414Patologie renală [618422]

414Patologie renală
Clujul Medical 2010 Vol. 83 – nr. 3EXOSOMII URINARI: UN NOU MIJLOC DE EVALUARE
NONINVAZIVĂ A NEFROPATIILOR GLOMERULARE?
SILVIA SPÂNU1,2, MIRELA GHERMAN-CĂPRIOARĂ1
1UMF „Iuliu Hațieganu” Cluj-Napoca, Clinica de Nefrologie Cluj
2Division of Nephrology and Immunology, RWTH Aachen University, Aachen,
Germany
Rezumat
Exosomii sunt microvezicule de origine endocitară, care sunt eliberate în spa-
țiul extracelular și în variate fluide biologice prin fuziunea corpilor multiveziculari cu
membrana celulară apicală. Exosomii sunt eliberați de către variate tipuri celulare
din organism, iar cei identificați în urină provin din toate tipurile de celule epiteliale
renale.
Studiile de proteomică au evidențiat că exosomii conțin un set comun de
proteine membranare și citosolice și un subset de proteine caracteristice celulei de
origine, precum podocina și podocalixina pentru podocit.
Cercetările recente în domeniul proteomicii se concentrează asupra descope-
ririi de biomarkeri noninvazivi pentru diagnosticul precoce și monitorizarea evoluției
și a răspunsului la tratament a variatelor nefropatii. În acest sens, exosomii urinari
reprezintă o sursă potențială importantă de biomarkeri, deoarece prin spectrometrie
de masă s-a evidențiat concentrarea în aceste microvezicule a unor proteine rare, cu
posibilă semnificație diagnostică specifică pentru nefropatiile care afectează practic
orice segment al nefronului.
Analiza exosomilor urinari este un domeniu recent de cercetare, care are
de înfruntat numeroase provocări până la aplicarea ei în laboratorul clinic, însǎ
rezultatele actuale sunt de perspectivă în cercetarea nefrologică.
Cuvinte cheie: exosomi urinari, biomarkeri, nefropatii glomerulare.
URINARY EXOSOMES: A NOVEL NONINVASIVE APPROACH TO
GLOMERULAR DISEASES?
Abstract
Exosomes are microvesicles of endocytic origin, which are released into the
extracellular environment and various body fluids by fusion of the multivesicular
bodies with the apical cell membrane. They are released from various cell types in
the organism and the ones identified in urine originate from all renal epithelial cell
types.
Proteomic analysis revealed that exosomes harbour a common set of membrane
and cytosolic proteins, as well as a subset of proteins charcteristic for their cell of
origin, like podocin and podocalyxin for the podocyte.
Recent proteomic research focuses on the discovery of noninvasive biomarkers
for early diagnosis and monitoring evolution and treatment response of various
nephropathies. In these regards, mass spectrometry analysis showed that urinary
exosomes are an important potential source of biomarkers, as they concentrate
numerous rare proteins with possible specific diagnostic value for nephropathies
involving practically every segment of the nephron.
Urinary exosome analysis is a recent research field which still faces many
challenges, but it has already shown to be of perspective in nephrology research.
Keywords: urinary exosomes, biomarkers, glomerular diseases.
Articol intrat la redacție în data de: 16.04.2010; Acce�tat în data de: 2�.04.2010 Acce�tat în data de: 2�.04.2010
Adresa �entru cores�ondență: silvia_s�[anonimizat]

415Articole de orientare
Clujul Medical 2010 Vol. 83 – nr. 3Introducere
Termenul de „exosom” a fost utilizat �rima oară
în 1987 de către Johnstone et al. [1,2] �entru a descrie
vezicule eliberate de către reticulocitele de oaie �e �arcursul
cultivării in vitro a acestora în studii asu�ra maturării lor.
S-a sugerat că secreția de exosomi ar re�rezenta un meca-
nism de modulare a funcțiilor membranare, �rin eliminarea
de �roteine inutile în cursul maturării reticulocitelor [�].
În �rezent exosomii sunt definiți ca și vezicule
membranare cu diametre cu�rinse între 40 și 100 nm,
eliberate în mod normal de către variate ti�uri celulare
hemato�oetice, tumorale și e�iteliale [4].
Exosomii urinari sunt vezicule bioactive, formate în
com�artimentele celulare endocitare tardive – și anume în
interiorul cor�ilor multiveziculari (CMV). Sunt eliberați de
către toate ti�urile celulare e�iteliale care vin în contact cu
s�ațiul urinar: �odocite, celule e�iteliale tubulare și celulele
e�iteliului tranzițional [5].
În prezent se depun mari eforturi pentru descoperirea
de biomarkeri neinvazivi �entru evaluarea nefro�atiilor a-
cute și cronice. Mai mulți biomarkeri candidați se află în
curs de evaluare �entru a se stabili eficacitatea acestora în
detecția �recoce, clasificarea, �rognosticarea și monito-
rizarea răs�unsului la tratament a nefro�atiilor. Exosomii
urinari sunt o sursă bogată de biomarkeri, deoarece sunt
eliberați din fiecare segment al nefronului, inclusiv de
către �odocite. Prin modul lor de formare, exosomii
concentrează �roteine membranare, �recum trans�ortori
diverși și canale ionice, dar și �roteine citosolice, �recum
factori de transcri�ție cu rol central în inițierea și �rogresia
a numeroase nefro�atii, a glomerulosclerozei și a fibrozei
interstițiale [6].

Biogeneza și eliberarea exosomilor
Sistemul celular endosomal are un rol important
în se�ararea moleculelor endocitate destinate reciclării de
cele care vor fi degradate în lisosomi [7,8]. CMV descriși
în 1959 de către Sotelo și Porter [9] sunt organite celulare
rotunde sau ovale, localizate cel mai adesea în regiunea
a�icală a celulelor endoteliale. Ei a�arțin lisosomilor
secundari, fiind al doilea situs major, alături de �roteasom,
de �rocesare a �roteinelor membranare [10]. Exosomii
derivă din veziculele interne ale CMV. Mecanismul
molecular care stă la baza formării exozomilor este în
�rezent incom�let elucidat. Veziculele interne se formează
probabil prin bombarea spre interior a membranei CMV,
rezultând astfel un com�artiment delimitat de membrană
în care lumenul este echivalent din �unct de vedere to�o-
grafic cu citoplasma, spre deosebire de endosomi, care au
fața cito�lasmatică orientată s�re exterior [11].
Proteinele și li�idele membranare sunt recrutate
selectiv de �e membrana limitantă a CMV în veziculele
în curs de formare. CMV urmează două căi distincte: fie
fuzionează cu lisosomii, fa�t care conduce la degradarea
conținutului lor �roteic la acest nivel, fie fuzionează
cu membrana �lasmatică a�icală, rezultând exocitoza veziculelor interne în s�ațiul extracelular [12].
Fig. 1 – Biogeneza și eliberarea exosomilor. Proteinele
endocitate sunt transferate endosomilor �recoce (EP), iar a�oi
cor�ilor multiveziculari (CMV), de unde sunt fie �reluate de către
lisosomi și degradate, fie sunt eliberate în s�ațiul extracelular �rin
intermediul exosomilor.
Semnalul care marchează �roteinele membranei
�lasmatice �entru încor�orarea în CMV este re�rezentat de
monoubiquitinare – �roces �rin care �e su�rafața �roteinei
se atașează o singură moleculă de ubiquitină, și care diferă
de �oliubiquitinare, care marchează �roteinele �entru
degradarea în �roteasom [1�]. În �rocesul de formare al
veziculelor interne intervin în continuare trei com�lexe
�roteice care a�arțin mecanismului de „endosomal sorting
com�lex required for trans�ort” (ESCRT). În final se
�roduce sechestrarea �roteinelor cargo în veziculele inter-
ne în curs de formare, iar com�onentele mecanismului
ESCRT sunt disociate și reciclate [14,15,16].
Procesul de eliberare al veziculelor interne în
s�ațiul extracelular necesită trans�ortul CMV s�re �eri-
feria celulei, atașarea și fuziunea acestora cu membrana
�lasmatică. Se �are că aceste �rocese de�ind de �roteina
Rab 11, care se asociază cu li�idele �rezente în CMV și
reglează motilitatea acestor com�artimente [14]. În diverse
ti�uri celulare eliberarea veziculelor interne este reglată de
stimuli s�ecifici [12], �recum: modificări ale concentrației
de calciu intracelular în mastocite [17] și într-o linie celulară
umană de eritroleucemie [18], iar de�olarizarea indusă de
�otasiu crește secreția de exosomi neuronali [19].
Rolul biologic al exosomilor
Com�oziția moleculară a exosomilor reflectă func-
țiile s�ecializate ale celulelor de origine, iar �rezența lor
în fluide biologice și țesuturi sugerează �artici�area lor la
�rocese fiziologice și/sau �atologice [14].
În ultimii ani cercetarea exosomilor a fost stimulată
de observația că celulele �rezentatoare de antigen secretă
exosomi cu capacitate de stimulare a limfocitelor T in vitro
[20] și de a induce răs�uns imun antitumoral in vivo [21].
Exosomii reticulocitari elimină �roteine membra-
nare �recum rece�torul �entru transferină, care devin
inutile eritrocitelor mature, deci exosomii ar reprezenta
o alternativă în �rocesarea �roteinelor față de degradarea
lisosomală [22].

416Patologie renală
Clujul Medical 2010 Vol. 83 – nr. 3Exosomii �ot fi mani�ulati genetic, astfel încât
să ex�rime o gamă largă de ținte �entru medicamente,
incluzând rece�torii cu�lați cu �roteina G, �recum
rece�torul �entru somatostatina 2 [2�].
S-a evidențiat că exozomii conțin ARN mesager și
astfel ar avea rol în comunicarea intercelulară �rin transfe-
rul de ARNm [24,25].
S-a observat că �rezența exosomilor în urină este o
caracteristică constantă, cu variație mică interindividuală
și în cursul zilei, sugerând �osibilitatea rolului exosomilor
urinari în detoxifierea organismului [4].
Compoziția exosomilor urinari
Proteinele urinare includ �roteine solubile, majori-
tatea �rovenind din filtrarea glomerulară și com�onentele
�roteice de fază solidă, care sedimentează la viteze reduse
de centrifugare. Exosomii a�arțin �roteinelor de fază solidă,
dar având densitate foarte scăzută sedimentează doar �rin
ultracentrifugare [26].
Exosomii conțin �roteine citosolice, �recum și �ro-
teomul membranei plasmatice apicale al celulelor epiteliale
renale [5].
Analiza �roteomică a exosomilor urinari a identi-
ficat �este 295 de �roteine, dintre care cel �uțin 22 sunt
cunoscute a fi im�licate în diverse nefro�atii și boli sistemi-
ce [5]. S-au identificat �roteine comune tuturor exosomilor,
�recum tubulina, actina [22], �roteinele com�lexului
ESCRT, care joacă rol central în biogeneza exosomilor
[27], �recum și �roteine și ARN s�ecifice celulei de origi-
ne: �odocina și �odocalixina �entru �odocite, aqua�orina 1
pentru tubul proximal, aquaporina 2 pentru ductul colector
[1�,22].
Com�oziția li�idică a exosomilor este în �rezent
�uțin elucidată, se �are că este similară cu cea a membra-
nei �lasmatice a celulei de origine [22,28]. Majoritatea
exosomilor studiați conțin cantități mari de li�ide, �recum
colesterolul, sfingoli�ide și glicerofosfoli�ide [29,�0].
Izolarea și identificarea exosomilor urinari
Cea mai eficientă metodă de izolare a exosomilor
se bazează �e centrifugarea diferențială: inițial urina este
centrifugată la viteza standard �entru a înde�ărta sedimentul
urinar, a�oi su�ernatantul este su�us ultracentrifugării
�entru a obține sedimentarea membranelor cu densitate
joasă [1,�1].
O altă metodă de izolare, �ro�usă �entru studiile
clinice, se bazează �e filtrarea su�ernatantului rezultat în
urma centrifugării la viteza standard �rintr-o nanomem-
brană de �olietersulfonă, care reține majoritatea exosomi-
lor și elimină majoritatea �roteinelor solubile [�2]. Metode
alternative de izolare a exosomilor urinari, care �resu�un
absorbția, eva�orarea, dializa și/sau imunoizolarea necesită
evaluare su�limentară [1].
Identificarea veziculelor urinare ca și exosomi se
bazează �e criterii morfologice și biochimice. Datorită dimensiunilor reduse, exosomii �ot fi vizualizați doar
în microsco�ie electronică [��]. Din �unct de vedere
morfologic exosomii sunt descriși ca și vezicule rotunde,
relativ mici, cu diametre cu�rinse între 40 și 100 de nm,
acestea fiind de doar 5-10 ori mai mare decât membrana lor
limitantă bistratificată, as�ect ti�ic �entru veziculele interne
ale CMV. Analiza distribuției dimensiunii veziculelor
evidențiază că majoritatea diametrelor se situează între �5
și 40 de nm [1�].
Fig. 2 – Microscopie electronică de transmisie. Vezicule
urinare cu diametre cu�rinse între 40 și 100 de nm, izolate �rin
metoda ultracentrifugării (Laboratorul de microsco�ie electronică
al Universității RWTH Aachen).
Fig. 3 – Microscopie electronică de transmisie (Mărire
60.000X). Vezicule urinare cu diametre cu�rinse între 50 și 200
de nm izolate �rin metoda filtrării (Laboratorul de microsco�ie
electronică al Universității RWTH Aachen).
În vederea caracterizării biochimice a conținutului
veziculelor urinare este necesară se�ararea �roteinelor
exosomale �rin Western blot. Pentru a �utea susține
că veziculele sunt exosomi este necesară evidențierea
�roteinelor ti�ice �entru CMV [1�], iar �entru identificarea
originii veziculelor este necesară evidențierea �roteinelor

417Articole de orientare
Clujul Medical 2010 Vol. 83 – nr. 3celulare s�ecifice: �odocina și �odocalixina în cazul
podocitelor.
Rolul exosomilor urinari ca sursă de biomarkeri
în nefropatiile medicale
O țintă majoră în domeniul �roteomicii clinice este
identificarea biomarkerilor în fluide biologice, care �ot
fi măsurați cu un cost relativ redus �entru diagnosticul
�recoce al bolii. O �rovocare im�ortantă în acest �roces
este reducerea com�lexității �roteomului fluidului biolo-
gic res�ectiv, �entru a am�lifica detectabilitatea �roteinelor
cu concentrație redusă, care ar �utea avea semnificație
fizio�atologică im�ortantă [1�].
Datorită fa�tului că �oate fi colectată neinvaziv în
cantități mari, urina re�rezintă o sursă de biomarkeri ideală
[1�,�4] în vederea evaluării rolului acestora în diagnosti-
cul și clasificarea nefro�atiilor. Noi biomarkeri vor ajuta
la accelerarea dezvoltării de noi o�țiuni tera�eutice �entru
nefro�atiile de diverse etiologii [1].
Studii recente au evidențiat adevărata com�lexi-
tate a urinii normale, utilizând s�ectrometre de masă sen-
sibile. S-a evidențiat că urina conține sute de �roteine,
unele din ele în concentrație scăzută, �recum �roteine
membranare integre sau elemente de fază solidă, care
rǎmân în su�ernatant la viteze de centrifugare standard, dar
care sedimentează �rin ultracentrifugare [�5].
De asemenea s-au identificat variate ti�uri de ARN
mesager și micro ARN în stare inactivă, dar care au �oten-
țial de activare când exosomii sunt transfectați în celulele
din vecinatate. Profilul ex�resiei exosomale a micro ARN-
urilor ar �utea avea rol diagnostic și tera�eutic în variate
afecțiuni. Datorită a�rofundării studiului exosomilor în
ultimii ani și a cantității crescânde de informații legate de
com�oziția acestora, s-a ivit necesitatea creării unei baze de
date �ublice, care să centralizeze și să actualizeze �eriodic
informațiile legate de exosomi. În acest sens a fost creat
un com�endiu, denumit ExoCarta în care sunt catalogate:
numărul de studii care im�lică exosomii, numărul �ro-
teinelor, a ARN mesager și a micro ARN exosomale
identificate �recum și numărul organismelor, a ti�urilor
celulare și a fluidelor biologice din care au fost izolați
exosomi [�6].
S-a reușit izolarea unor �roteine asociate cu diverse
nefro�atii din fracțiunea exosomală a urinii, susținându-se
astfel i�oteza că analiza �roteomică a exosomilor ar �utea
reprezenta o cale de descoperire de biomarkeri urinari
utili în detecția �recoce și monitorizarea tratamentului
nefro�atiilor [1].
Exosomii urinari conțin a�roximativ �% din
totalitatea �roteinelor urinare excretate de către subiecții
sănătoși, deci �rin izolarea exosomilor se obține concen-
trarea de �este �0 de ori a �roteinelor lor constitutive.
Astfel crește detectabilitatea unor �roteine rare, care ar
�utea avea valoare diagnostică s�ecifică [�7].
Este cunoscut fa�tul că nivelul �roteinelor abun-dente �recum albumina, transferina și α1 antitri�sina
este crescut în glomerulo�atii. Acestora le li�sește însǎ
s�ecificitatea diagnostică și �rin abundența lor îm�iedică
evidențierea �roteinelor cu concentrație redusă, mai ales în
cazul glomerulopatiilor. Astfel s-a emis ipoteza conform
căreia �roteinele urinare cu concentrație redusă ar re�re-
zenta ținte mai bune în desco�erirea de noi biomarkeri
[�8].
Utilizarea metodelor bazate pe spectrometrie
în cercetarea nefrologică în vederea desco�eririi de
biomarkeri �otențiali �entru glomerulo�atiile idio�atice a
condus la analiza �osibilitatii de diferențiere a trei ti�uri
de glomerulopatii idiopatice – glomerulopatia cu leziuni
minime (GPLM), glomerulo�atia membranară (GPM) și
glomeruloscleroza focală (GSFS) și segmentală �e baza
�aternului de distribuție a �roteinelor mici și a �e�tidelor
urinare [26].
S-a observat că aqua�orina 2 este eliminată în urină
�rin intermediul exosomilor și re�rezintă un marker sensibil
în diagnosticul a variate tulburǎri ale balanței hidrice,
�recum diabetul insi�id [�9,40].
O a�licație �otențială a exosomilor ca și biomarkeri
este re�rezentată de boala �olichistică renală [�7], cea
mai frecventă nefro�atie genetică care �rogresează s�re
insuficiență renală cronică. În fracțiunea exosomală sunt
concentrate �olicistina 1 și fibrocistina/�oliductina, �ro-
teine dificil de detectat în țesutul renal adult normal [2�].
Analiza exosomilor urinari este de asemenea utilă
în sindromul Batter de ti� I, cauzat de mutații în gena
care codifică cotrans�ortorul Na-K-Cl, unde imunoblotul
evidențiază absența benzilor �roteice cores�unzătoare
transportorului. Astfel, analiza exosomilor urinari prin
s�ectrometrie de masă și imunoblot �oate furniza infor-
mații �rivind boli genetice care im�lică �roteinele
membranare a�icale [27].
S-a observat că isoforma � a canalului de Na+/H+
(NHE�), cel mai abundent trans�ortor a�ical de sodiu în
tubul renal, a crescut în fracțiunea exosomală a �acienților
cu insuficiență renală acută (IRA) �rerenală și a fost de
6 ori mai crescută la �acienții cu necroză tubulară acută.
Proteina a fost absentă în urina subiecților de control, iar
nivelurile acestei �roteine nu au crescut la �acienții cu IRA
intrinsecă, alta decât necroza tubulară acută. Acest studiu
�reliminar sugerează că NHE� exosomală urinară ar �utea
re�rezenta un nou biomarker sensibil și s�ecific �entru
leziunea tubulară în IRA și că ar fi un marker util �entru
diferențierea necrozei tubulare acute, a IRA �rerenale și a
IRA intrinseci, alta decât necroza tubulară acută [41].
S-a evidențiat că Fetuina-A urinară exosomală este
crescută semnificativ la �acienții cu IRA com�arativ cu
lotul de control și că este crescută doar în faza �recoce
a IRA ex�erimentală indusă de cis�latină sau ischemie/
re�erfuzie, dar nu este crescută la modelele de IRA �rin
de�leție volemică [�8].
Zhou et al. au observat că factorul de transcri�ție

418Patologie renală
Clujul Medical 2010 Vol. 83 – nr. 3ATF� crește �recoce în IRA, înainte de a�ariția leziunilor
tubulare și �oate fi detectată doar în fracțiunea exosomală
a urinii, dar nu în urina nefracționată. Astfel ATF� ar �utea
re�rezenta un nou marker �entru detecția �recoce a IRA
[6].
Rolul exosomilor urinari ca sursă de biomarkeri
în nefropatiile glomrulare
În cazul nefro�atiilor glomerulare s-a evaluat rolul
de biomarker al Wilm’s tumour 1 (WT-1) și al �odocalixi-
nei exosomale.
WT-1 este un factor de transcri�ție necesar
maturării �odocitare, dar care rǎmâne ex�rimat și în
celulele mature. Factorii de transcri�ție sunt im�licați în
dezvoltarea celulelor, care �ot dobândi în cursul agresiunii
�rin intermediul lor un fenoti� dediferențiat. Podocitele
sunt celule e�iteliale înalt diferențiate, care contribuie la
selectivitatea barierei de filtrare glomerulară.
Mutațiile dominante ale genei care codifică WT-1
cauzează a�ariția tumorii Wilms (nefroblastomul), �re-
cum și o serie de �odocito�atii: sindromul Denys Drash,
sindromul Fraiser și scleroza mezangială difuză izolată.
WT-1 este utilizat adesea ca și marker molecular �en-
tru �odocite diferențiate, ex�resia sa scǎzând în variate
glomerulo�atii umane și ex�erimentale în care se �ro-
duce agresiune asu�ra �odocitelor. Podocitele sunt lezate
în majoritatea glomerulo�atiilor �rimare sau secundare,
incluzând: GSFS, GPM, glomerulonefrita membrano-
�roliferativă, amiloidoza și nefro�atia diabetică.
Leziunea �odocitară este evaluată în �rezent �rin
examinarea bio�siei renale în microsco�ie electronică.
Metode noninvazive de cuantificare a leziunilor �odoci-
tare, �recum detecția �odocituriei, a ARNm WT-1 urinar
și a �roteinelor asociate �odocitelor în sedimentul urinar se
află în �rezent în curs de dezvoltare. Oricum, cuantificarea
�odocitelor urinare este dificilă din motive tehnice, iar
nivelurile ARNm WT-1 urinar și a �odocalixinuriei au o
variabilitate �rea mare �entru a diferenția între fiziologic
și �atologic.
Zhou et al. au examinat com�ortamentul WT-1
la �acienți cu GSFS și două modele ex�erimentale de
�odocito�atii: GSFS și glomerulo�atia colabantă.
WT-1 urinară a fost detectată mai �recoce decât
a�ariția �roteinuriei și mult mai �recoce decât leziunile
histologice glomerulare la animalele cu GSFS. WT-1
urinară s-a detectat la �acienții cu GSFS, dar nu și în
urina subiecților din lotul de control. Ca și în cazul ATF�,
factorul de transcri�ție WT-1 a fost detectat doar în
fracțiunea exosomală a urinii, fiind absent în urina totală.
S-a mai observat cǎ WT-1 urinară a crescut la ambele
modele ex�erimentale, în tim� ce concentrația tisulară era
în scădere, sugerând astfel că exosomii sunt eliberați din
�odocite lezate. Nu s-a elucidat dacă eliberarea exosomilor
se �roduce din �odocite mai �uțin afectate de agresiune,
care sunt res�onsabile de nivelurile tisulare scăzute sau din �odocite dediferențiate atașate în continuare de membra-
na bazală glomerulară (MBG) sau dacă �odocitele lezate
se detașează de �e MBG și eliberează a�oi exosomii.
Oricum, toate aceste observații sugerează că WT-1 urinară
exosomală ar �utea re�rezenta un biomarker util �entru
detecția �recoce a leziunilor �odocitare [6].
Un studiu a evidențiat că �odocalixina urinară
– marker cunoscut �entru membrana �odocitară a�icală, a
fost �rezentă în �re�aratul exosomal și a avut concentrații
semnificativ mai reduse la �acienții cu GSFS com�arativ
cu voluntarii sănătoși [�2].
Bariere și limite în analiza exosomilor urinari
Înainte ca analiza �roteomică a exosomilor urinari,
ca și cale s�re desco�erirea de biomarkeri �entru nefro�a-
tiile glomerulare să �oată fi a�licată în clinică, trebuie
de�ășite o serie de bariere im�ortante [5,27]. Acestea sunt
re�rezentate de:
– absența unor �rotocoale standardizate �entru
colectarea, �rocesarea și stocarea �robelor urinare în
vederea efectuării unor măsurători re�roductibile în orice
laborator clinic [1,25,42];
– necesitatea ultracentrifugării �robelor, �roces
care necesită a�aratură costisitoare și tim� îndelungat de
�rocesare – ca și alternativă de izolare a exosomilor s-au
�ro�us metode bazate �e filtrare;
– necesitatea înde�ărtării �roteinei Tamm-Horsfall
(uromodulina), care se află în cantități mari în concentratul
exosomal și interferează cu s�ectrometria de masă și
cu imunoblotul. Proteina Tamm Horsfall este cea mai
abundentă �roteină urinară în condiții fiziologice, �rezentă
sub formă �olimerică asamblată în filamente. S-a observat
că un număr semnificativ de exosomi rǎmân �rinși între
aceste filamente în cursul centrifugării, iar cantitatea finală
de exosomi izolați este redusă [27]. Recent s-a constatat
că �rin utilizarea ditiotrietolului în cursul centrifugării
se distrug filamentele care retenționează exosomii, iar
cantitatea recu�erată în final crește semnificativ [4�].
Totuși, cea mai mare �rovocare tehnică este
re�rezentată de dezvoltarea unor metode de cuantificare a
biomarkerilor candidați în vederea detectării modificărilor
ratei de excreție a acestora. În �rezent se utilizează ra�or-
tarea la creatininurie, care este însă inadecvată datorită
variabilității interindividuale mari a ratei de excreție [27].
Recent s-a evidențiat că există o corelație semnificativă
între cantitatea de �roteină Tamm-Horsfall și cantitatea de
markeri proteici exosomali, astfel uromodulina ar putea fi
utilizată ca și variabilă de normalizare a �robelor din s�otul
urinar [4�].
Concluzii
Analiza exosomilor urinari �oate furniza informații
im�ortante legate de �rocesele fiziologice și fizio�atologice
care au loc la nivelul �odocitelor. Ca și orice metodă nouă
de investigare �rezintă avantaje și limite, care trebuie

419Articole de orientare
Clujul Medical 2010 Vol. 83 – nr. 3de�ășite înainte de a�licarea analizei acestei fracțiuni
urinare în laboratorul clinic. Datorită modului neinvaziv de
colectare a �robelor, �recum și datorită cantității mari de
informații conținută în veziculele urinare – analiza acestora
este de mare actualitate în cercetarea nefrologică.
Bibliografie
1. Zhou H, Yuen PST, Pisitkun T, et al. Collection, storage,Collection, storage,
�reservation, and normalization of human urinary exosomes for
biomarker discovery. Kidney Int 2006; 69(8): 1471-1476
2. Li XB, Zhang ZR, Schluesener HJ, Xu SQ. Role of exosomesRole of exosomes
in immune regulation. J Cell Mol Med 2006;2:�64-�75
�. Johnstone RM, Adam M, Hammond JR, Orr L, Turbide C.
Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of
�lasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J
Biol Chem 1987;262:9412-9420
4. Keller S, Ru�� C, Stoeck A, et al. CD24 is a marker of exosomes
secreted into urine and amniotic fluid. Kidney Int 2007;72:1095-
1102
5. Hoorn EJ, Pisitkun T, Zietse R, et al. Pros�ects for urinaryPros�ects for urinary
�roteomics: Exosomes as a source of urinary biomarkers. Ne�hrol
2005;10:28�-290
6. Zhou H, Cheruvanky A, Hu X, et al. Urinary exosomal
transcri�tion factors, a new class of biomarkers for renal disease.
Kidney Int 2008;74(5):61�-621
7. Keller S, Sanderson MP, Stoeck A, Altevogt P. Exosomes:
from biogenesis and secretion to biological function. Immunol
Lett 2006;107:102-108
8. Gruenberg J, Stenmark H. The biogenesis of multivesicular
endosomes. Nat Rev Mol 2004;5:�17-�22
9. Sotelo JR, Porter KR. An electron microsco�e study of the rat
ovum. J Bio�hys Biochem Cytol 1959;5:�27-�42
10. Pi�er RC, Katzmann DJ. Biogenesis and function of
multivesicular bodies. Annu Rev Cell Dev Biol 2007;2�:519-547
11. Xiao Z, Blonder J, Zhou M, Veenstra TD. Proteomic analysis
of extracellular matrix and vesicles. J Proteomics 2008;72:�4-45
12. Denzer K, Kleijmeer MJ, Heijnen HFG, Stoorvogel W, Geuze
J. Exosome: from internal vesicle of the multivesicular body to
intercellular signaling device. J Cell S 2000;11�:��65-��74 lular signaling device. J Cell S 2000;11�:��65-��74
1�. Pisitkun T, Shen RF, Kne��er MA. Identification andIdentification and
�roteomic �rofiling of exosomes in human urine. PNAS
2004;101(�6):1��68-1��7�
14. Van Niel G, Porto-Carreiro I, Simoes S, Ra�oso G. Exosomes:
A common �athway for a s�ecialized function. J Biochem
2006;140:1�-21
15. Katzmann DJ, Babst M, Emr SD. Ubiquitin de�endent sortingUbiquitin dependent sorting
into the multivesicular body �athway requires the function of the
conserved endosomal �rotein sorting com�lex, ESCRT-I. Cell
2001:106:145-155
16. Woodman P, Futter C. Multivesicular bodies: co-ordinated
�rogression to maturity. Curr O�in Cell Biol 2008;20:408-414
17. Ra�oso G, Tenza D, Mecheri S, et al. Accumulation of
major histocom�atibility com�lex class II molecules in mast cell
secretory granules and their release u�on degranulation. Mol Biol
Cell 1997;8:26�1-2645
18. Savina A, Fader CM, Damiani MT, et al. Rab11 �romotes
docking and fusion of multivesicular bodies in a calcium-
de�endent manner. Traffic 2005;6:1�1-14�
19. Faure J, Lachenal G, Court M, et al. Exosomes are released byExosomes are released by
cultured cortical neurones. Mol Cell Neurosci 2006;�1:642-64820. Ra�oso G, Nijman HW, Stoorvogel W, et al. B lym�hocytes
secrete antigen-�resenting vesicles. J Ex� Med 1996;18�:1161-
1172
21. Zitvogel L, Regnault A, Lozier A, et al. Eradication of
established murine tumors using a novel cell-free vaccine:
dendritic-cell-derived exosomes. Nat Med 1998;4:594-600
22. Thery C, Zitvogel L, Amigorena S. Exosomes: com�osition,
biogenesis and function. Nature Reviews 2002;2:569-579
2�. Hogan MC, Manganelli L, Woollard JR, et al. CharacterisationCharacterisation
of PKD �rotein �ositive exosome-like vesicles. J Am Soc Ne�hrol
2009;20:278-288
24. Valadi H, Ekstroem K, Bossios A, et al. Exosome-mediatedExosome-mediated
transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of
genetic exchange between cells. Nature Cell Biology 2007;9(6):1-
4
25. Sim�son RJ, Jensen SS, Lim JWE. Proteomic �rofiling of
exosomes: Current �ers�ectives. Proteomics 2008;8:408�-4099
26. Pisitkun T, Johnstone R, Kne��er MA. Discovery of urinary
biomarkers. MCP 2006; 5:1760-1771
27. Gonzales PA, Pisitkun T, Hoffert JD, et al. Large-scaleLarge-scale
�roteomics and �hos�ho�roteomics of urinary exosomes. J Am
Soc Ne�hrol 2009;20:�6�-�79
28. Subra C, Laulagnier K, Perret B, Record M. Exosome
li�idomics unravels li�id sorting at the level of multivesicular
bodies. Biochemie 2007;89:205-212
29. De Gassart A, Geminard C, Fevrier B, Ra�oso G, Vidal
M. Li�id raft-associated �rotein sorting in exosomes. Blood
200�;102:4��6-4�44
�0. Trajkovic K, Hsu C, Chiantia S, Rajendran L. Ceramide
triggers budding of exosome vesicles into multivesicular
endosomes. Science 2008;�19:1244-1247
�1. S�ânu S, Wieland D, Star RA, Floege J, Muehlfeld A. Metodă
de evidențiere a exosomilor urinari in vederea a�recierii rolului
lor ca markeri noninvazivi de evaluare a activității nefro�atiilor
glomerulare. Nefrologia 2009;1�:108-109 108-109
�2. Cheruvanki A, Zhou H, Pisitkun T, et al. Ra�id isolation ofRa�id isolation of
urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane concentrator.
Am J Physiol Renal Physiol 2007; 292(5):F1657-F1661
��. Fevrier B, Ra�oso G. Exosomes: endosomal-derived vesicles
shi��ing extracellular messages. Current o�inion in cell biology
2004;16:415-421
�4. Dimov I, Velickovic LJ, Stefanovic V. Urinary exosomes.
The Scientific World Journal 2009;9:1107-1118
�5. Kne��er MA, Pisitkun T. Exosomes in urine: who would have
thought…?. Kidney Int 2007;72:104�-1045
�6. Mathivanan S, Sim�son RJ. ExoCarta: A com�endium of
exosomal �roteins and RNA. Proteomics 2009;9:4997-5000
�7. Gonzales P, Pisitkun T, Kne��er MA. Urinary exosomes: isUrinary exosomes: is
there a future?. Ne�hrol Dial Trans�lant 2008;2�:1799-1801
�8. Zhou H, Pisitkun T, A�onte A, et al. Exosomal Fetuin-AExosomal Fetuin-A
identified by �roteomics: A novel urinary biomarker for detecting
acute kidney injury. Kidney Int 2006;70:1847-1857
�9. Kanno K, Sasaki S, Hirat Y, et al. Urinary excretion ofUrinary excretion of
aqua�orin-2 in �atients with diabetes insi�idus. N Engl J Med
1995;��2:1540-1545
40. Elliot S, Goldsmith P, Kne��er M, Haughey M, Olson B.
Urinary excretion of aqua�orin-2 in humans: a �otential marker of
collecting duct res�onsiveness to vasso�resin. J Am Soc Ne�hrol
1996;7:40�-409
41. Du Cheyron D, Daubin C, Poggioli J, et al. UrinaryUrinary
measuremennt of Na+/H+ exchanger isoform � (NHE�) �rotein as

420Patologie renală
Clujul Medical 2010 Vol. 83 – nr. 3new marker of tubule injury in critically ill �atients with ARF.
Am J Kidney Dis 200�;42(�):��497-506
42. Michell PJ, Welton J, Stffurth J, et al. Can urinary exosomes
as treatment res�onse markers in �rostate cancer?. J Transl Med
2009;7:44�. Lama PF, Khositseth S, Gonzales PA, Star RA, Pisitkun
T, Kne��er MA. Tamm-Horsfall �rotein and urinary exosome
isolation. Kidney Int 2010. Available from: URL: htt�://www.
nature.com/ki/journal/vao�/ncurrent/abs/ki2009550a.html