de anghinare ;

raportarea activității SODdin sângele animalelor tratat cu fitopreparat de Cynarae folium (271,8U/g) la activitatea SOD din sângele animalelor protejate cu glutation (293 U/g) reliefează superioritatea capacității antioxidante a glutationului.

Studiul evoluției activității SOD evidențiază următoarele comentarii:

SOD din sângele animalelor lotului experimental 2 (lot tratat cu fitopreparat de Hippophae fructus ca protector antioxidant )se cifrează la 322,4 U /g, valoare superioară atât lotului protejat cu Cynara scolymus (271,8 U/g) cât și lotului protejat cu glutation (293 U/g);

Activitatea SOD din sângele lotului experimental2 (322,4 U/g) este cea mai apropiată de a lotului de referință, ceea ce constituie un argument pentru susținerea existenței unei capacități antioxidante ridicatea fitocomplexului din Hippophae rhamnoides.

CONCLUZII

Stresul oxidativ este acea stare patologică determinată de acțiunea oxidantă a radicalilor liberi;

Radicalii liberi sunt molecule sau fragmente de molecule ce coțin un electron impar care le conferă o mare reactivitate ;

Toate cele 7 probe de lipide analizate din punct de vedere al indicelui peroxidic nu corespud FARMACOPEEI ROMÂNE în vigoare;

Pentru inducerea stresului oxidativ la animale s-a ales eșantionul P4, eșantionul de ulei de floarea soarelui, cu indicele de peroxidare 120 ;

Determinarea activității catalazei sangvine reliefează o scădere însemnată a activității acesteia în sângele animalelor supuse stresului oxidativ;

Scăderea activității catalazei este urmarea consumării acesteia în procesele redox, determinate de prezența radicalilor liberi;

Superoxid dismutaza înregistrează o scădere cu peste 100 Ua activității saleîn sângele animalelor tratate cu ulei de floarea soarelui, ca indicator de SO;

Scăderea dramatică a activității SOD este rezultatul epuizării enzimei în urma atacului radicalilor liberi;

SO se caracterizează prin scăderea activității catalazei și SOD, enzime care împreună se opun acțiunii oxidante a radicalilor liberi;

Glutationul este o tripeptidă care acționează în formă redusă (-SH) ca antioxidant;

Acțiunea antioxidantă a glutationului este confirmată de creșterea activității catalazei și SOD din serul animalelor tratate concomitent cu ulei oxidat și glutation.

Capacitatea antioxidantă a flavonoidelor din Cynarae folium este evidentă prin prisma activității SOD;

Potențialul antioxidant a principiilor active din anghinare, apreciat prin prisma celor doi parametri biochimici, este inferior celui al glutationului;

Capacitatea antioxidantă a fitocomplexului din Hippophae rhamnoides este superioarăatât celei din anghinare cât și celei a glutationului.

BIBLIOGRAFIE

Bhunyan D.K.- [NUME_REDACTAT] Radicals and their scavnger systems,

Edit. R.G. Greenwold, G, Cohlen, Vol 2, [NUME_REDACTAT], 1983, P. 343.

Cadenas E.- [NUME_REDACTAT]. Biochim, 1989, p. 58,79.

Ferao J., Matusushita S.- [NUME_REDACTAT] in Biology and Medicine, Ed.M.G. Simic, K.A. Taylor, [NUME_REDACTAT], NY, 1988, p.45-69.

Fee J.A, Valentine J.S- Superoxide and [NUME_REDACTAT], Ed. A.M. Michelson, 1977.

Hallliwell B.- Oxygen radicals and [NUME_REDACTAT], Faseb, Bethesdo, 1988.

Halliwell B, Gutteridge J.M.C – [NUME_REDACTAT] in Biology and Medicine, Clarendon, Oxford, 1989.

Hidalgo J. – [NUME_REDACTAT], Res. 1991, p. 23,104.

Hassan H.M – [NUME_REDACTAT] in [NUME_REDACTAT], Aging and Deseuse, Ed. D.Amstrong, T.F.Slater, [NUME_REDACTAT], NY, p.77,1984.

Krinsky N.I – [NUME_REDACTAT] Radicals in Chimistry and Biology, Ed.W. Bors, N. Saran, [NUME_REDACTAT], Berlin, 1984, p. 453-468.

Kanofky J.J – [NUME_REDACTAT], p. 87,597;1991.

Olinescu R.- Peroxidarea în chimie, biologie, medicină; Ed. Științifică 1982.

Olinescu R., Greabu M – Chimiluminiscența și bioluminiscența, Ed. Tehnică 1987.

Olinescu R., [NUME_REDACTAT]., Niță S. – [NUME_REDACTAT], p. 30,47, 1987.

Pryor W.A – [NUME_REDACTAT] Biology, p.1, 1976.

Prisăcaru C. – Cătina, un miracol uitat?, Lucr. Științ.,USAMV,

Prisăcaru C., [NUME_REDACTAT] Burlacu – Plant medicinale și toxice, Edit.“[NUME_REDACTAT] de la Brad”,Iași 2005;

Seis H., [NUME_REDACTAT], Ed..[NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], 1985.

Sohal R.S – Age pigments Elseier, Amsterdam, 1982.

Singh A., Petkan A.- [NUME_REDACTAT] , Conf. [NUME_REDACTAT], 1977.

Tanotti D. – Superoxide and [NUME_REDACTAT] in Chemistry and Medicine, Ed.G. Rotilio, E.Csivier, Amsterdam 1986, p. 28,890.