4.1 Studii moleculare de biodiversitate intra- și interspecifică a tulpinilor de drojdii luate în studiu 4.1.1 Polimorfismul intraspecific al… [303140]

4 . REZULTATE ȘI DISCUȚII

4.1 [anonimizat] a tulpinilor de drojdii luate în studiu

4.1.1 Polimorfismul intraspecific al tulpinilor de drojdie aparținând speciei S. cerevisiae

RAPD este o [anonimizat] a [anonimizat] (Corte și colab., 2005). Această tehnică poate fi utilizată cu succes în analize filogenetice permițând determinarea gradului de polimorfism intra și interspecific (Kumari și Thakur, 2014).

Un obiectiv important al prezentei lucrări îl constituie determinarea indicelui de polimorfism intraspecific în rândul tulpinilor de S. cerevisiae provenite din diferite surse de izolare. Pentru o analiză filogenetică cât mai acurată în acest studiu au fost integrate și alte patru tulpini aparținând speciei S. cerevisiae.

[anonimizat] a fost optimizat în cadrul Laboratorului de Genetica microorgansimelor și Biotehnologie ([anonimizat], Universitatea din București) utilizând primerii OPH15 și OPA03. Ținând cont că tehnica RAPD prezintă dezavantajul de a [anonimizat], s-a recurs la o etapă preliminară de optimizare pentru a garanta reproductibilitatea metodei. Această etapă a [anonimizat], pentru confirmarea apariției benzilor de interes.

Fig. 8. [anonimizat]15 (a) și OPA03 (b) pentru: 1-100-bp DNA Ladder (ThermoFisher Scientific); 2-pGEM DNA ladder (Promega); 3-S. cerevisiae S288C; 4-S. [anonimizat]3; 5-S. cerevisiae CMGB-4JC; 6-S. cerevisiae CMGB70; 7-S. cerevisiae CMGB48; 8-S. cerevisiae CMGB 234; 9-S. cerevisiae CMGB59

Conform Figurii 8 [anonimizat]15 a generat un număr total de 38 de benzi cu dimensiuni cuprinse între 200 și 1900 pb dintre care 17 sunt polimorfice. Raportând numărul benzilor polimorfice la numărul total de benzi se obține un indice de polimorfism intraspecific de 44%. [anonimizat] (OPA03) [anonimizat] 31%. Deși numărul total de benzi obținute este mai mare existând în total 41 de benzi cu dimensiuni cuprinse între 200 și 1000 pb, dintre acestea doar 13 benzi sunt polimorfice.

În vederea evidențierii gradului de apropiere filogenetică a [anonimizat]. Acest algoritm folosește matricea de similaritate și organizează datele în clustere fără a oferi indicații privind descendența tulpinilor (Kaur și colab., 2013).

Fig. 9. Arborele filogenetic al speciilor analizate pe baza profilului RAPD obținut cu primer OPH15 (UPGAMA, PyElph)

Dendograma obținută utilizând profilul RAPD generat de primerul OPH15 (Figur 9) împarte tulpinile de S. cerevisiae în două clustere. Primul cluster fiind format din două tulpini izolate din produse lactate fermentate spontan (S. cerevisiae CMGB-234 și S. cerevisiae CMGB-4JC) și o tulpină de proveniență industrială. Acest primer nu diferențiază tulpina de colecție S. cerevisiae S288C de S. cerevisiae CMGB-48 sau S. cerevisiae CMGB- 59. Având un indice de polimorfism de 44% primerul OPH15 poate fi folosit pentru discriminarea parțială a tulpinilor aparținând acestei specii și poate oferi informații pertinente atunci când este utilizat pentru încadrarea taxonomică a unor tulpini noi…

Analiza dendrogramei generate cu ajutorul primerului OPA03 reflectă posibilitatea utilizării acestui primer ca marker pentru discriminarea intraspecifică a tulpinilor din această specie în funcție de sursa de izolare chiar dacă indicele de polimorfism intraspecific în acest caz a avut o valoare mai mică. În acest caz, tulpina de referință S. cerevisiae S288C este plasată pe o ramură distinctă comparativ cu celelalte tulpini (Figura 10). Acest primer poate indica variațiile genetice specifice fiecărei tulpini induse de condițiile mediului din care provin.

Fig. 10. Arborele filogenetic al speciilor analizate pe baza profilului RAPD obținut cu primer OPA03 (UPGAMA, PyElph)

Ai incurcat nr figurilor (ai pierdut pe drum)….Trebuie sa refaci toate numerotarile figurilor de aici pana la sfarsitul tezei…si in text!!!

De-a lungul timpului, tehnica RAPD a fost frecvent folosită pentru analize filogenetice în rândul tulpinilor de S. cerevisiae. De exemplu, Gallego și colab. (2005) au comparat tehnicile AFLP, RAPD și SSR în vederea discriminării genetice a tulpinilor de S. cerevisiae. Conform acestui studiu toate cele trei tehnici pot fi utilizate cu succes în astfel de analize cu mențiunea că în cazul tehnicii RAPD cele mai bune rezultate se obțin atunci când sunt utilizați mai mult de doi primeri. În același an, Corte și colab., analizează distribuția filogenetică a 30 tulpini de S. cerevisiae corelând rezultatele obținute folosind tehnica RAPD cu tehnica KTS (Killer Toxin Sensitivity). Acest autor stipulează ideea conform căreia, acuratețea tehnicilor de genotipare este limitată, indiferent de numărul variabilelor folosite și de aceea este necesară utilizarea unor tehnici care să vizeze aspecte diferite, atât moleculare cât și biochimice (de exemplu prezența anumitor receptori pentru toxina killer). În final, ambele lucrări menționate concluzionează că analiza filogenetică, indiferent de tehnica utilizată, are importanță deosebită pentru înțelegerea comportamentului microorganismelor în ecosistemul din care fac parte.

4.1.2 Polimorfismul interspecific în cadrul genului Pichia

Tehnica RAPD poate fi utilizată, așa cum am menționat anterior și pentru determinarea indicelui de polimorfism interspecific. În acest caz, se pot genera arbori filogenetici care nu numai separă diferitele tulpini din aceiași specie dar pot indica și poziția acestora raportată la membrii comunităților din care fac parte. Determinarea indicelului de polimorfism interspecific presupune cel puțin o etapă de optimizare a reacției PCR-RAPD pentru selectarea primerului/ primerilor care generează un număr de benzi suficient de mare pentru a fi relevant într-o astfel de analiză.

Folosind același protocol de amplificare ca și în cazul analizei diversității intraspecifice în rândul tulpinilor de S. cerevisiae au fost realizate mai multe reacții PCR folosind ADN genomic extras din tulpina P. (K.) ohmerii CMGB-ST19 ca matriță și șase primeri RAPD (OPA18, OPE18, OPA03; M13; OPA11; OPH19).

Fig. 10. Profilul ampliconilor obținuți pentru Pichia (Kodamaea) ohmerii CMGB-ST19 prin reacția RAPD-PCR utilizând diferiți primeri: 1-100bp DNA Ladder (ThermoFisher Scientific); 2-OPA18, 3-OPE18, 4-OPA03; 5-M13; 6-OPA11; 7-OPH19

Așa cum se poate observă în Figura 10, profilul RAPD caracteristic tulpinii P.(K.) ohmerii CMGB-ST19 diferă în funcție de primerul folosit. Pentru fiecare primer testat au fost obținute cel puțin trei benzi de intensități diferite. Dintre aceștia se remarcă primerul OPE 18 care a generat în total 7 benzi cu dimensiune cuprinsă între 400 și >1500 pb și primerul OPA03 în patternul căruia au fost identificate 5 benzi cu dimensiuni cuprinse între 300 și 1400 pb. Trebuie menționat că pentru determinarea gradului de polimorfism interspecific nu se ține cont de intensitatea benzii ci de prezența sau absența acesteia (Atienzar și Jha, 2006; Rabie și colab., 2010) motiv pentru care primerii OPE18 și OPA03 pot fi selectați ca markeri moleculari pentru viitoare studii privind biodiversitatea tulpinilor aparținând genului Pichia.

Următoarea etapă din acest studiu de biodiversitate, care ar fi trebuit să se desfășoare în perioada martie-iunie 2020, ar fi presupus compararea profilului RAPD obținut folosind primerul selectat pentru tulpinile din genul Pichia luate în studiu comparativ cu cel caracteristic pentru alte tulpini din același gen (P. pastoris CMGB167; P. anomala CMGB 88; P. guillermondii CMGB 44; P. stipitis CMGB-ST12; P. kudriavzevii CMGB 224).

4.2. Studiul activității antimicrobiene a tulpinilor de drojdie, pentru aplicații biomedicale și obținerea de compuși probiotici

De-a lungul timpului, drojdiile au fost descrise ca având un potențial antimicrobian deosebit putând inhiba creșterea multor specii de bacterii, drojdii și fungi cu caracter patogen. Diversitatea mecanismelor implicate în activitatea antimicrobiană diferă în funcție de specia de drojdie putându-se baza pe sinteza de toxine killer, enzime sau alți compuși celulari dar și pe competiția de substrat. Drojdiile cu proprietăți antimicrobiene pot fi utilizate atât în diferite ramuri industriale precum și în domeniul biomedical (Csutak, 2014). În cadrul studiului de față sunt caracterizate mai multe tulpini de drojdii nou-izolate în vederea determinării potențialului lor antimicrobian.

4.2.1. Potențialul antimicrobian al tulpinilor de S. cerevisiae

Testele pentru activitatea antimicrobiană anti-Candida a tulpinilor de S. cerevisiae s-au realizat folosind atât tulpini de Candida patogene, cât și potențial patogene, iar rezultatele au fost citite la 3, respectiv 7 zile (Tabel 9).

O caracteristică esențială a microorganismelor utilizate în domeniul biomedical este incapacitatea acestora de a inhiba creșterea tulpinilor microbiene probiotice. Astfel, a fost determinată capacitatea antimicrobiană a tulpinilor de S. cerevisiae de a inhiba creșterea unor tulpini de drojdii cunoscute pentru propietățile lor probiotice (S. boulardii CMGB-S; K. lactis CMGB 112; K. marxianus CMGB 159) la 20⁰C. Luând în considerare că această valoare de temperatură este considerată temperatura optimă de acțiune a toxinei killer produsă de tulpini de S. cerevisiae poate oferi informații suplimentare privind mecanismul de acțiune antimicrobiană al tulpinilor testate.

Tabelul 9. Evidențierea caracterului killer anti-Candida a tulpinilor de S. cerevisiae luate în studiu, 3 și 7 zile

Notații: „+” halou de 2-3 mm; „++” halou de 4 mm; „+++” halou de 5-6 mm; „-” lipsa haloului

În cadrul acestui studiu au fost utilizate și două tulpini standard: S. cerevisiae SMR4 (Kil-K2) (K+R+) cunoscută pentru capacitatea de a produce toxină killer activă la pH 4.8 (Vintilă și colab., 2015; Matei și Găgeanu, 2011), și tulpina sensibilă la toxina killer S. cerevisiae 17/17 a his (Kil-K0) (K–R-), (Vassu și colab., 2001) (Figura 10-A*). Rezultatul pozitiv în cazul acestei tehnici este indicat de apariția unui halou sau zonă de inhibiție a creșterii tulpinii potențial sensibile în jurul spotului de cultură de drojdie cu potențial antimicrobian. Multe tulpini aparținând speciei S. cerevisiae sunt capabile să producă diferite toxine killer pe care le eliberează în mediul extracelular determinând moartea tulpinilor de drojdie non-killer sau din clasă killer diferită (Vytautas și colab., 2016). Toxinele killer produse de S. cerevisiae pot inhiba chiar și creșterea unor tulpini bacteriene sau fungice. Luând în considerare faptul că S. cerevisiae are o istorie bogată în aplicații biotehnologice și a dobândit statutul GRAS, utilizarea acestora în domeniul biomedical pentru combaterea patogenilor este o perspectivă de cercetare intens abordată (Rodrigues-Cousino și colab., 2011).

În cadrul acestui studiu, tulpinile de S. cerevisiae testate au inhibat cu succes creșterea tulpinii de C. krusei CMGB94 după numai trei zile de incubare observându-se în jurul spotului de cultură o zonă de inhibiție cu aspect modificat care se păstrează până la șapte zile (Figura 10b). Chiar dacă la un nivel mai scăzut, activitate antimicrobiană a fost înregistrată și față de tulpinile C. albicans ATCC10231 (Figura 10a) și C. parapsilosis CBS604 (Figura 10c). Se remarcă faptul că în cazul tulpinii C. parapsilosis CBS604 se observă modificarea culorii mediului de cultură din albastru spre verde-galben care se datorează acțiunii tulpinii substrat și nu a tulpinilor testate pentru activitate antimicrobiană.

Fig. 10. Evaluarea acivității killer anti-Candida a tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae (Tulpini testate: A* – S. cerevisiae SMR4, B* – S. cerevisiae CMGB48, C*- S. cerevisiae CMGB70, D* – S. cerevisiae CMGB 234) după 7 zile de la incubare: (a)-C. albicans ATCC10231;

(b)-C. krusei CMGB94; (c)-C.parapsilosis CBS604

Luând în considerare faptul că zona de inhibiție nu prezintă delimitare clară, au fost realizate și preparate proaspete (lamă-lamelă) atât din vecinătatea spotului cât și din zone neafectate pentru a identifica posibilele modificări intracelulare apărute la nivelul tulpinii sensibile. Ca urmare, s-a putut observa că la nivelul C. parapsilosis CBS604 (martor) se regăsesc celule ovale sau alungite cu aspect de pseudohife (Figura 11a). În ceea ce privește aspectul celulelor de Candida la zona de contact cu tulpina S. cerevisiae CMGB 234 (Figura 11b), acestea au dimensiuni mult reduse, deși sunt abundente acestea sunt puternic vacuolizate, prezintă mai puține pseudohife și pot fi identificate chiar celule moarte care s-au colorat în albastru datorită colorantului albastru de metilen din mediu care a pătruns în celulă.

(a) (b)

Fig. 11. Interacția dintre C. parapsilosis CBS604 și tulpina S. cerevisiae CMGB 234:

(a) C. parapsilosis CBS604 – Martor; (b) în prezența S. cerevisiae CMGB 234

În cazul C. krusei CMGB94 (martor) apar celule reduse ca dimensiuni și aglutinează (Figura 12a), cu aspect elipsoidal, iar în interacția cu S. cerevisiae CMGB48 (Figura 12b) apar celule de Candida alungite, vacuolizate observându-se chiar și ușoara modificarea a culorii care tinde spre verde-albastru, dar și încetinirea procesului de creștere.

(a) (b)

Fig. 12. Interacția dintre C. krusei CMGB94 și tulpina S. cerevisiae CMGB48:

(a) C. krusei CMGB94 – Martor; (b) în prezența S. cerevisiae CMGB48

Ținând cont de faptul că tulpinile de drojdie provenite din infecții vulvo-vaginale au o temperatură optimă de creștere la 37⁰C (temperatura corpului uman), activitatea antimicrobiană față de acestea a fost testată atât la 28⁰C (temperatura optimă de creștere a tulpinilor de drojdie la modul general) cât și la 37⁰C. Dintre cele trei tulpini de S. cerevisiae testate, două tulpini au prezentat activitate antimicrobiană față de C. krusei CMGB-Y8 (Figura 13). Tulpina S. cerevisiae CMGB 70 inhibă slab creșterea acesteia după trei zile de incubare la 37⁰C (Figura 13C*)și se păstrează constantă până la ultima monitorizare.

Fig. 13. Evaluarea activității antimicrobiene față de C. krusei CMGB-Y8 după 3 zile de incubare la 37ᵒC a tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae (Tulpini testate: A* – S. cerevisiae SMR4, B* – S. cerevisiae CMGB48, C*- S. cerevisiae CMGB70, D* – S. cerevisiae CMGB 234)

Spre deosebire de aceasta, tulpina S. cerevisiae CMGB234 prezintă activitate antimicrobiană față de C. krusei CMGB-Y8 la trei zile de incubare la 28⁰C și nu la 37ᵒC (Figura 14 (1)-D*). Până la finalul perioadei de incubare activitatea față de această tulpină scade (Figura 14 (2)-D*).

Fig. 14. Evaluarea activității antimicrobiene față de C. krusei CMGB-Y8 după 3 zile de incubare la 28ᵒC (1) și 7 zile (2) a tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae (Tulpini testate: A* – S. cerevisiae SMR4, B* – S. cerevisiae CMGB48, C*- S. cerevisiae CMGB70, D* – S. cerevisiae CMGB 234)

În ceea ce privește activitatea antimicrobiană față de tulpinile de drojdie cu potențial probiotic (S. boulardii CMGB-S; K. lactis CMGB 112; K. marxianus CMGB 159), se remarcă faptul că tulpinile testate nu au afectat creșterea acestora (Figura 15 (1);(2);(3) (B*;C*;D*).

Comportamentul tulpinilor testate față de tulpina S. cerevisiae 17/17 cunoscută pentru sensibilitatea acesteia la toxina killer, poate oferi informații pertinente referitoare la mecanismul de acțiune antimicrobiană (Figura 15 (2)). Tulpina S. cerevisiae CMGB 234 (Figura 15 (2); (4) D*) prezintă activitate antimicrobiană atât la trei zile cât și la șapte zile de incubare la 20⁰C ceea ce poate indica faptul că mecanismul acesteia poate fi bazat pe sinteza de toxină killer.

De altfel, conform Tabelului 9 creșterea temperaturii de incubare a influențat puternic în mod negativ activitatea antimicrobiană a tulpinii S. cerevisiae CMGB 234, ceea ce se corelează cu faptul că toxinele killer produse de S. cerevisiae caracterizate până în prezent au un grad mare de termolabilitate (Vassu și colab., 2001).

În cazul tulpinii S. cerevisiae CMGB 70 (Figura 15 (2);(4)-C*) activitatea killer față de tulpina sensibilă de referință este limitată și întârziată ceea ce pe de o parte poate indica existența unor mecanisme secundare de acțiune antimicrobiană care nu sunt neapărat asociate cu sinteza killer. De altfel, tulpina S. cerevisiae CMGB 70 este de proveniență industrială, ceea ce implică existența unor adaptări metabolice deosebite dobândite în urma expunerii la factorii de stres asociați proceselor industriale. De exemplu, tulpinile de drojdie utilizate în industrie au o rezistență mai mare la valori scăzute de pH (Yuzbashev și colab., 2010) ceea ce le poate oferi un avantaj față de tulpinile din substrat atunci când se testează activitatea antimicrobiană folosind mediu K.

Fig. 15. Activitatea antimicrobiană a tulpinilor de S. cerevisiae asupra: (1,3) S. boulardii CMGB-S 20°C-tulpină de drojdie probiotică, (2,4) S. cerevisiae 17/17 20°C-tulpină de referință sensibilă la toxina killer la 3 zile de incubare (1,2), respectiv 7 (3,4)

(Tulpini testate: A* – S. cerevisiae SMR4, B* – S. cerevisiae CMGB48, C*- S. cerevisiae CMGB70, D* – S. cerevisiae CMGB 234)

Studiul activității antimicrobiene a tulpinilor de S. cerevisiae a relevat faptul că tulpina S. cerevisiae CMGB70 provenită din procese industriale prezintă cea mai puternică activitate anti-Candida fiind capabilă să inhibe creșterea unor tulpini de Candida potențial patogene și patogene în prezența unor valori reduse de pH. Tulpina S. cerevisiae CMGB 234 inhibă cu succes creșterea tulpinilor de Candida potențial patogene rezultatele, indicând posibilitatea ca această tulpină să acționeze prin intermediul unei toxine killer.

Toate tulpinile de S. cerevisiae luate în studiu au prezentat activitate killer, inhibând creșterea tulpinilor aparținând genului Candida testate. Din contră, nici una dintre ele nu a avut acțiune antimicrobiană asupra tulpinilor de drojdie probiotice. Ca urmare, putem considera că tulpinile noastre se încadrează în statutul GRAS, ceea ce le recomandă pentru aplicații biomedicale. De altfel, viitoarele studii se vor axa pe determinarea cu acuratețe a mecanismelor de inhibiție a tulpinilor Candida patogene și dezvoltarea unor tehnologii de combatere a acestor patogeni în condiții de siguranță pentru sănătatea oamenilor.

4.2.2. Potențialul antimicrobian al tulpinilor aparținând genului Pichia

Numeroase specii de drojdii aparținând genului Pichia au dovedit de-a lungul timpului capacitatea de a inhiba creșterea unor patogeni precum cei din genul Candida prin intermediul unor toxine killer codificate de gene nucleare (Schaffrath și colab., 2017). Folosind un protocol similar cu cel utilizat pentru testarea activității antimicrobiene a tulpinilor de S. cerevisiae, s-a determinat activitatea antimicrobiană a trei tulpini aparținând genului Pichia la valori scăzute de pH. În cadrul studiului a fost introdusă și tulpina P. anomala CMGB88 în calitate de martor pozitiv fiind dovedit într-un studiu precedent că are capacitatea de a produce toxină killer rezistentă atât la variația temperaturii cât și la variația valorii de pH (Csutak și colab., 2017).

Tabelul 10. Evidențierea caracterului killer anti-Candida a tulpinilor din genul Pichia luate în studiu, la 3 și 7 zile

Notații: „+” halou de 2-3 mm; „++” halou de 4 mm; „+++” halou de 5-6 mm; „-” lipsa haloului

Conform Tabelului 10 rezultatele privind activitatea antimicrobiană au variat atât în funcție de tulpina potențial sensibilă cât și în funcție de temperatura de incubare.

Fig. 16. Evaluarea acivității killer anti-Candida a tulpinilor din genul Pichia

(Tulpini testate: A – P. anomala CMGB88, B – P. membranaefaciens CMGB-ST53,

C- P. membranaefaciens CMGB-MT26, D – P. (K.) ohmerii CMGB-ST19) după 7 zile de la incubare:

(a) Substrat (1) C. albincans10231 ATCC, 28°C, (2) Candida albicans CMGB-Y13, 28°C;

(3) Candida albicans CMGB-Y13, 37°C;

(b) Substrat (1) C. krusei CMGB94, 28°C, (2) C. krusei CMGB-Y8, 28°C;

(3) C. krusei CMGB-Y8, 37°C;

(c) Substrat (1) C. parapsilosis CBS604, 28°C; (2) C. parapsilosis CMGB-Y3, 28°C;

(3) C. parapsilosis CMGB-Y3, 37°C

Cele mai bune rezultate s-au obținut în cazul tulpinii P.(K.) ohmerii CMGB-ST19 care a inhibat cu succes creșterea tulpinilor C. albicans ATCC 10231, C. krusei CMGB94 și C. krusei CMGB-Y8. Analiza microscopică a celulelor de C. krusei CMGB-Y8 aflate în vecinătatea spotului de P.(K.) ohmerii CMGB-ST19 (Figura 17b) a relevat faptul că prezența acestei tulpini reprezintă o sursă de stres pentru tulpina patogenă întrucât celulele au aspect fantomatic putând fi observată doar membrana plasmatică. Spre deosebire de acestea, celulele de C. krusei CMGB-Y8 aflate în zone unde P.(K.) ohmerii CMGB-ST19 nu își exercită influența sunt elipsoidale și majoritatea prezintă caracteristicile unei celulele de drojdii active metabolic observându-se chiar și un număr mare de celule înmugurite (Figura 17a).

(a) (b)

Fig. 17. Interacția dintre C. krusei CMGB-Y8 și tulpina P. (K.) ohmerii CMGB-ST19: (a) C. krusei CMGB-Y8 – Martor; (b) în prezența P. (K.) ohmerii CMGB-ST19

Se remarcă faptul că această tulpină inhibă de asemenea (mai slab) și creșterea tulpinii C. albicans CMGB-Y13 atunci când temperatura de incubare este de 28⁰C. La 37⁰C activitatea antimicrobiană nu este evidențiată ceea ce indică existența a două alternative privind mecanismul de acțiune antimicrobian al acestei tulpini. Fie acțiunea antimicrobiană este dependentă de temperatura de incubare, fie inhibarea creșterii tulpinii C. albicans CMGB-Y13 la 28⁰C este rezultatul sinergic dintre acțiunea tulpinii testate și stresul indus de cultivarea la temperatură cu valoare mai mică decât cea optimă pentru o tulpină patogenă. Luând în considerare faptul că în cazul tulpinii patogene C. krusei CMGB-Y8 nu s-au observat diferențe între cele două temperaturi de incubare balanța înclină către sinergia dintre cei doi parametri menționați anterior. De altfel, aspectul culturii tulpinilor testate privind acțiunea antimicrobiană în prezența C. albicans CMGB-Y13 (Figura 16 (a)-3) reflectă faptul că prezența acestei tulpini în substrat are efectul advers, în care aceasta inhibă creșterea tulpinilor din genul Pichia. În fond, tulpinile de C. albicans ocupă primul loc în rândul drojdiilor patogene la nivel mondial având cea mai mare rată de mortalitate (Hirano și colab., 2015; Moran și colab., 2008) ceea ce presupune existența unor capacități metabolice deosebite care îi permit supraviețuirea în cele mai stringente condiții. Printre mecanismele de acțiune antimicrobiană descrise pentru tulpini aparținând speciei P.(K.) ohmerii se remarcă fie competiția pentru substrat mai exact pentru ionii de fier din mediu (fiind capabilă să sintetizeze compuși siderophore-like) fie chiar sinteza de toxine killer (Fuentefria și colab., 2006; Coelho și colab., 2009). Faptul că tulpina P.(K.)ohmerii CMGB-ST19 poate inhiba creșterea acesteia la temperatură mai mică este deosebit de important întrucât deschide noi oportunități de cercetare axate pe determinarea cu acuratețe a mecanismului implicat.

P. membranaefaciens CMGB-MT26 prezintă activitate antimicrobiană față de C. albicans ATCC10231 și C. parapsilosis CBS604 însă nu inhibă creșterea nici uneia dintre tulpinile cu caracter patogen dovedit. Spre deosebire de acestea, P. membraniefaciens CMGB-ST53 nu prezintă activitate antimicrobiană la valori scăzute de pH (Figura 16).

Dintre tulpinile din genul Pichia testate privind potențialul anti-Candida s-a remarcat tulpina P.(K.) ohmerii CMGB-ST19 care, deși este izolată de pe suprafața petalelor de trandafir (Rosa damascena), a dovedit faptul că deține proprietăți metabolice deosebite care o recomandă pentru studii aprofundate privind potențialul biomedical.

4.3. Studii de ameliorare a potențialului antimicrobian al tulpinilor din genul Rhodotorula

Activitatea antimicrobiană a tulpinilor din genul Rhodotorula se bazează în principal pe competiția pentru substrat (prin intermediul unor compuși siderophore-like dintre care face parte și acidul rhodotorulic) și sinteza pigmenților carotenoizi, motiv pentru care au fost realizate mai multe teste pentru a determina capacitatea tulpinilor de a inhiba creșterea unor tulpini patogene și potențial patogene aparținând genului Candida în diferite condiții de cultivare.

4.3.1 Adaptarea la șoc termic

Mai multe studii realizate în ultimul deceniu a relevat faptul că expunerea celulelor de drojdie la condiții ușoare spre moderate de stres induce creșterea toleranței față de alte surse de stres și implicit față de factorul inițial (Dhar și colab., 2013). Organismele, la modul general, sunt supuse influenței condițiilor de mediu în mod constant ceea ce determină adaptarea mecanismelor de rezistență deja existente față de acțiunea dăunătoare a factorilor de stres și chiar dobândirea unor mecanisme noi. Primul mecanism la care se face referire este creșterea nivelului de expresie a genelor implicate în rezistența la diferite condiții de stres (Possas și colab., 2000), iar cel de-al doilea este reprezentat de o cross-imunitate caracteristică tulpinilor care de-a lungul dezvoltării lor au fost expuse în mod constant la un anumit factor de stres iar calea metabolică implicată în rezistența față de acest factor are elemente comune cu cele caracteristice răspunsului față de alte categorii de factori. Un exemplu în acest caz este întâlnit în cazul tulpinilor de P. kudriavzevii (I. orientalis) care atunci când sunt expuse la condiții de stres osmotic indus de concentrații mari de săruri în mediu printr-un mecanism de cros-imunitate dobândesc și o rezistență temporară la variația pH din mediul de cultură (Matshusika și colab., 2016). Un al treilea mecanism implicat este capacitatea tulpinilor microbiene de a anticipa apariția unei surse de stres corelate cu cea inițială la care au fost expuse. Acest fenomen a fost descris cu precădere la microorganisme patogene aparținând atât speciilor bacteriene cât și fungice dar și în cazul celor industriale. De exemplu în cazul unor specii de drojdii utilizate în producerea vinului, concomitent cu creșterea nivelului de expresie a genelor implicate în rezistența la șoc termic sunt activate și genele implicate în rezistența la stres oxidativ care în ordinea cronologică a producției vinului apare după creșterea temperaturii (Dhar și colab., 2012).

Aceste mecanisme sunt deosebite reflectând capacitatea microorganismelor de a se adapta la condițiile de mediu însă au o valoare inestimabilă pentru utilizarea lor în procese biotehnologice. Cunoscând și înțelegând mecanismele de adaptare se pot optimiza parametrii de cultură pentru a crește capacitatea microorganismelor de a produce diferiți compuși de uz biotehnologic.

În continuare studiul nostru se axează pe acest subiect, fiind menit să evalueze gradul de influență a stresului termic asupra capacității antimicrobiene a tulpinilor de Rhodotorula expuse timp de 30 minute la 40⁰C. Validarea rezultatelor s-a realizat comparând activitatea antimicrobiană a celulelor expuse la șoc termic cu cea intrinsecă (a celulelor cultivate în condiții optime).

Tabelul 11. Efectul aplicării șocului termic asupra activității antimicrobiene a tulpinilor de Rhodotorula (mediu YPG)

Notații: „+” halou de 2-3 mm; „++” halou de 4 mm; „+++” halou de 5-6 mm; „-” lipsa haloului

Conform Tabelului 11 toate cele trei tulpini de drojdie analizate au prezentat activitate antimicrobiană față de C. krusei CMGB-Y8 și C. krusei CMGB 94 după numai patru zile de incubare. De asemenea, acestea au inhibat cu succes creșterea tulpinii C. albicans ATCC10231. În cazul tulpinii patogene C. albicans CMGB-Y13 activitatea a fost semnificativ mai redusă fiind înregistrată doar în cazul tulpinii R. glutinis CMGB189 și Rhodotorula sp. CMGB-G1.

De asemenea, se remarcă faptul că tulpina Rhodotorula sp. CMGB-G1 inhibă și creșterea tulpinii patogene C. parapsilosis CMGB-Y3 însă nu prezintă activitate față de tulpina de laborator C. parapsilosis CBS604. În plus, se constată că nu apar diferențe semnificative între probele expuse la șoc termic și cele din control. Ca urmare, se poate presupune că activitatea antimicrobiană a tulpinilor de Rhodotorula testate este intrinsecă (datorată sau nu sintezei de carotenoizi) și că nu este influențată în mod direct de expunerea la condiții de stres (Figura 18).

Fig. 18. Influența temperaturii asupra activității antimicrobiene a tulpinilor de R. rubra CMGB188-control (A); șoc termic (A*), R. glutinis CMGB189-control (B); șoc termic (B*) și Rhodotorula sp. CMGB-G1-control (C); șoc termic (C*) după 4 zile de la incubare (mediu YPG) asupra tulpinilor:

(a) C. albicans ATCC10231, (b) Candida albicans CMGB-Y13, (c) C. krusei CMGB94,

(d) C. krusei CMGB-Y8, (e) C. parapsilosis CBS604, (f) C. parapsilosis CMGB-Y3

Conform unui studiu realizat de Cheng și colab., 2016 s-a stipulat ideea conform căreia expunerea celulelor de Rhodotorula la stres termic moderat pentru o perioadă scurtă de timp este asociată cu creșterea cantității de pigmenți carotenoizi. Așa cum am menționat anterior, un astfel de comportament este frecvent întâlnit în cazul drojdiilor folosite în procesul de fermentație alcoolică având la bază mecanismul de anticipare a acțiunii unor factori de stres. Pigmenții carotenoizi au un rol deosebit în celula de drojdie protejând-o împotriva radicalilor liberi motiv pentru care expunerea celulelor de drojdie la stres termic poate stimula producerea acestor compuși cu acțiune antioxidantă (Manimala și Murugesan, 2014). Faptul că nu se observă diferențe semnificative între cantitatea de carotenoizi produsă de celulele de drojdie din control și cele expuse la un șoc termic moderat se poate datora rezistenței sporite a tulpinilor testate față de acest tip de factor de stres. Fiind izolate din procese industriale respectiv din Marea Neagră (zona portului Constanța fiind cunoscută pentru nivelul mare de poluare maritimă determinat de traficul naval) tulpinile testate au dobândit probabil, o rezistență mai mare la temperaturi cu valoare peste 30⁰C. Cu toate acestea, rezultatul acestui studiu nu infirmă ipoteza lui Cheng și colab., 2016 fiind deci, necesară aprofundarea studiului prin creșterea timpului de expunere la temperaturi peste valoarea optimă de creștere și testarea altor factori de stres.

4.3.2 Efectul variației substratului nutritiv asupra sintezei intra- și extracelulare de acid rhodotorulic

Așa cum am menționat anterior un alt mecanism implicat în acțiunea antimicrobiană a speciilor de Rhodotorula este capacitatea acestora de a sintetiza acid rhodotorulic. Acest compus face parte din grupul compușilor siderophore-like iar sinteza acestora este direct influențată de lipsa fierului din mediul de cultură.

Prezența anumitor surse de carbon (sucroză) sau azot ((NH4)2SO4, respectiv combinația (NH4)2SO4 cu uree) și raportul dintre ele (sucroză: (NH4)2SO4 este 4:1 în mediu Rhd, respectiv, 6:1 în mediu Rhd-uree), pot influența cantitatea de acid rhodotorulic sintetizată în celulele de drojdie.

Astfel, în cadrul acestui studiu, tulpinile de interes au fost cultivate pe cele două medii specifice care promovează sinteza de acid rhodotorulic ulterior determinându-se randamentul antimicrobian al acestora față de tulpinile de Candida patogene și potențial patogene raportat la control (tulpinile crescute pe mediu YPG) (Tabel 12).

Luând în considerare faptul că acidul rhodotorulic poate fi secretat în afara celulei s-a determinat și activitatea antimicrobiană a posibililor metaboliți eliminați în mediului de cultură. Prin urmare, s-a realizat o primă analiză comparativă a activității antimicrobiene a supernatantului și a sedimentului celular.

Tabelul 12. Efectul mediului de cultură asupra asupra activității antimicrobiene a tulpinilor de Rhodotorula mediată de acidul rhodotorulic intra- și extracelular (mediu RhD)

Notații: „+” halou de 2-3 mm; „++” halou de 4 mm; „+++” halou de 5-6 mm; „-” lipsa haloului

Așa cum se poate observa în Tabelul 12 testarea activității antimicrobiene a supernatantului prelevat din culturile de drojdie crescute pe mediu Rhd a demonstrat faptul că cele trei tulpini de drojdie au capacitatea de a secreta în mediul extracelular compuși cu activitate antimicrobiană. Totuși, randamentul obținut este inferior față de cel obținut în cazul folosirii sedimentului.

Cu toate acestea, se constată că supernatantul prelevat inhibă cu succes creșterea tulpinilor de C. krusei CMGB-Y8 și C. krusei CMGB 94. Acest fapt este deosebit de important din punct de vedere biotehnologic deoarece extragerea compușilor cu activitate antimicrobiană din mediul de cultură presupune un cost mult mai redus și un timp de procesare mult mai mic.

Pe baza acestor rezultate, testele folosind mediul Rhd-uree, s-au desfășurat folosind numai sediment celular.

Tabelul 13. Efectul variației substratului nutritiv (mediului de cultură) asupra activității antimicrobiene

a tulpinilor de Rhodotorula

Notații: „+” halou de 2-3 mm; „++” halou de 4 mm; „+++” halou de 5-6 mm; „-” lipsa haloului

Conform Tabelului 13 se constată faptul că activitatea antimicrobiană a celor trei tulpini față de C. krusei Y8 se menține indiferent de mediul de cultivare utilizat, însă apar diferențe în cazul celorlalte tulpini testate ca și substrat. În cazul tulpinii R. rubra CMGB188, creșterea pe mediu Rhd inhibă activitatea antimicrobiană față de C. albicans ATCC10231 însă după șapte zile de incubare apare un răspuns slab față de tulpina patogenă aparținând aceleiași specii. De asemenea, utilizarea mediului Rhd-uree stimulează activitatea antimicrobiană față de tulpina C. parapsilosis CMGB-Y3, activitate nedecelabilă în control.

Comportamentul antimicrobian al tulpinii R. glutinis CMGB189 este de asemenea influențat de mediul de cultură. Comparând rezultatele obținute pentru cele trei medii se constată faptul că tulpina își păstrează activitatea antimicrobiană față de C. albicans ATCC, C. krusei CMGB94 și C. krusei CMGBY8 indiferent de mediul de cultură utilizat însă utilizarea mediului Rhd-uree inhibă activitatea față de tulpina patogenă de C. albicans CMGB-Y13 și facilitează activitatea antimicrobiană față de cele două tulpini aparținând speciei C. parapsilosis.

O situație similară este întâlnită și în cazul tulpinii Rhodotorula sp. CMGB-G1. Această tulpină inhibă creșterea tulpinilor C. albicans ATCC 10231, C. krusei CMGB94 și C. krusei CMGB-Y8 indiferent de mediul utilizat pentru creștere dar și în acest caz utilizarea mediului Rhd-uree inhibă activitatea față de C. albicans CMGB-Y13. De asemenea, se constată că prezența ureei în mediul de cultură ca și în cazul R. glutinis CMGB189 stimulează activitatea antimicrobiană față de C. parapsilosis CBS604. Profilul antimicrobian al celor trei tulpini în funcție de mediul de cultură și de tulpina substrat utilizate sugerează complexitatea mecanismului care stă la baza acestui comportament. Conform acestor rezultate activitatea antimicrobiană specifică acestor tulpini nu poate fi considerat doar rezultatul producerii exclusive a pigmenților carotenoizi sau al acidului rhodotorulic ci de fapt, sugerează acțiunea sinergică a acestora.

Răspunsul celulelor de Rhodotorula față de tulpinile patogene variază în funcție de mecanismele dezvoltate de tulpina cu care intră în competiție pentru ocuparea nișei ecologice. Este evident faptul că, utilizarea mediului Rhd-uree cu un raport sursă carbon: sursă azot 6:1 (sucroză: (NH4)2SO4), precum și utilizarea unuei surse de azot suplimentare (ureea), stimulează activitatea antimicrobiană a tulpinilor R. glutinis CMGB 189 și Rhodotorula sp CMGB-G1 față de tulpinile de C. parapsilosis, în timp ce mediul Rhd (sucroză: (NH4)2SO4 – 4:1) facilitează inhibarea tulpinii patogene de C. albicans CMGB-Y13.

Fig. 19. Influența mediului de cultură asupra activității antimicrobiene a tulpinilor de R. rubra CMGB188-A, R. glutinis CMGB189-B și Rhodotorula sp. CMGB-G1-C după 4 zile de la incubare (mediu RhD simplu) asupra tulpinilor: (a) C. albicans ATCC10231, (b) Candida albicans CMGB-Y13, (c) C. krusei CMGB94,

(d) C. krusei CMGB-Y8, (e) C. parapsilosis CBS604, (f) C. parapsilosis CMGB-Y3

Fig. 20. Influența mediului de cultură asupra activității antimicrobiene a tulpinilor de R. rubra CMGB188-A, R. glutinis CMGB189-B și Rhodotorula sp. CMGB-G1-C după 4 zile de la incubare (mediu RhD –uree) asupra tulpinilor: (a) C. albicans ATCC10231, (b) Candida albicans CMGB-Y13, (c) C. krusei CMGB94, (d) C. krusei CMGB-Y8, (e) C. parapsilosis CBS604, (f) C. parapsilosis CMGB-Y3

4.3.3. Evaluarea sintezei de acid rhodotorulic în prezența diferitelor medii de cultură

Evidențierea mecanismelor implicate în acțiunea antimicrobiană a celor trei tulpini luate în studiu a continuat cu evaluarea sintezei de compuși siderophore-like. Acești compuși, printre care și acidul rhodotorulic, permit chelatarea ionilor de fier și oferă tulpinii producătoare un avantaj competitiv în mediile private de acest element. Cele trei tulpini testate au fost însămânțate pe mediu YPG (control), Rhd și Rhd-U pentru a stimula producția de siderophori iar ulterior suspensiile celulare au fost însămânțate în spot pe mediu BEA (Oxoid). Acest mediu este folosit în mod curent în laboratoarele de microbiologie pentru diferențierea enterococilor care au capacitatea de a hidroliza esculina formând un derivat care leagă ionii de fier din mediu. Acest complex chimic precipită, determinând virarea culorii mediului de la galben-pal la maro închis. În acest studiu, mediul a fost folosit pentru evidențierea capacității tulpinilor de drojdie de a produce compuși chimici care pot chelata ionii de fier din mediu. Plăcile au fost monitorizate timp de șapte zile întrucât prezența sărurilor biliare în compoziția mediului poate întârzia dezvoltarea tulpinilor de drojdie.

Rezultatul pozitiv a fost indicat de apariția unui halou brun-roșcat în jurul spotului de cultură sau modificarea aspectului culturii în ceea ce privește culoarea (Figura 20) iar sinteza de compuși siderophore-like a fost evaluată utilizând raportul: DT/DC unde DT desemnează diametru total (spot cultură și halou), iar DC reprezintă diametru spotului de cultură (Tabel 14) exprimat ca medie a celor două probe lucrate.

Fig. 20. Aspectul coloniilor de drojdii prin însămânțare pe diferite medii de cultură după 7 zile

Conform Figurii 20 se poate observa faptul că atât tulpina R. rubra CMGB188 cât și tulpina R. glutinis CMGB189 produc compuși siderophore-like pe toate cele trei medii utilizate pentru creșterea acestora. Tulpina Rhodotorula sp. CMGB-G1 face notă discordantă întrucât mediul din jurul spotului de cultură a rămas neschimbat. Tabelul 15 indică faptul că, în cazul celor două tulpini de Rhodotorula capabile să producă compuși siderophore-like, cele două medii specifice pentru inducerea sintezei de acid rhodotorulic nu au avut efectul scontat înregistrându-se valori mai mici comparativ cu controlul.

Tabelul 15. Evidențierea sintezei de compuși siderophore-like în prezența diferitelor medii de cultură

Notații: „-” lipsa haloului

Aceste rezultate sugerează faptul în cazul tulpinii Rhodotorula sp. CMGB-G1 mecanismul de acțiune antimicrobiană se datorează cu precădere sintezei de pigmenți carotenoizi întrucât nici unul dintre mediile testate (Rhd și Rhd-uree) nu au influențat producerea de compuși chelatori de ioni de fier. În cazul celorlalte două tulpini există mecanismul de acțiune pare să fie dual, bazat atât pe competiția de substrat cât și pe sinteza de carotenoizi. Se remarcă totuși faptul că cele două medii utilizate pentru promovarea sintezei de acid rhodotorulic, deși au avut activitate limitată din acest punct de vedere, au stimulat activitatea antimicrobiană a celor trei tulpini în ansamblu, ceea ce ar putea sugera faptul că natura sursei de carbon sau azot are efecte puternice asupra caracterului antagonist indiferent de mecanismul pe care îl promovează.

Rezultatele prezentate mai sus indică faptul că cele trei tulpini de Rhodotorula luate în studiu prezintă potențial biomedical fiind capabile să inhibe creșterea drojdiilor patogene/cu potențial patogen analizate. Mecanismul de acțiune însă diferă în funcție de tulpina utilizată ca substrat. Cele mai bune rezultate au fost obținute față de cele două tulpini de C. krusei însă s-a remarcat faptul că pentru inhibarea creșterii unor tulpini aparținând speciei C. albicans sau C. parapsilosis este necesară cultivarea tulpinilor de Rhodotorula pe medii specifice (care să conțină sucroză ca sursă de carbon respectiv (NH4)2SO4 sau (NH4)2SO4 și uree ca sursă de azot). Deși mediile Rhd/ Rhd-uree sunt recomandate pentru stimularea producerii de acid rhodotorulic (un compus siderophore-like) conform rezultatelor obținute acestea nu au deteminat creșterea cantității produse dar au stimulat cu succes activitatea antimicrobiană față de tulpinile de C. albicans și C. parapsilosis luate în studiu confirmând faptul că potențialul anti-Candida al tulpinilor de Rhodotorula testate se datorează unui ansamblu de mecanisme care implică pe de o parte sinteza de pigmenți carotenoizi și pe de altă parte sinteza de compuși care chelatează ionii de fier din mediu (acid rhodotorulic).

4.4 Studiul activității antifungice a tulpinilor de drojdii, pentru aplicații în biocontrol

Unele tulpini de drojdii pot inhiba creșterea unor fungi ceea ce este deosebit de important pentru studiile privind utilizarea acestora în biocontrol.

Această parte a studiului era prevăzută să se desfășoare în perioada martie-mai 2020. Experimentele aveau drept scop evaluarea capacității tulpinilor aparținând speciei S. cerevisiae de a inhiba creșterea unor fungi producători de micotoxine precum: Aspergillus ochraceus, A. flavus GE2; A. flavus T11. Acest test permite nu numai selecția tulpinilor de drojdie cu potențial în biocontrol ci și indentificarea preliminară a mecanismului implicat prin analiza microscopică și macroscopică a culturii fungice afectate putându-se observa variații în morfologia sporilor sau filamentelor fungice.

Portes și colab. (2013) au evaluat antagonismul tulpinilor de drojdii killer pozitive împotriva tulpinilor de Penicillium expansum și A. ochraceus. Din totalul de 41 drojdii killer testate, 19 au prezentat capacitatea de a inhiba creșterea celor doi fungi, zona de inhibiție având dimensiuni cuprinse între 10 și 19 mm (Portes și colab., 2013). Hafsari și colab. (2011) au demonstrat că unele tulpini de Rhodotorula sp. pot controla dezvoltarea fungilor ce afectează cultura de tomate având un randament de inhibiție cuprins între 54.28 și 72.46% după șase zile de cocultivare. Serna și colab. (2009) au demonstrat că două tulpini de Debaryomyces hansenii (CYC 1021 și CYC 1244) prezintă activitate antifungică împotriva mai multor tulpini de A. ochraceus. Această activitate s-ar putea datora capacității lor de a produce o toxină killer cu activitate dependentă de concentrațiile de săruri din mediu.

Un studiu realizat de Hejri (2013) a urmărit izolarea unor drojdii saprofite izolate de pe suprafața frunzelor de fistic și determinarea activității lor antifungice împotriva unor tulpinici toxigenice de Aspergillus flavus. În totalul celor 24 de izolate, cinci tulpini au inhibat creșterea fungului A. flavus PTCC 5006. Acestea au fost identificate taxonomic ca aparținând speciilor Pseudozyma fusiformata, Cryptococcus albidus, R. fragaria, C. hungaricus și R. hinula. Testarea activității antifungice în acest studiu s-a axat pe evaluarea influenței drojdiilor de test asupra asupra sporulării, expansiunii coloniei, producției de biomasă și prevenirii producției de alfatoxină B1 (AFB1). P. fusiformata a prezentat reducerea sporulării (84,6%) precum și inhibarea producției de AFB1 (89,1%) iar C. albidus a produs reducerea greutății de masă uscată a fungului. Pe baza acestor rezultate, drojdiile saprofite izolate de pe suprafața frunzelor de fistic pot fi utilizate ca agenți de biocontrol eficienți împotriva speciilor de Aspergillus inhibând atât creșterea fungului cât și biosinteza de aflatoxine (Hejri, 2013). Numeroasele studii existente în literatura de specialitate privind activitatea antifungică a diferitelor tulpini de drojdii confirmă importanța acestor microorganisme în biocontrol.