2020 Universitatea din București Facultatea de Biologie Școala Doctorală de Biologie Teză de doctorat Coordonator științific: Prof. dr. Carmen… [626019]

2020 Universitatea din București
Facultatea de Biologie
Școala Doctorală de Biologie

Teză de doctorat

Coordonator științific:
Prof. dr. Carmen CHIFIRIUC

Doctorand: [anonimizat]

2020
Universitatea din București
Facultatea de Biologie
Școala Doc torală de Biologie

Profiluri de virulență și rezistență l a
tulpini bacteriene implicate î n infecții
asociate asistenței medicale spitalicești
și evaluarea unor noi strategii
antimicrobiene

Coordonator științific:
Prof. dr. Carmen CHIFIRIUC

Doctorand: [anonimizat]

1
CUPRINS
INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………. 3
CAPITOLUL 1 ………………………….. ………………………….. ………………………… 5
MECANISME DE PATOGEN ITATE ȘI VIRULENȚĂ …………………………. 5
1.1 EVOLUȚIA BACTERIILOR PATOGENE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 6
1.2 FACTORII DE VIRULENȚĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 7
1.3.1 Mecanisme de patogenitate la cocii Gram pozitivi de imp ortanță medicală. Genul Staphylococcus
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 8
1.3.2 Mecanisme de patogenitate la bacilii Gram -negativi, nonfermentativi de importanță medicală.
Pseudomonas aeruginosa ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 14
CAPITOLUL 2 ………………………….. ………………………….. ………………………. 18
MECANISME DE REZISTE NȚĂ LA ANTIBIOTICE …………………………. 18
2.1 REZISTENȚA NATURALĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 19
2.2 REZISTENȚA DOBÂN DITĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 19
2.2.1 Rezistența dobândită prin mutații ………………………….. ………………………….. ………………………… 19
2.2.2 Rezisten ța dobândită prin transferul orizontal de gene ………………………….. ………………………… 20
2.3 MECANISMELE MOLECULAR E ALE REZISTENȚEI MI CROORGANISMELOR LA A NTIBIOTICE …………………. 21
2.3.1 Inactivarea enzimatică a antibioticelor ………………………….. ………………………….. ………………… 22
2.3.2 Efluxul activ al antibioticelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 22
2.3.3 Rezistența prin impermeabilitate ………………………….. ………………………….. …………………………. 25
2.3.4 Modificarea mutațională a țintei antibioticului ………………………….. ………………………….. ………. 26
2.3.5 Utilizarea unei căi metabolice rezistente (de ocolire a căii metabolice inhibate) …………………… 26
2.4 FENOTIPURI DE REZISTE NȚĂ LA ANTIBIOTICE A LE MICROORGANISMELOR DE INTERES CLINIC …………… 27
2.4.1 Rezistența tulpinii de S. aureus la β -lactamice ………………………….. ………………………….. ……….. 27
2.4.2. Rezistența tulpinii de P. aeruginosa la β -lactamice ………………………….. ………………………….. … 28
2.4.3 Fenotipuri de rezistență la aminoglicoz ide ………………………….. ………………………….. ……………. 28
2.4.4 Fenotipurile de rezistență la quinolone ………………………….. ………………………….. ………………… 29
2.4.5. Rezistența S. aureus la macrolide, streptogramine, lincosamide (MLS B) ………………………….. … 29
2.4.6 Rezistența S. aureus la glicopeptide ………………………….. ………………………….. …………………….. 30
2.5 REZISTENȚA LA ANTIBIO TICE ÎN ROMÂNIA ………………………….. ………………………….. …………………… 30
CAPITOLUL 3 ………………………….. ………………………….. ………………………. 35
SISTEME PE BAZĂ DE P OLIMERI PENTRU ELIBE RAREA
CONTROLATĂ A SUBSTAN ȚELOR ANTIMICROBIENE ………………… 35
3.1 ACID POLILACTIC ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 37
3.2 ACID POLI LACTIC -CO-GLICOLIC ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 38
3.3 CICLODEXTRINE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………………. 40
CAPITOLUL 4 ………………………….. ………………………….. ………………………. 44
CONTRIBUȚII PERSONAL E ………………………….. ………………………….. ….. 44
SCOPUL ȘI OBIECTIVELE LUCRĂRII ………………………….. ………………………….. …………………………. 45

2
4.1. OBIECTIVUL 1 CARACTERIZAREA POTENȚ IALULUI DE VIRULENȚĂ AL TULPINILOR CLINICE DE P.
AERUGINOSA ȘI S. AUREUS , LA NIVEL FENOTIPIC Ș I GENOTIPIC ………………………….. ………………………….. . 46
4.1.1. Materiale și metode ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 46
4.1.2 Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 56
4.1.2.1. Evidențierea factorilor de virulență solubili ………………………….. ………………………….. …………………. 56
4.1.2.2. Demonstrarea capacității de aderență și a potențialului invaz iv ………………………….. …………………… 60
4.1.2.3. Detecția genelor care codifică expresia factorilor de virulență la tulpinile de P. aeruginosa ………….. 64
4.1.2.4. Detecția ge nelor care codifică expresia factorilor de virulență la tulpinile de S. aureus ………………… 70
4.1.3 Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 78
4.2. OBIECTIVUL 2 STABILIREA PR OFILURILOR DE REZIST ENȚĂ ALE TULPINILOR CLINICE DE P.
AERUGINOSA ȘI S. AUREUS , LA NIVEL FENOTIPIC Ș I GENOTIPIC ………………………….. ………………………….. … 79
4.2.1 Materiale și metode ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 79
4.2.2 Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 85
4.2.2.1. Determinarea calitativă a spectrului de sensibilitate la antibiotice ………………………….. ……………….. 85
4.2.2.2. Evidențierea fenotipică a mecanismelor de rezistență la antibiotice ………………………….. ………………. 86
4.2.2.3. Evidențierea genelor de rezistență la tulpinile de P. aeruginosa ………………………….. …………………… 88
4.2.2.4. Evidențierea genelor de rezistență la tulpinile de S. aureus ………………………….. …………………………. 99
4.2.3 Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 105
4.3. OBIECTIVUL 3 EVALU AREA UNOR SISTEME PE BAZĂ DE POLIMERI BIO DEGRADABILI , PENTRU
ELIBERAREA CONTROLAT Ă A UNOR SUBSTANȚE A NTIMICROBIENE ………………………….. …………………….. 106
4.3.1 Materiale și metode ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 106
4.3.2 Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 110
4.3.2.1. Sinteza complecșilor de incluziune α -ciclodextrină -capsaicină ………………………….. …………………… 110
4.3.2.2 Screeningul calitativ al proprietăților antimicrobiene ale complecșilor ………………………….. ………… 112
4.3.2.3 Analiza cantitativă a proprietăților antimicrobiene ale complecșilor ………………………….. ……………. 113
4.3.2.4 Evaluarea cantitativă a influenței complecșilor asupra aderenței microbiene pe substratul inert ……. 113
4.3.2.5 Sinteza complexului PLGA -gentamicină ………………………….. ………………………….. …………………….. 116
4.3.2.6 Analiza cantitativă a proprietăților antimicrobiene ale complexului ………………………….. …………….. 117
4.3.2.7 Evaluarea cantitativă a influenței complexului asupra ad erenței microbiene pe substratul inert …….. 118
4.3.3 Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 121
CONCLUZII GENERALE ………………………….. ………………………….. …… 122
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. …………………. 124
LISTA DE PUBLICAȚII ………………………….. ………………………….. ……… 148

3
INTRODUCERE
Succesele fără precedent ale tratamentelor cu antibiotice, la sfârșitul anilor 1960, au
dus la celebra declarație făcută de Dr. William H. Stewart:‘‘Este timpul să închidem cartea
despre bolile infecțioase și să declarăm câștigat, războiul împotriva ciumei‘‘ (Spellberg și
colab., 2008). Însă, a pariția bacteriilor patogene rezistente, în acel ași timp cu utilizarea la
scară largă a antibioticelor, au făcut ca gloanțele magice folosite să -și piardă eficacitatea ,
iar euforia victoriei să nu dureze mult. Tulpini rezistente la penicilină au fost evidențiate în
anul 1940, la scurt timp de la utiliza rea penicilinei pentru tratarea soldaților răniți în timpul
celui de -al Doilea Război Mondial (Gaynes, 2017) .
Eficiența tratamentului cu antibiotice este în scădere în ultima perioadă , din cauza
apariției și răspândirii rezistenței la antibiotice la diferi ți agenți patogeni. Acest fapt
justifică intensificarea cercetărilor pentru descoperirea de noi antibiotic e, eficace pe o
perioadă îndelungată , în special față de tulpinile rezistente . Doar 15 noi antibiotice au fost
aprobate în ultimii 20 de ani, dintre c are 4 sunt încadrate în noi clase , cu mecanisme noi de
acțiune (Simpkin și colab., 2017; OMS, 2019 ). Cu toate acestea, au fost deja izolate
bacterii rezistente (Anderson ș i colab., 2019) .
Deși o cauză importantă c are stă la baza dezvoltării mecanismelor d e rezistență este
utilizarea excesivă și nejudicioasă a antibioticelor , gene de rezistență la antibiotice s -au
evidențiat și la tulpini izolate din nișe ecologice fără a fi sub presiune a selectivă a
antibioticelor . Astfel se dovedește că rezistența la anti biotice este un proces evolutiv , iar
expunerea microorganismelor la antibiotice nu este o condiție ‖sine qua non‖ pentru
apariția rezistenței (Davies și Davies, 2010) .
În ciuda cercetărilor intense din ultimele decenii, nu a fost elaborată până acum nici
o modalitate eficientă în vederea prevenirii și controlului dezvoltării rezistenței. Bazele de
date relevă existența a mai mult de 20.000 de gene de rezistență, în aproximativ 400 de
genomuri disponibile (Liu și Pop, 2009) .
Așadar, apariția genelor de rez istență la antibiotice este dificil de evitat, fiind
necesară dezvoltarea unor metode alternative de tratament împotriva bolilor infecțioase.
Directorul general al OMS , dr. Tedros Adhanom Ghebreyesus afirma : „Niciodată
amenințarea rezistenței la substanțe antimicrobiene nu a fost mai iminentă și nevoia de
soluții mai urgentă. Numeroase inițiative sunt în curs de a reduce rezistența, dar avem

4
nevoie de acțiuni concertate transnaționale și de industria farmaceutică pentru a intensifica
și a contribui la finan țarea durabilă și la noi medicamente inovatoare.‖
În acest context, scopul acestei lucrări este de a caracteriza mecanismel e de
reziste nță și virulență la tulpini de Pseudomonas aeruginosa și Staphylococcus aureus,
două dintre speciile incluse în grupul ES C(K)APE. De asemenea, în această teză se
propune utilizarea unor sisteme de eliberare controlat ă a unor substan țe antimicrobiene,
pentru combate rea eficientă a fenomenului de multi -rezistență (MDR -multidrug
resistance ).

5

Capitolul 1
MECANISME DE PATOGENITATE ȘI VIRULEN ȚĂ
„Patogenitatea (gr. Pathos – boală, suferință; gr. Geneia – născut, produs al)
reprezintă proprietatea esențială a oricărui agent infecțios, care definește capacitatea lui de
a determina, în mod natural sau în cond iții experimentale, apariția unui proces infecțios‖
(Chifiriuc și colab., 2011).
Dintre toate speciile bacteriene existente în natură, doar un mic procent sunt
capabil e să producă infecții la organismele superioare. Dintre acestea, unele specii sunt
obliga t patogene , în timp ce altele sunt facultativ patogene. În general, interacțiunea dintre
un patogen și gazda specifică presupune parcurgerea unui proces ce se desfășoară în mai
multe etape și include o serie de condiții pe care trebuie să le îndeplinească patogenul
pentru a fi capabil să producă leziuni care să se exteriorizeze prin simptome de boală
(Mihăiescu și colab., 2007). Microorganismele care în mod normal sunt inofensive, dar pot
determina infecții la indivizi cu rezistență scăzută , sunt denumite patogeni oportuniști sau
condiționat -patogeni. Aceste bacterii nu au mecanisme eficiente în depășirea barierelor de
apărare, celulare sau umorale ale gazdei și de aceea produc infecții la persoanele
imunosupresate sau intervin ca și colonizatori secundari d upă infecții grave (Fishman,
2013) . Două dintre cele mai cunoscu te specii de agenți patogeni oportuniști sunt
Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa , cea de a doua produc ând infecții la o
gamă largă de gazde, de la plante, insecte, nematode, pînă la animale și om (Dube rn și
colab., 2015 ).
„Virulența (lb.latină virulentus =otrăvitor) se referă la capacitatea unui
microorganism patogen, aflat într -o anumită fază de creștere, de a se localiza, de a
coloniza, de a se multiplica și, eventual, de a inva da celulele și țesuturile organismului
gazdă și de a produce toxine, determinând o stare patologică la o anumită gazdă, atunci
când este introdusă în organismul acesteia, în condiții bine definite‖ ( Chifiriuc și colab.,
2011 ).
Virul ența este condiționată de mai mulți factori și exprimă cantitativ gradul de
patogenitate al unei tulpini față de organismul gazdă specific. Acești factori sunt
reprezentați de particularităț ile structurale (flageli, fimbrii , capsulă ) și fiziologice ale

6
agentului patogen (produce rea unor toxine, enzime implicate în invazie etc.) . Datorită
acestor st ructuri, agentul patogen depășește mecanismel e de apărare, celulare și umorale
ale gazdei , se adaptează, s e multiplic ă și determin ă leziuni care duc la apariția stării de
boală.
1.1 Evoluția bacteriilor patogene
Un număr relativ mic de gene determină diferențe semnificative între o bacterie
patogenă și o specie înrudită nepatogenă. Genele care contribuie la capacitatea unui
organism de a provoca boli sunt numite gene de virulență, iar structurile codificate de
aceste gene poartă denumirea de factori de virulență. Genele codificatoare pentru factorii
de virulență pot fi dobândite prin mutații punctiforme, rearanjări genomice sau pe calea
transferului orizontal de gene, fiind adesea transp ortate și de bacteriofagi (Jackson și
colab., 2011). Fenomenele de transfer și recombinare genetică completează și amplifică
arsenalul structurilor de patogenitate ale unui microorganism și conferă virulenței caracter
de tulpină.
Genele de virulență sunt f recvent grupate l a nivelul cromozomului, în așa -numitele
insule de patogenitate sau pot fi situate pe plasmide. Insulele de patogenitate sunt
reprezentate de segmente mari, distincte, de multe ori flancate prin regiuni repetitive,
compacte de ADN (până la 200 kb) transferate pe orizontală, adesea asociate cu genele
pentru ARN de transfer , care le asigură o rată înaltă de transcriere . Prezintă un conținut de
guanină și citozină diferit de cel al cromozomului bacterian și includ componente ale
elementelor gen etice „mobile‖ (secvențe de inserție, integraze, transpozaze, origini de
replicare plasmidială) (Frost și colab., 20 05). Un exemplu de insulă de patogenitate, care
contribuie la variația virulenței în tulpinile de P. aeruginosa , este familia de insule care
transportă gena exoU ce codifică proteina efectoare de secreție de tip III ExoU (Kung și
colab., 2010).
Noțiunea de evoluție a virulenței a fost emisă încă din secolul al XIX -lea de Pasteur
și Koch. O ipoteză presupune că virulența agenților patogeni evol uează în mare parte ca
urmare a unui compromis între infec țiozitate și starea gazdei (Alizon și Methot , 2018).
Alte ipoteze susțin faptul că virulența a evoluat ca răspuns la concurența dintre agenții
patogeni în interiorul gazdei. Competiția pentru resurs ele nutritive favorizează
multiplicarea mai rapidă a bacteriilor patogene și astfel crește virulența (Cressler și colab.,
2016 ).

7
1.2 Factorii de virulen ță
La prima vedere gazdele mamifere sunt nișe ecologice ca oricare altele. Cu toate
acestea, din anumite puncte de vedere sunt nișe dificil de populat datorită mecanismelor de
apărare care au fost modulate de coevoluția cu bacteriile. Aceste mecanisme de apărare
includ sistemele de eliminare mucociliare (care îndepărtează bacteriile nelegate de epitelii),
rata de turnover a celulelor epiteliale senescente, sistemele imunitare locale (producerea de
imunoglobuline, producerea de muramidaz ă, sinteza de analogi ai receptorilor specifici,
care se combină cu moleculele de aderență ale bacteriilor, neutralizându -le capacitatea de
aderență), variațiile de pH, efectul bactericid al bilei neconjugate, producerea de proteine
care leagă fierul, creând un deficit de fier pentru bacterii (Chifiriuc și colab., 2011).
Mecanismele și factorii prin care agenții patogeni au evol uat pentru a depăși aceste bariere
de apărare se numesc factori de virulență.
Unii factori de virulență au evoluat în urma unei curse de supraviețuire, deoarece se
speculează că inițial au fost utilizați pentru a paraliza organismele prădătoare unicelulare
eucariote, iar ulterior s -au adaptat în vederea invadării gazdelor animale. De fapt, unii
factori de virulență sunt încă activi împotriva microorganismelor unicelulare eucariote. De
exemplu, sistemul de secreție de tip III caracteristic speciei P. aerugin osa induce moartea
protozoarelor de tipul Dictyostelium discoideum (mucegaiul de noroi) (Kessin și colab.,
2001) și de asemenea, joacă rol important în interacțiunea cu gazdele mamifere (Matz și
colab., 2009).
Adezine le, invazine le, agresine le și impedine le sunt cele patru clase de molecule
care mediază virulența. Legarea bacteriilor la receptorii glicoproteici sau glicolipidici de pe
suprafața celulei epiteliale ale gazdei este mediată de adezinele microbiene, care
interacționează cu celulele gazdei, în sp ecial cele epiteli ale, sau indirect, cu moleculele
matricii extracelulare sau cu suprafața dispozitivelor protetice implantate . Difuz area
bacteriilor în organismul gazdei reprezintă a doua etapă a infecțiozității și este realizată cu
contribuția invazinelo r. Răspândirea infecției este indusă prin leziunile produse de agresine
în țesuturile gazdei. Impedinele sunt macromolecule care inhibă acțiunea mecanismelor de
apărare (Lazăr, 2007).

8
1.3.1 Mecanisme de p atogenitate la cocii Gram pozitivi de importan ță medicală.
Genul Staphylococcus
S. aureus este o specie larg răspândită în natură și extrem de versatilă datorită
faptului că în mod normal este prezentă în calitate de comensal pe tegument și mucoase, iar
în condițiile în care gazda prezintă un deficit sau o supresie a funcției imunitare, determină
infecții minore sau grave (Tong și colab., 2012). S. aureus reprezintă una din cele mai
importante specii bacteriene oportuniste , fiind implicată în patologia umană , producând un
spectru larg de infecții, precum: ab cese, foliculite, furuncule, endocardite, osteomielite,
septicemii fatale, meningite. Infecțiile cutanate reprezintă aproximativ 90% din totalul
infecțiilor produse de S. aureus . Cu toate acestea, infecțiile tractului respirator, sistemului
osos, sistemulu i excretor și ale sângelui sunt din ce în ce mai de temut din cauza
morbidității și mortalității ridicate și din cauza tratamentului prelungit necesar. Printre
manifestări le severe ale infecției stafilococice, se numără septicemia fulminantă, sindromul
Waterhouse -Friderichsen și pneumonia necrotică severă (Adem și colab., 2005). Factorii
asociați infecțiilor simptomatice sunt numeroși și includ virulența agentului patogen,
rezistența la antibiotice și sensibilitatea gazdei.
Sensibilitatea gazdei favorizează dezvoltarea infecțiilor prin: deficiențe de
opsonizare (hipogamaglobulinemie), leziuni ale pielii, prezența unor corpuri străine
(catetere intravenose, dispozitive protetice), infecții virale, boli cronice (neoplazii, boli
cardiace, SIDA, diabetul zaharat , alcoolism) și injectarea intravenos ă a drogurilor (Doron
și Gorbach, 2008 ).
Patogenitatea stafilococilor se datorează unui arsenal bogat de factori de virulență
care le permit supraviețuirea în macrofage, evitarea răspunsului imun al gazdei, invazia și
toxigenitatea (Figura 1).

9

Figura 1
Factorii de virulen ță prezen ți la S. aureus (după Gordon și Lowy , 2008) .
Prima etapă în inițierea infecției stafilococice o reprezintă aderența la celulele
eucariote, mediată de proteine de suprafață care recunosc în mo d specific componente ale
gazdei, în special cele relevante pentru infecțiile țesuturilor moi, cum ar fi colagen,
fibrinogen, fibronectina, laminina, elastina (Foster și colab., 2014). Magnus Hook a
introdus pentru prima dată termenul de MSCRAMMs ( microbia l surface components
recognizing adhesive matrix molecules ) pentru a descrie receptinele asociate suprafe ței
celulare , ce sunt ancorate covalent la peptidoglicanul peretelui celular. Membrii familiei
MSCRAMMs sunt reprezentați de: proteina A, proteinele de legare a fibronectinei
(FnBPs: FnbpA si Fnbp B), factorii de agregare ClfA și ClfB, proteina de legare a
colagenului și proteina de legare a sialoproteinei osului (Bpb).
Proteina extracelulară de legare a fibrinogenului (Efb), Eap ( Extracellular
adherence protein ), Emp ( Extracellular matrix binding protein ) și coagulaza fac parte
dintr -un alt grup de adezine denumite receptine secretate sau molecule de aderență
secretate ( Secretable Expanded Repertoire Adhesive Molecules – SERAMs), ce sunt
atașate necovale nt la suprafața celulei gazdă (Crosby și colab., 2016). O caracteristică
unică a receptinelor secretate este că folosesc proprietățile lor adezive nu numai pentru a
ancora celula bacteriană de celula țintă ci și de a interfera cu mecanismele de apărare ale
gazdei (Ko și colab., 2016).
Proteina A (Spa) este un factor de virulență de suprafață extrem de conservat și
prezent la majoritatea tulpinilor de S. aureus . Prezintă o specificitate crescută pentru
regiunea Fc a imunoglobulinei G cu rolul de a evita fago citoza. Consecința acestei

10
interacții este acoperirea suprafeței bacteriene cu molecule de IgG pentru a induce o
orientare incorectă și a fi recunoscute de receptorii pentru domeniul Fc de pe neutrofile
(Kobayashi și DeLeo, 2013). În plus, proteina A poate lega proteina gC1qR (prezentă pe
suprafața trombocitelor aderate) și factorul von Willebrand, o glicoproteină multimerică
care mediază aderarea plachetelor la nivelul leziunilor endoteliale (Deppermann și colab.,
2018 ). Proteina A acționează ca superantig en pentru limfocitele B prin legarea la regiunea
VH3 din domeniul Fab al IgM (Claro și colab. , 2011) .
Proteinele de legare a fibronectinei – FnBPs sunt exprimate numai în faza
exponențială timpurie de creștere. Fnbp A promovează aderența la valvele lezate ale inimii
și oferă tulpinilor de S. aureus capacitatea de a supraviețui și coloniza celulele epiteliale
(Foster și colab., 2014) .
Factorii de agregare (ClfA și ClfB) mediază prin domeniul N -terminal legarea la
fibrinogen și ulterior duc la aderarea bacter iilor la fibrinogenul imobilizat, la cheagurile de
sânge sau la biomaterialele implantate (Crosby și colab., 2016).
Proteina de legare a colagenului și proteina de legare a sialoproteinei osoase sunt
esențiale în patogeneza infecțiilor osoa se și articulare (osteomielită , artrita septică).
În urma producerii unor leziuni la nivelul țesuturilor bogate în elastină este
favorizată colonizarea cu S. aureus , prin proteina de legare a elastinei (EbpS) (Downer și
colab., 2002).
Proteina extracelulară de legare a fi brinogenului face parte din grupul receptinelor
secretate și are rolul de a inhiba agregarea trombocitelor. Prin legarea la factorul C3b,
proteina acționează ca inhibitor alosteric al activării căii clasice și alternative a
complementului (Pietrocola și colab., 2017).
Coagulaza este implicată în formarea cheagului de fibrină prin legarea la
protrombina gazdei și constituirea unui complex ce transformă fibrinogenul în fibrină.
Această receptină prezintă un rol important în blocarea accesului factorilor bacte ricizi din
plasmă și a l leucocitelor la locul infecției (McAdow și colab., 2012).
Molecula analogă cu CMH de clasă II (Map) sau proteina extracelulară de aderență
(Eap) prezintă roluri esențiale în inițierea și diseminarea infecțiilor stafilococice ,
interf erând direct în recrutarea leucocitelor, în activarea limfocitelor T și în răspunsul de
hipersensibilitate întârziată (Edwards și colab., 2012). Cu ajutorul acestor adezine
bacteriile pot invada fagocitele neprofesioniste: celule epiteliale, fibroblaste, o steoblaste,
celule endoteliale.

11
Diversitatea structural ă și func țional ă a acestor adezine contribuie la capacitatea
tulpini lor de S. aureus de a se adapta eficient la micromedii biologic e distinct e, precum
țesutul epitelial, ț esutul conjunctiv, endoteliu l vascular sau fluxul sangvin.
Polizaharidele capsulare extracelulare reprezintă factori majori în virulența
bacteriană, având rol antifagocitar.
A doua etapă a infecției este reprezentată de supraviețuirea și persistența în
interiorul celulei , pentru evitar ea sistemului imunitar al gazdei. Mediul intracelular
protejează stafilococii de mecanismele de apărare ale gazdei și de efectele bactericide ale
antibioticelor. Deși tulpinile de S. aureus sunt considerate a fi patogeni extracelulari, există
dovezi că rez ervoarele intracelulare ar contribui la persistența și recurența infecțiilor după
terapia antimicrobiană (Zautner și colab., 2010, Peyrusson și colab., 2020) .
Recent, studiile au arătat că S. aureus poate invada o varietate de celule fagocitare
neprofesio niste inclusiv keratinocite, fibroblaste, celule endoteliale, epiteliale, enterocite și
osteoblaste (Alva -Murillo și colab., 2014). Internalizarea bacteriană este posibilă datorită
fenomenului de aderență, fibronectina având rol de moleculă de legătură în tre celula
eucariotă și proteina de aderență bacteriană (Josse și colab., 2017). Ulterior, are loc
procesul de transducție a semnalului în celulele gazdei prin proteina tirozin -kinază ce
induce endocitarea bacteriei în endozom. Bacteriile internalizate părăsesc endozom ul și
supraviețuiesc în citoplasma celulei gazdă (Moldovan și Fraunholz, 2019).
Invazia și degradarea componentelor tisulare este posibilă datorită toxinelor
secretate de celulele bacteriene.
Stafilokinaza (Sak) deși este considerată o exoenz imă, este de fapt o receptină
secretată cu rol în invazia celulelor bacteriene, eficientă în formarea unui complex cu
plasminogenul. Acest complex este implicat în degradarea proteinelor matricei
extracelulare și a cheagurilor de fibrină pentru a elibera s tafilococii sechestrați în aceste
cheaguri. Un alt rol important este acela de a induce eliberarea α -defensinelor pentru a
forma un complex cu acestea și de a le inhiba aproape complet efectul bactericid (Crosby
și colab. , 2016).
Lipazele și lecitinazele a cționeaz ă asupra lipidelor plasmatice degradându -le pentru
a forma pori în membrana celulelor gazdă , dar și asupra celor tegumentare și bactericide.
S. aureus secretă enzime implicate în hidroliza proteinelor cum sunt: serin -proteaza
stafilococică, aureoli zina, stafopaina și proteaza SspB (Kolar și colab., 2012) . Trecerea de

12
la stadiul 1 al colonizării, respectiv aderență , la invazie se presupune că este datorată
existenței serin proteazei stafilococice care degradează anumite adezine.
Hialuronidaza dup ă cum reiese din denumire , distruge acidul hiarulonic,
component principal al matricei extracelulare din țesuturile umane. De asemenea , aceast ă
exoenzim ă are o capacitate limitat ă de a degrada condroitina și condroitin suflatul (Hart și
colab ., 2013) .
Nucleaze le sau DN -azele sunt fosfodiesteraze termorezistente ce pot hidroliza atât
molecula de ADN , cât și cea de ARN, însă cu o afinitate mai mare pentru ADN.
Majoritatea tulpinilor secret ă un grup de citotoxine care include patru hemolizine
distinct e antigenic , ce au capacitatea de a genera substan țe nutritive prin distrugerea
țesutu rilor gazdei și, astfel, favorizează dezvoltarea bacteriilor și cre șterea riscului
infecțiilor invazive.
α-toxina, specifică tulpinii S. aureus este prototipul pentru clasa de citotox ine mici
formatoare de pori în celulele eucariote. Toxina este secretată ca monomer solubil în apă,
capabilă să se lege și să formeze o structura heptamerică pe membrana celulei gazda
(Figura 2 ). Această transformare moleculară are ca urmare perforarea mem branei și
formarea unui por în bistratul lipidic al celulei e ucariote pentru a permite fluxul de Ca2+,
K+, ATP și molecule cu masă moleculară mică. Pătrunderea Ca2+ în celulă stimulează
hidroliza fosfolipidelor membranare, metabolismul acidului arahidonic și determină
eliberarea factorilor procoagulanți. Eritrocitele de berbec și de iepure s -au dovedit a fi
foarte sensibile la acțiunea α -hemolizinei în comparație cu hematiile umane (Berube și
Wardenburg, 2013) . În 1964, Siegel si Cohen au demonstrat că α -toxina produce agregarea
plachetelor umane la o concentrație sublitică. De atunci, s -a dovedit că α -toxina poate
intoxica o gamă largă de tipuri celulare umane inclusiv celule epiteliale, celule endoteliale
și o serie de celule hematopoietice incluzând limfo citele T, monocite, macrofage,
neutrofile (Vandenesch și colab. , 2012) .

13

Figura 2
Structura α -toxinei. Structur ă realizat ă prin cristalografie cu raze X . Preluat ă din RCSB Protein Data Bank
(PDB, 7AHL) și editat ă folosind programul VMD. Se poate observa regiunea de intrare în por, regiunea de la
interfa ța membrane i și regiunea transmembranar ă (Song și colab., 1996 ).

β-hemolizina este o sfingomielinază și produce liza eritrocitelor de berbec
neafectând hematiile de iepure și pe cele umane ( Vandenesch și colab., 2012), probabil
datorită conținutului diferit în sfingomielină.
Leucocidina Panton -Valentine este o toxină sinergohimenotropică, ce formează
pori în membranele celulare ale neutrofilelor și macrofagelor. Efectele sale toxice rezultă
din acțiunea si nergică a două exoproteine distincte, LukS -PV și LukF -PV (Shallcross și
colab. , 2013) . Pe lângă rolul de a forma pori ce duc la liza fagocitelor umane, leucocidina
poate activa mai multe tipuri de celule, inclusiv cele care nu sunt sensibile la activitatea
litică, precum celulele murine (Alonzo și Torres, 2014 ).
-hemolizina este o peptid ă (26 AA) amfifil ă, cu o structur ă de α -helix. Trei
mecanisme diferite au fost propuse pentru a explica activitatea hemolitic ă: (i) se leag ă la
suprafa ța celule lor pentru a forma pori transmembranari; (ii) se leag ă la suprafa ța celulei și
afecteaz ă membrana , produc ând o destabilizare în structura acesteia; (iii) în concentra ție
ridicat ă, acționeaz ă ca un detergent prin faptul c ă solubilizeaz ă membrana (Verdon și
colab., 2009 , Vandenesch și colab., 2012 ).
În plus față de efectele imunologice ale toxinelor hemolitice, alte proteine
stafilococice activează limfocitele T și B și numeroși alți efectori imunitari. Printre acestea
se numară superantigenele (TSST -1, SEs) care activează limfocitele T, legându -se la o
regiune specifică variabilă a lanțului β al receptorului T celular. Celulele T activate,
eliberează citokine proinflamatorii (TNF -α, IL -6, INF -γ) ce mediază starea de soc toxic și
leziunile tisulare (Parker și Prince, 2012) . Superantigenele induc un răspuns imun masiv

14
prin legarea încrucișată a receptorului T celular cu molecula CMH de clasă II de pe celula
prezentatoare de a ntigen (Lin și Peterson , 2010).
Toxina sindromului de șoc toxic (TSST -1) și enterotoxina stafilococică (SEs)
prezintă trei proprietăți biologice comune: pirogenitatea, superantigenitate și capacitatea de
a amplifica efectele letale ale endotoxinelor. Aceste exotoxine prezintă proprietăți
suplimentare cum ar fi: TSST -1 are abilitatea de a trav ersa mucoasele și de a induce
recurența artritelor bacteriene, iar SEs manifestă tropism față de mucoasa intestinală, fiind
cauza frecventă a intoxicațiilor alimentare (Spaulding și colab., 2013 ).
Sindromul pielii opărite (boala Ritter sau impetigo bulos l ocalizat ) este produs de
toxinele exfoliative -superantigene serin proteaze cu specificitate de substrat care recunosc
în mod selectiv și produc hidroliza proteinelor din stratul granulos al pielii (Bukowski și
colab., 2010) .
1.3.2 Mecanisme de p atogenitate la bacilii Gram -negativi, nonfermentativi de
importan ță medical ă. Pseudomonas aeruginosa
P. aeruginosa este o bacterie patogenă oportunistă, versaltilă metabolic, prezentă
într-o multitudine de habitate biotice si abiotice . În cadrul acestor nișe ecologic e, P.
aeruginosa poate coloniza multe organisme diferite cum sunt drojdiile, nematode le ca
Caenorhabditis elegans , insecte le, plante le și mamifere le. De la descoperirea sa inițială la
sfârșitul secolului al XIX-lea, bacteria Gram negativă P. aeruginosa a câștigat un loc
notoriu în lista agenților patogeni umani. E ste considerat ă cauza principală a infecțiilor
acute ( infecțiile dobândite în unitățile de îngrijiri medicale , pneumonii, infecții ale tractului
urinar, infecții ale plăgii) și a infecțiilor cronic e (infecțiile respiratorii la persoanele cu
fibroză chistică). Versatilitatea metabolică, rezistența la antibiotice, intrinsecă și dobândită,
formarea biofilmelor și producerea multiplilor factori de virulență fac ca P. aeruginosa să
fie un agent patogen d e temut. Cheia prin care tulpina de P. aeruginosa posedă capacitatea
de a prospera într -o diversitate atât de mare de nișe, constă în prezența numeroaselor insule
genomice care conferă tulpinilor trăsături adaptative.
Patogenitatea oportunistului P. aerugi nosa este dată de numeroșii factori de
virulență cu rol în aderență, colonizare, invazie și evitarea mecanismelor de apărare ale
gazdei ( Tabelul 1).

15
Tabelul 1.
Activit ățile biologice ale factorilor de virulen ță prezen ți la P. aeruginosa (după Chifir iuc C., 2011)

Aderența bacteriană este primul pas critic și implică interacțiunile complexe
formate între adezinele bacteriene și receptorii de pe suprafața celulelor gazdă.
Fimbrii (pili de tip IV) sunt importanți factori de virulență cu rol în aderența și
colonizarea celulelor epiteliale eucariote. Extinderea și retracția pililor ajută la deplasarea
bacteriilor pe suprafețele celulare. Diferite glicosfingolipide funcționează ca receptori ai
membranei celulelor epiteliale pen tru adezinele piliare (Bucior și colab. , 2012) . Tulpinile
mucoide produc exopolizaharide care formează matricea biofilmelor. Biofilmele reprezintă
un mod de aderență și protecție împotriva fagocitelor, a anticorpilor și a proteinelor
complementului. Aceste comunități sesile sunt distincte din punct de vedere fiziologic de
analogii lor planctonici. Biofilmele sunt responsabile pentru multe infecții persistente și
cronice, cauzate de rezistența lor la agenții antimicrobieni (Leid și colab. , 2005) .
Virulența t ulpinilor de P. aeruginosa este mediată și prin producerea unei game
largi de proteaze extracelulare, proteine solubile și pigmenți. Elastaza și proteaza alcalină
(colagenaza) sunt metaloproteaze care pot degrada o varietate de molecule de apărare ale
gazd ei. Elastaza prezintă capacitatea de a distruge componentele complementului,

16
citokinele, IgA, IgG, lizozimul și proteinele surfactant A și D ale căilor respiratorii umane
(Andrejko, 2012). Proteaza alcalină inhibă formarea fibronectinei producând liza aces teia.
Elastaza împreună cu proteaza alcalină, distrug structurile de susținere ce conțin
fibronectină și elastină, pe lângă acest rol sunt responsabile și de inactivarea IFN -γ și TNF.
Citotoxina induce formarea porilor în majoritatea celulelor eucariote. C itotoxinele
alături de hemolizinele (fosfolipaza C și lecitinaza) ce distrug lipidele și lecitina, sunt
implicate în invazia tulpinilor de P. aeruginosa .
P. aeruginosa secretă un număr mare de exoproteine ce au rol important în procesul
infecți os. Printre aceste proteine, exotoxina A este considerată cea mai toxică substanță
produsă (doza letală este de 0,2 µg/animal prin injectare intraperitoneală la șoareci) și din
acest motiv este adesea menționată ca fiind factorul de virulență cel mai puternic al aces tui
organism. Exotoxina A este un puternic inhibitor al sintezei proteice și prin acest
mecanism are posibilitatea de a acționa asupra unui număr mare de celule inclusiv asupra
celulelor sistemului imunitar (Shapira și Benhar , 2010, McEwan și colab., 2012) . Studiile
efectuate de Holt și Misfeldt (1984) au arătat că exotoxina A are efect modulator asupra
răspunsului imun umoral datorită proprietății de a induce schimbări în compoziția
limfocitelor .
Exotoxina este o mono -ADP -riboziltransferază ce prezintă ace lași mecanism
biochimic de acțiune ca cel al toxinei difterice, adică inactivează factorului 2 de elongare a
sintezei proteice și ulterior induce moartea celulei, prin atașarea covalentă a unei grupări
ADP -ribozil din structura moleculei de NAD+ (Simon și colab., 2014 ).
Recent, s -a identificat rolul exotoxinei A în suprimarea fluxului pasiv de calciu din
reticulul endoplasmic, deoarece poate pătrunde în celulele umane prin transport retrograd,
astfel inhibându -se și exportul peptidelor imunogene prin transl ocon din reticul în citosol
(Schauble și colab., 2013).
P. aeruginosa injectează cele patru toxine ExoS, ExoT, ExoU și ExoY direct în
citosolul eucariocitelor țintă prin aparatul secretor de tip III (Figura 3) . Toxinele
translocate sunt activate de cofacto ri specifici ai celulei eucariote. În urma activării, ExoS
prezintă acitivitate de ADP -ribosiltransferază , în timp c e ExoT deț ine acti vitate de ADP –
ribosiltransferază și de proteină activatoare a GTPazei (GAP). ExoU activat are activitate
de fosfolipază A2 , iar ExoY prezintă activitate de adenilat ciclază (Sawa și colab., 2014) .

17

Figura 3
Sistemul de secreție de tip III (după Sawa și colab., 2014)
Proteazele, elastaza, hemolizina și exotoxina A distrug țesuturile organismului
gazd ă prin afectarea func țiilor imunoglobulinelor, proteinelor complementului și
fibronectinei , favoriz ând astfel invazia tulpinii P. aeruginosa .

18

Capitolul 2
MECANISME DE REZISTENȚĂ LA ANTIBIOTICE
Evoluția rapidă a agenților patogeni a permis dezvoltarea la fel de rapidă a
rezistenței la antibiotice. Rezistența este ‘‘capacitatea unui organism de a supraviețui și de
a se multiplica în prezența unui nivel ridicat al unui agent antimicrobian‘‘ (Mihăiescu și
colab., 2007). Apari ția rezisten ței la un medicament a fost o amenin țare constant ă, încă de
la începutul erei descoperirii antibioticelor. Decalajul î ntre in troducerea unui nou antibiotic
în tratamentul clinic și apari ția rezisten ței la acel antibiotic este de doar c âțiva ani. De
exemplu, tulpini de S. aureus rezistente la p enicilin ă au fost izolate doar dup ă doi ani de la
introducerea antibioticului pe pia ță (Fair și Tor, 2014).
Există patru strategii generale prin care un agent patogen poate dezvolta
antibiorezistență: modificarea moleculei țintă a antibioticului, producere a de enzime care
distrug medicamentul , impermeabilitatea învelișurilor celulare pentru antibiotice și
pomparea activă a medicamentului în afara celulei bacteriene.
Odată ce o specie patogenă a descoperit o strategie eficientă de a fi rezistentă la
acțiunea unui anumit antibiotic, genele nou -dobândite sau mutante sunt transferate la toate
bacteriile aparținând speciei patogene respective sau chiar din specii diferite. Uneori genele
ce conferă rezistență la antibiotice apar prin mutații spontane ca urmare a e xpunerii
repetate la antibiotic. În alte cazuri sunt dobândite prin transfer orizontal de gene mediat de
transpozoni sau plasmide replicative. Consumul excesiv de antibiotice poate duce la o
microbiotă normală rezistentă care poate transfera rezistența spe ciilor patogene care
colonizează diferite situsuri în organism.
Antibioticele sunt utilizate abuziv și în agricultură sau ca aditivi alimentari pentru a
menține sănătatea animalelor. Un antibiotic înrudit cu vancomicina a fost adăugat în hrana
vitelor, re zultatul fiind selectarea unei microbiote normale rezistente ce reprezintă o sursă
de bacterii rezistente la vancomicină ( Wijesekara și colab., 2017).
Un fenotip de rezisten ță la antibiotice poate fi o trăsătură intrinsecă sau dobândită
prin transferul pe orizontală al genelor ori prin mutațiile produse spontan.

19
2.1 Rezisten ța natural ă
Rezistența intrinsecă reprezintă rezistența la terapia cu antibiotice, a tuturor
membrilor unei specii bacteriene și este dată de trăsăturile fiziologice pre -existente ale u nui
microorganism. Rezistența naturală se manifestă chiar și la doze maxime de antibiotic,
doze care în mod normal ar distruge alte specii bacteriene (Davies, 2010) .
Membranele celulare bacteriene constituie o barieră semipermeabilă selectivă ce
pot oferi , în principal bacteriilor Gram negative, protecția față de compușii nocivi din
mediul extracelular. Pentru a preveni acumularea intracelulară de compuși toxici, bacteriile
pot avea și pompe de eflux constitutive, care elimină moleculele din celulă printr -un proces
ce nu necesită modificarea sau degradarea medicamentului. De exemplu, P. aeruginosa
prezintă proprietatea intrinsecă de a fi rezistent la cloramfenicol și tetracicline datorită
sistemelor de eflux MexAB/MexXY (Morita și colab., 2014).
Peretele pe ptidoglicanic gros și relativ rigid al bacterilor Gram pozitive nu oferă
protecție faț ă de antibiotic, deoarece este ț inta cea mai facilă a antibioticelor bactericide.
2.2 Rezisten ța dob ândită
Dobândirea rezistenței presupune modificarea bacteriilor iniția l sensibile la un
antibiotic prin achiziționarea de material genetic nou (plasmide, transpozoni, integroni,
ADN simplu, etc.) sau pr in inducerea mutații lor. Toleranța față de antibiotice este un
caracter fenotipic corelat cu o alterare a materialului genet ic (Sultan și colab., 2018).
2.2.1 Rezisten ța dob ândită prin muta ții
Apariția spontană a mutațiilor datorate erorilor sintezei moleculei de ADN, induce
o variabilitatea fenotipică care ajută la evoluția speciilor bacteriene și le permite să se
adapteze la presiunile exercitate de mediul înconjurător. Inițial, s -a presupus că rezistența a
fost dobândită prin mutația spontană, însă pentru obținerea rezistenței este nevoie de o rată
crescută de evenimente mutaționale. Datorită faptului că bacteriile se multipl ică rapid,
exprimarea rezistenței are loc relativ repede într -o populație, chiar dacă rata mutațiilor nu
este crescută. În momentul în care gena de rezistență dobândită prin mutație a fost
stabilizată, aceasta poate fi transmisă pe verticală. În condiții nefavorabile de mediu, d in
cauza prezenței unor compuși toxici, bacteriile îsi măresc rata mutațiilor mai ales pentru
genele implicate în supraviețuire. Bacteriile posedă capacitatea de a -și păstra și conserva
mutațiile avantajoase, chiar dacă mecanismele d e reparare a moleculelor de ADN tind să le
corecteze (Watford și Warrington , 2020).

20
2.2.2 Rezisten ța dob ândită prin transferul orizontal de gene
Transferul pe orizontală este un mecanism important, responsabil pentru
dezvoltarea rezistenței la antibiotice în populațiile de bacterii patogene. Acest proces
presupune schimbul genetic al unor fragmente de ADN mobil, între bacteriile aparținând
aceleiași specii sau între specii diferite. Elementele genetice mobile implicate în evoluția
rezistenței la antibiotice sunt: transpozonii, integronii, plasmidele integrative și secvențele
de inserție. Principalele mecanisme genetice prin care are loc diseminarea și multiplicarea
genelor de rezistență sunt: conjugarea, transformarea și transducția (Domingues și colab.,
2012).
Cele mai simple elemente genetice mobile sunt secven țele de inser ție (SI). Aceste
elemente con țin doar gena necesar ă pentru mobilitate, flancat ă la extremit ăți de secven țe
invers repetate. SI pot avea o lungime de aproximativ 1 Kpb ( Szuplewska și col ab., 2014 ).
Când elemente le includ o serie de gene structurale implicate în transpozi ție, acestea sunt
numite transpozoni.
Transpozonii simpli conțin o genă accesorie situată central, ce codifică adesea
rezistența față de un anumit antibiotic și gene struc turale ce sunt situate la capete, flancate
de secvențe lungi, repetate. Transpozonii complecși se deosebesc de cei simpli prin faptul
că dețin atât secvențele de transpoziție cât și secvențele specifice, flancate de secvențele
invers repetitive.
Transpozon ii conjugativi sunt asemănători plasmidelor conjugative și conțin un
situs de origine a transferului și genele necesare pentru a sintetiza aparatul de conjugare.
Spre deosebire de plasmide, aceștia nu conțin o origine a replicarii și trebuie să se integrez e
într-un replicon pentru a fi menținuți. Acest replicon poate fi ADN de tip plasmidial sau
cromozomial ( Partridge și colab., 2018). Prin această proprietate transpozonii prezintă un
avantaj față de plasmide, deoarece nu este necesară o compatibilitate cu mecanismele de
replicare ale gazdei.
Integronii sunt elemente genetice ce includ componentele unui sistem de
recombinare situs -specifică care le permite să capteze și să mobilizeze gene, în special
determinanți i de rezistență la antibiotice ( Domingues și colab., 2012 ). Ei con țin o gena int
care codifică o integrază situs -specifică din familia tirozin -recombinazelor și o secvență
adiacentă de recombinare, att care recunoaște situsul specific de recombinare. Spre
deosebire de transpozoni, integronii nu sunt f lancați de secvențe repetitive și nu cuprind
gene care codifică proteine responsabile pentru mișcarea lor (Gillings , 2014).

21
Termenul de ‘‘plasmidă‘‘ a fost introdus în literatura de specialitate de Lederberg
(1952) , care a descris pentru prima dată proc esul de conjugare bacteriană. Plasmidele sunt
elemente extracromozomale și autoreplicative, care nu sunt indispensabile supraviețuirii
bacteriilor, dar de multe ori oferă anumite caracteristici, cum ar fi rezistență, virulență,
capacitatea de a metaboliza substanțe rare, persistența în condiții extreme etc. (Cury și
colab., 2018). Unele studii au analizat plasmidele dinaintea epocii antibioticelor și au
constat că plasmidele izolate din zilele noastre sunt în esență aceleași cu cele izolate în
timpul erei p re-antibioticelor (Davies J. și Davies D., 2010) .
În special plasmidele conjugative joacă rol important în evoluția bacteriilor
rezistente datorită faptului că sunt ușor de transmis prin transfer orizontal de gene (Norman
și colab., 2009) . Plasmidele care conțin gene de rezistență se numesc plasmide R. Acestea
posedă infor mația genetică ce poate codifica simultan rezistența la mai multe antibiotice.
Transmiterea acestor plasmide se poate realiza prin mai multe modalități (van Hoek și
colab., 2011) :
 Conjugar ea presupune transferul genelor de rezistență prin contactul direct
al celulei donor la celula receptor, mediat de un complex multiproteic numit aparat de
conjugare.
 Transducția presupune transportul moleculei de ADN cu ajutorul
bacteriofagilor. Fragmente de ADN bacterian sunt incluse în genomul viral, în momentul
în care particula virală infectează alte bacterii, ADN bacteriofagic este integrat și replicat
în celula gazdă.
 Transformarea presupune absorbția de ADN în celula receptor din mediul
extracelular, provenit din excreția activă sau liza celulei donor. Prin urmare, acest proces
necesită doar un destinatar viabil care să dețină un mecanism de absorbție activă a ADN
extracelular.
În urma acestor procese, în cadrul celulei receptor genele nou dobândite se pot
integra la nivelul genomului bacterian sau la nivelul materialului genetic extracromozomal .
2.3 Mecanismele moleculare ale rezisten ței microorganismelor la antibiotice
Utilizarea cu succes a oricărui agent terapeutic este compromisă deoarece rezis tența
multipl ă la medicamente (MDR) este un fenotip asociat cu tot mai mul ți patogeni. O gam ă
largă de mecanisme biochimice și fiziologice pot fi responsabile de apari ția toleran ței sau
rezisten ței fa ță de agen ții terapeutici (Fair și Tor, 2014) . Un mecani sm major implic ă

22
inactivarea agentului antimicrobian cu ajutorul enzimelor, cum ar fi β -lactamazele sau
enzimele care modific ă aminoglicozidele. De asemenea, rezisten ța poate fi indus ă și prin
muta ții care afecteaz ă ținta intracelular ă a unui antibiotic. C hiar dac ă antibioticul p ătrunde
în mediul intracelular și nu se produc schimbări la nivelul moleculei țintă, bacteriile pot
manifesta rezistență prin eliminarea activă a antibioticului din celulă.
Un alt mecanism de rezistență este indus prin limitarea păt runderii antibioticului în
celulă, ca urmare a modificărilor suprafeței celulare bacteriene (reducerea numărului de
porine). Chiar și în absența unor modificări de permeabilitate, absorbția este diminuată de
membrana externă semipermeabilă, iar acest mecan ism acționează sinergic cu alte procese
ce oferă rezistență, cum ar fi degradarea enzimatică și efluxul activ al antibioticului (van
Hoek și colab. , 2011) .
2.3.1 Inactivarea enzimatic ă a antibioticelor
Inactivarea enzimatică a antibioticelor este un mecani sm complex de rezistență
bacteriană ce se poate realiza fie prin modificare chimică (acetilare, fosforilare sau
adenilare), fie prin clivaj enzimatic. Prin acest proces se pot inactiva o gamă largă de
antibiotice. Un s pectru larg de rezistență este dat de metalo-β-lactamaze care hidrolizează
ciclul β -lactamic al penicilinelor, cefalosporinelor și carbapenemilor (Munita și Arias,
2016).
2.3.2 Efluxul activ al antibioticelor
Pentru a preveni acumularea intracelulară a compuși lor toxici, bacteriile s -au
adapta t prin evoluția unor sisteme dependente de energie pentru a pompa molecule în afara
celulei printr -un proces ce nu necesită modificarea sau degradarea agentului antimicrobian
(Costa și colab. , 2013) .
Pompele de eflux joacă un rol important în rezistența la antibiotice prin faptul că
pot acționa sinergic cu alte mecanisme de rezistență, oferind un nivel ridicat de toleranță.
De asemenea, s -a dovedit importanța lor în mai multe procese vitale: înglobarea
nutrienților esențiali, detoxifiere, homeostazie și în transmiterea semnalelor intercelulare.
Unele pompe de eflux, în special cele din familia RND, s -au dovedit a avea rol în
patogenitate, fiind implicate în colonizarea, invazia și persistența microorganismelor în
celula gazdă (Piddock, 2006).
Pompele de efux care utilizează energia provenită din hidroliza ATP poartă numele
de transportori primari de tipul ABC ( ATP-binding cassete ) iar pompele ce folosesc ca

23
sursă de energie gradientul chimic transmembranar (forța proton -motrice) sunt denumiți
transportori sec undari (Wilkens, 2015).
Transportorii secundari pot fi diviza ți pe baza omologiei de la nivelul structurilor
primare și secundare în patru familii:
o Familia moleculelor mari (MF = Major Facilitator ),
o Familia moleculelor mici (SMR = Small Multidug Resistance ),
o Familia moleculelor de rezistență -nodulare -diviziune celulară (RND)
o Familia moleculelor de rezistență multiplă și de eliminare a compușilor
toxici (MATE)
Componentele membranare ale acestor tipuri de transportori prezintă omologie în
special în jumatate a dinspre domeniul amino -terminal, ceea ce a condus la ipoteza că
această parte a proteinei este responsabilă pentru translocarea protonilor (Davidson și
colab., 2008). Jumătățile dinspre domeniul carboxi -terminal fiind mai variabile, determină
specificita tea de substrat a acestor proteine.
Familia transportorilor primari, ABC, este implicată atât în absorbția cât și în
efluxul unor tipuri diferite de substraturi, printre care se pot enumera zaharurile,
aminoacizii, ionii, antibioticele, polizaharidele și p roteinele. Aceste sisteme sunt formate
din șase regiuni transmembranare care tind să se asocieze în dimeri și două domenii care
leagă nucleotidele (Moussatova și colab., 2008, Greene și colab., 2018).
Superfamilia moleculelor mari (MF) cuprinde peste 300 d e proteine ce pot efectua
transport în sistem uniport, simport sau antiport. Proteinele MF pot avea 12 sau 14 regiuni
transmembranare. Toți transportorii MF care sunt implicați în efluxul antibioticelor,
funcționează printr -un mecanism antiport medicament: protoni (H+) (Lekshmi și colab.,
2018).
Membrii familiei SMR sunt, așa cum indică și numele, proteine mici de
aproximativ 107 -110 resturi de aminoacizi. Aceste proteine conțin patru segmente
transmembranare și formează, în general, tetrameri în membrana c itoplasmatică
(Fernández și Hancock , 2012).
Proteinele din familia MATE au o topologie similară cu proteinele din familia MF.
Cu toate acestea, ele constituie un grup diferit datorită nivelului scăzut de omologie în ceea
ce privește secvența în aminoacizi. Aceste proteine au 12 domenii trasmembranare și sunt
dependente de gradientul electrochimic al protonilor sau cel al ionilor de sodiu, pentru

24
exportul compușilor toxici, cum ar fi fluorochinolonele, aminoglicozidele și coloranții
cationici (Kuroda și Tsuc hiya, 2009).
Una din cele mai relevante familii transportoare, în contextul clinic, este familia
RND care a fost cel mai bine caracterizată la bacteriile Gram negative. Substraturile
pompelor de eflux din clasa RND sunt diverse și includ: antibiotice, bioc ide, acizi grași
toxici, săruri biliare, hidrocarburi aromatice, detergenți, lactone, coloranți. Proteinele sunt
alcătuite din 12 regiuni transmembranare și sunt, de obicei, organizate în formă trimerică.
Pompele de eflux din această familie par să funcțio neze printr -un model rotativ, în care
subunitățile individuale devin alternativ protonate și apoi cuprind și desprind moleculele de
substrat (Sun și colab., 2014). Aproape toate sistemele de eflux RND sunt capabile să
pompeze mai multe antibiotice, printr -un mecanism antiport. Cele mai studiate pompe de
eflux, din cadrul acestei familii, sunt AcrAB -TolC de la E. coli (Figura 4 ) și MexAB –
OprM de la P. aeruginos a (Anes și colab., 2015) .

Figura 4
Structurile pompelor de eflux AcrAB -TolC, preluate din RCSB Pr otein Data Bank (PDB, AcrB –codul 2GIF,
AcrA –codul 2F1M, TolC –codul 1EK9 ) și editate folosind programul VMD (după Li și Nikaido, 2009) .
Există numeroase pompe de eflux din toate cele cinci familii, care participă la
rezistența bacteriilor patogene față d e antibiotice. Se poate afirma că, prin prezența
acestora inclusiv la bacteriile patogene și nepatogene, evoluția și răspândirea lor a avut loc
independent de utilizarea generalizată a antibioticelor. De exemplu, habitatul natural al
tulpinii de E. coli este tractul gastrointestinal, unde sărurile biliare sunt într -o concentrație
semnificativă. Prin urmare, nu este surprinzător faptul că pompa RND AcrAB -TolC
prezintă afinitate mare față de sărurile biliare, indicând că acestea ar putea constitui
substratul său natural. Pe lângă acest rol, care facilitează colonizarea tractului, AcrAB
conferă celulelor de E. coli rezistența la antibiotice (Li și Nikaido, 2009) .

25
2.3.3 Rezisten ța prin impermeabilitate
Membrana celulei bacteriene este o barieră semipermeabilă, e ficientă împotriva
substanțelor prezente în mediul extracelular. Pentru a intra în celulă, antibioticul poate să
depășească această barieră prin mecanisme diferite, în funcție de tipul de agent
antimicrobian. Calea principală de intrare, pentru antibiotice le hidrofile este prin canalele
umplute cu apă, formate în membrana externă. Prin urmare, numărul și tipul de porine
deținut de o celulă, va determina permeabilitatea și sensibilitatea sau rezistența la
antibiotice a unui microorganism. De exemplu, P. aeruginosa posedă o permeabilitate
scăzută a membranei, care stă la baza rezistenței intrinseci la mai multe antibiotice. Astfel,
mutațiile care afectează expresia și funcția porinelor, au un impact direct asupra
sensibilității bact eriilor la antibiotice (F igura 5).
În general, mutațiile care duc la pierderea sau modificarea porinelor influențează
rezistența, prin limitarea cantității de antibiotic care poate pătrunde în celulă și, astfel,
interferă cu mecanismele secundare de rezistență (pompele de eflux, enzi mele de degradare
etc.). Mutațiile porinelor pot induce, în special, rezistența la β -lactamice, fluoroquinolone,
tetracicline și cloramfenicol. Atunci când rezistența este dobândită prin acest mecanism,
utilizarea compușilor care pot crește permeabilitatea membranei externe (antibioticele
policationice) ar facilita penetrarea antibioticului în celula bacteriană și astfel, ar crește
sensibilitatea.

Figura 5
Exempl ificarea impactului muta țiilor porinelor asociate cu dob ândirea rezisten ței la antibiotice (după
Fernandez și Hancock , 2012) .

26
2.3.4 Modificarea muta țional ă a țintei antibioticului
Ribozom ii sau enzime specifice sunt ținte pentru multe antibiotice utilizate în
tratamentul infecțiilor bacteriene. Antibioticele care inactivează ribozomii bacterieni sunt
tetraciclinele, cloramfenicol, macrolidele și lincosamidele. Rezistența dobândită față de
antibioticele care leagă ribozomii, se manifestă în primul rând prin modificarea țintei
antibioticului. Cel mai comun determinant care le conferă rezistența față de macrolide și
lincosamide, este grupul genelor care codifică metilaze, cum ar fi erm (metilaza rezistentă
la eritromicină). Metilazele induc rezistența la nivel înalt față de antibiotice, prin transferul
unei grupări metil la o adenin nucleotidă specifică dintr -o subunitate ARNr 23S la o
subunitate 50S a ribozomului (Munita și Arias, 2016). Prin acest mecanism, este blocată
legarea antibioticului la ribozom.
Rezis tența la β -lactamice este o problemă majoră și s -a produs prin achiziționarea
unor gene ce codifică β -lactamazele. În cazul tulpinilor de S. aureus , s-a răspândit
rezistența la β -lactamice prin sinteza unei proteine de legare a penicilinei cu afinitatea mu lt
mai mic ă, PBP2a, codificată de mecA (Fishovitz, 2014).
2.3.5 Utilizarea unei c ăi metabolice rezistente (de ocolire a c ăii metabolice inhiba te)
Rezistența față de antibiotice poate fi obținută și prin producția unei concentrații
intracelulare crescute de enzime țintă sau prin obținerea enzimei pe o cale alternativă. În
acest caz, structura enzimei țintă nu suferă modificări și celulele pot supraviețui în prezența
antibioticului (Egorov și colab., 2018). Cel mai bine caracterizat exemplu, este calea
metabo lică în care creșterea concentrației enzimei dihidrofolat reductaza induce rezistența
la biseptol . Rezistența față de trimetoprim ofera un exemplu de evitare a căii metabolice
inhibate ( Fernández -Villa și colab., 2019). Astfel, se produce proteina țintă în tr-o
concentrație adecvată pe o cale alternativă.
Expresia pompelor de eflux este deseori supusă inducției de molecule mici
(antibiotice, biocide, săruri biliare, inclusiv substraturile pompelor) pentru a se evita
supraproducția constitutivă a proteinelor, în absența agentului chimic. Sinteza celor mai
multe pompe de eflux este reglată la nivelul transcrierii și traducerii (Li și Nikaido ., 2009).

27
2.4 Fenotipuri de rezisten ță la antibiotice ale microorganismelor de interes clinic
2.4.1 Rezisten ța tulpinii de S. aureus la β-lactamice
Penicilinele împreună cu cefalosporinele, sunt cele mai importante antibiotice β –
lactamice utilizate la scară largă în tratamentul clinic. În 1928, în timp ce studia speciile de
Staphylococcus , Alexander Flemming a observat că pr in contaminarea culturilor sale cu un
fung, s -a produs liza celulelor stafilococice. De la apartenența mucegaiului la genul
Penicillium , Flemming a numit substanța antimicrobiană, penicilină.
Rezistența la β -lactamice se poate realiza prin trei mecanisme: permeabilitatea
diminuată a membranei externe, modificarea țintei (reducerea afinitații proteinelor de
legare a penicilinei), inactivarea antibioticului prin hidroliza enzimatică a nucleului β –
lactamic mediată de expresia genelor blaZ și omologii săi (Gala n și colab. , 2013) .
Exprimarea genelor mecA, ce sintetizează o proteină cu afinitate mai mică de
legare a penicilinei (PBP 2a), este produsă de prezența unui antibiotic β -lactamic. În
absența unui β -lactam, genele de rezistență blaZ și gena ce codifică PBP 2a – mecA, sunt
controlate de represorii BlaI, respectiv MecI. Când este prezent, β -lactamul se leagă la
molecule transmembranare de transmiterea semnalului – BlaRI și MecRI, ceea ce induce
clivajul autocatalitic al domeniului C -terminal din structura ace stor transductori. În urma
clivării, se eliberează un domeniu care conține metaloproteaze ce scindează represorii BlaI
și MecI, în acest fel având loc sinteza β -lactamazei și a PBP 2a (F igura 6 ) (Safo și colab.,
2005).

Figura 6
Sistemele de reglare care controleaz ă exprimarea β -lactamaz ei și PBP 2a (după Wilke și colab., 2004) .
NOTA : Săgețile punctate reprezint ă expresia genelor. Structurile tridimensionale au fost preluate din PDB
(BlaI -cod 1OKR, β -lactamaza – cod 1M6K, PBP 2a – cod 1MWR). BlaI se leag ă la regiunea operator, astfel
încât să represeze transcrierea ARN , atât pentru blaZ, cât și pentru blaR1 -blaI; legarea penicilinei la BlaR1
stimuleaz ă activarea autocatalitic ă a BlaRP; BlaR1 cliveaz ă BlaI în fragmente inactive , permi țând transcrierea
blaZ și blaR1 -blaI; β-lactamaza –enzim ă extracelular ă, codificat ă de blaZ, hidrolizeaz ă ciclul β -lactamic al
penicilinei, inactiv ând-o.

28
PBP 2a confer ă rezisten ța la meticilin ă, din acest ă cauză tulpinile poart ă denumirea
de MRSA ( S. aureus meticilino -rezistent) . Tulpinile de S. aureus rezistente la meticilina,
prin modificarea PBP , sunt adesea rezistente și la aminozide, fluoroquinolone, macrolide,
lincosamide, ketolide, fosfomicin ă și uneori la rifampicin ă (Chancey și colab. , 2012) .
2.4.2 . Rezisten ța tulpinii d e P. aeruginosa la β-lactamice
Mecanismul cel mai r ăspândit de rezisten ță față de antibioticele β -lactamice , este
mediat de penicilinaze precum TEM, SHV, PER, VEB sau derivate din familia BLSE.
Enzimele de tipul penicilinazelor, BLSE, cefalosporinazelor și cabapenemazelor co nferă
rezisten ța la peniciline, oxaciline, cefalosporine și aztreonam , inducând sensibilitate la
ceftazidim, cefepim, imipenem, carbapenem și la inhibitori de β -lactamaz ă.
Rezisten ța dob ândită neenzimatic este realizat ă cu ajutorul defic itului în porine,
permeabilit ății diminuat e, modific ării țintei antibioticelor și prin sistemele de eflux. P.
aeruginosa conține 10 sisteme RND din care 3 sisteme: MexAB -OprM, MexCD -OprJ,
MexEF -OprN, sunt implicate în efluxul β -lactamicelor (Dreier și Rugg erone, 2015) .
Rezisten ța natural ă la carboxipeniciline și aztreonam este dat ă de pompa de eflux MexAB –
OprM a c ărei expresi e este modulat ă de prezen ța represorului mexR și antirepresorul
AmrR. Exprimarea MexCD -OprJ este reglat ă de represorul NfxB. Muta țiile suferite de
NfxB duc la producerea în exces a pompelor MexCD -OprJ și la o sc ădere în sinteza
pompelor MexAB -OprM. Controlul expresiei pompei MexEF -OprJ este realizat de
reglatorul MvaT. Eliminarea genei mvaT duce la cre șterea rezisten ței față de cloramfen icol
și norfloxacin , dar induce o sensibilitate m ărită față de imipenem (Nehme și Poole, 2005 ,
Lister și colab., 2009 ).
2.4.3 Fenotipuri de rezisten ță la aminoglicozide
Au fost eviden țiate mai multe mecanisme de rezisten ță la aminoglicozide: eflux
activ, scăderea permeabilit ății, modificarea țintei antibioticului, inactivarea
aminoglicozidelor s au combina ții ale acestor mecanisme.
Mecanismul principal folosit de speciile stafilococice împotriva aminoglicozidelor,
constă în modificarea enzimatic ă a acestora . Enzimele implicate sunt clasificate în trei
grupe majore, în func ție de modificare a produsă : AAC (aminozid acetiltransferaz ă), ANT
(aminozid nucleotidiltransferaz ă), APH (aminozid fosfotransferaz ă). Fenotipul rezistent la
kanamicin ă, amikacin ă, isepamicin ă, tobramicin ă, gentamicin ă și netilmicin ă este dat de

29
prezen ța unei enzime bifunc ționale, AAC 6‘-APH 2‘‘, care poate acetila și fosforila
secvențial aceste antibiotice (Beceiro și colab. , 2013) .
Cel mai frecvent mecanism de rezistență , utilizat de s peciil e de P. aeruginosa este
cel de impermeabilitate.
2.4.4 Fenotipurile de rezisten ță la quinolone
Rezisten ța stafilococilor la quinolone este o caracteristic ă intrinsec ă a fenotipului și
se manifestă prin efluxul activ și modificarea mutațională a țintelor mo leculare, ADN –
giraza și ADN topoizomeraza IV. Mutațiile apar în regiunile specifice, determinante pentru
rezistenț a la quinolone (QRDR), plasate în genele gyrA și parC ce codifică subunitățile
ADN girazei și topoizomerazei (Correia și colab., 2017).
Mecani smele prin care P. aeruginosa a devenit rezistentă la quinolone sunt:
scăderea permeabilității membranei externe, modificarea țintei (mutații ale genelor gyrA ,
gyrB ce codifică subunitățile A și B ale ADN girazei și mutații suferite de genele parC ,
parD ce codifică subunitățile topoizomerazei IV), eflux activ prin sistemele OprM, OprN
și OprJ (Hooper și Jacoby, 2016). Ambele specii sunt sensibile la fluoroquinolone.
2.4.5. Rezisten ța S. aureus la macrolide, s treptogramine, lincosamide (MLS B)
La scurt timp d upă introducerea eritromicinei în tratamentele clinice, în 1950,
rezistența bacteriană la acest medicament a fost raportată, pentru prima dată, la stafilococi.
Determinanții responsabili de rezistența la MLS B sunt: metilarea țintei ribozomale, efluxul
activ și inactivarea antibioticului. Cel mai frecvent macanism de rezistență întâlnit la
stafilococi este mediat de sinteza metilazei ARNr, codificată de genele ermA, ermB, ermC
(Golkar și colab., 2018). Exprimarea genelor poate fi inductibilă sau constitutivă (Tabelul
2).
Efluxul activ este un alt mecanism inductibil al rezistenței față de MLS B. S. aureus
sintetizează o proteina MsrA, codificată de gena mrsA , care este responsabilă de eliminarea
crescută a eritromicinei. Exprimarea acestei gene este indusă de macrolidele cu 14 și 15
atomi de carbon și oferă rezistență doar față de acești compuși (Chancey și colab. , 2012) .
S-au raportat o serie de enzime, care conferă rezistență la MLS B prin inactivarea
enzimatică, printre care: hidrolaze codificate de vgb care inactivează streptogramina B,
esteraze care inactivează eritromicina, transferaze codificate de linA ce inactivează
lincosamidele și fosforilazele care inactivează macrolidele.

30
Tabelul 2
Fenotipuri de rezisten ță la MLS dob ândite de c ătre stafilococi (dup ă Mihăescu și colab., 2007)
Mecanism Genotip Fenotip 14C11
5C2 16C3 LIN CLIN PRIb PRIa PRIi4
Modificarea
țintei erm
inductibil MLS B R S S S S S S
erm
constitutiv MLS B R R R R S S S
Inactivare linA L S S R S S S S
vat/vat B (L)S A S S S S S R ?
Eflux vgb SB S S S S R S ?
vga (L)S A S S S/I/R R/I/S S R S/R
msrA Erm R S S S S S S
Legenda:
114C: eritromicin ă, roxitromicin ă, claritromicin ă, diritromicin ă.
215C: azitromicin ă.
316C: spiramicin ă, josamicin ă, midecamicin ă, tilos ină.
4PRIi: pristinamicin ă.
2.4.6 Rezisten ța S. aureus la glicopeptide
S. aureus poate deveni rezistent la vancomicină prin doua mecanisme. Un
mecanism ce conferă o creștere moderată a CMI este mediat de mutații cromozomiale care
modifică fiziologia p eretelui celular și conduce la creșterea în grosime a acestuia, limitând
astfel accesul glicopeptidei. Într -un alt mecanism, S. aureus poate dezvolta rezistență prin
achiziția genelor van, care sunt responsabile de producerea unui peptidoglican modificat
(dipeptidul terminal D -Ala-D-Ala este înlocuit cu D -Ala-D-Lac) (Beceiro și colab. , 2013) .
2.5 Rezisten ța la antibiotice în România
Rezisten ța la substan țe antimicrobiene/microbicide (RAM) este un fenomen care
pericliteaz ă eficacitatea tratamentelor infec țiilor bacteriene, virale, fungice și parazit are.
Apari ția, selec ția și răspândirea speciilor de microorganisme multirezistente în spitale și în
alte spa ții medicale constituie o problem ă îngrijor ătoare a s ănătății publice la nivel global.
Printre factorii sociali care întrețin diseminarea fenotipului de multi -rezisten ță se num ără
utilizarea excesiv ă, necorespunz ătoare a antibioticelor, terapii cu doze sau durat ă de
tratament insuficiente, automedica ția și neinformarea pacien ților. Agen ții etiologici ai
infecțiilor dobândite at ât în mediul comunitar c ât și în cel spitalicesc , devin în mod
frecvent rezisten ți la antibioticele de prim ă-linie, ceea ce duce la un tratament costisitor și
limitat în op țiuni. Lipsa aplic ării unui ghid cu proceduri standard care s ă prevină și să
mențină controlul infec țiilor, dar și cu indica ții cu privire la utilizarea ra țional ă și
corespunz ătoare a antibioticelor , contribuie la una din cele mai mari amenin țări cu care se

31
confrunt ă sistemul de s ănătate at ât la nivel global , cât și la nivelul Europei, respectiv
selec ția patogenilor multirezisten ți.
Conform datelor estimate de Rețeaua Europeană de Supraveghere a Rezistenței
Antimicrobiene , în fiecare an, la nivelul Uniunii Europene, mai mult de 670.000 de infec ții
au la baz ă bacterii mu ltirezistente la antibiotice și aproximativ 33.000 de persoane mor în
urma acestor infec ții. Aceast ă statistic ă reprezint ă semnalul de alarm ă că ne îndrept ăm
către o era în care infec țiile bacteriene comune ar putea ucide din nou. Se impune
gestionarea crizei dată de multi -rezistența microorganismelor î n maxim ă urgen ță.
Organizatia Mondiala a Sanatatii (OMS) a implementat în mai , 2015 , un Plan Global de
Acțiune privind Rezisten ța Antimicrobian ă care s -a dorit a fi pus în acțiune încep ând cu
anul 2017 de c ătre Adunarea Mondial ă a Sănătății și are la baz ă cinci obiective :
1. Îmbunătățire a, conștientizarea și înțelegerea fenomenului de rezistenț ă
antimicrobi ană printr -o comunicare eficientă, educație si instruire sistematic ă;
2. Consolidarea cunoștințe lor prin cercet are și monitorizare ;
3. Scăderea incidenței și prevenire a infecțiilor prin măsuri eficiente de igienizare;
4. Utilizarea prudent ă a antibioticelor în sănătatea umană și animală;
5. Dezvoltarea economic ă a domeniului, prin investiții durabile care să țină s eama de
nevoile tuturor țărilor și suplimentarea investițiilor în noi medicamente, instrumente
de diagnostic, vaccinuri și alte intervenții.
Acest plan de acțiune subliniază necesitatea unei abordări eficiente care implică
colaborarea a numeroase sectoare și anume : medicina uman ă și veterinar ă, industria
agricol ă și a alimentelor, a mediului. Aproximativ 50% din consumul de antibiotice la
nivel global este alocat în scop profilactic si pentru a stimula cre șterea animalelor
produc ătoare de carne (Simonsen și colab., 2004). În mare parte aceste practici sunt
necorespunz ătoare și au implica ții majore în sănătatea public ă prin selec ția tulpinilor
rezistente și remanen ța rezidurilor de medicamente în alimente. În 2013 s -a estimat c ă la
nivel global s -au consumat 131.109 d e tone de antibiotice pentru hrana animalelor. În anul
2015 , Van Boeckel T. și colab. au p revăzut în func ție de datele colectate p ână în anul 2010,
că până în anul 2030 nivelul de antibiotice administrate animalelor va ajunge la 105.596
(±3.605) tone (Van Boeckel și colab., 2015 ). Aceast ă situație devine alar mant ă în condi țiile
în care acei ași autori, doi ani mai t ârziu corecteaz ă statisticile , deoarece valoarea estimat ă
pentru anul 2030 a fost dep ășită în numai 3 ani. (Van Boeckel și colab., 2017 ). În ulti mii 8

32
ani, situa ția Româ niei privind consumul necorespunz ător al antibioticelor a fost neglijat și
din acest motiv , s-a clasat anual în fruntea statisticilor în raport cu toate celelalte sta te
membre ale Uniunii Europene ( Antimicrobial consumption in the E U/EEA, annual
epidemiological report for 2018. ECDC; 2019) .
Conform datelor raportate anual și interpretate statistic de Centrul European de
Prevenire și Control al Bolilor (ECDC – European Centre for Disease Prevention and
Control ), Ro mânia se situeaz ă pe ultimele locuri în privin ța măsurilor implementate pentru
combaterea și controlul fenomenului de rezisten ță antimicrobian ă (ECDC, 2018). Prin
Planul Global de Ac țiune privind Rezisten ța Antimicrobian ă implementat în anul 2015,
OMS a solicitat ca p ână în an ul 2017 toate statele s ă-și dezvolte un Plan Na țional de
Acțiune (PNA). PNA trebuie s ă fie în conformitate cu cerin țele interna ționale și să includ ă
strategii pentru toate sectoarele care conduc la r ăspândirea fenomenului de rezisten ță
(Figura 7) .

Figur a 7
Strategiile Planului Na țional de Ac țiune ( după Anderson și colab., 2019 )
O analiză recentă bazată pe datele EARS -Net a evidențiat faptul că țările care au
raportat proporții ridicate de hemoculturi pozitive cu P. aeruginosa și Acinetobacter sp. , au
fost cele în care proc entul de izola re a bacteriilor G ram negative cu multi -rezistență
dobândită a fost în general cel mai ridicat (Jarlier și colab., 2019) . Această constatare este
probabil atribuită factorilor de risc, cum ar fi un consum ul ridicat de antibiotice cu spectru
larg și aplicarea sub-standard a măsuri lor de preven ție și control al infecțiilor.
În ultimii 6 ani, r ăspândirea rezisten ței tulpinilor de P. aeruginosa are un trend
descresc ător în întreaga Europ ă. Deși Româ nia a intrat pe f ăgașul acelu iași trend, sc ăderile

33
sunt nesemnificative statistic și acest lucru face ca țara noastr ă să fie în topul celor cu cele
mai mari procente de rezisten ță. Conform statisticilor din anul 2018 , rapoartele către
ECDC prezintă că procentele izolatelor invazive de P. aeruginosa rezistente la
fluoroquinolone, carbapeneme, aminoglicozide, piperacilina ± tazobactam și ceftazidim au
înregistrat valori de 52.3 %, 55.1%, 50.7%, 49.3% și respectiv 46.7%. În ceea ce prive ște
rezisten ța combinat ă la minim trei antibiotice in cluzând rezisten ța la antib ioticele
enumerate mai sus, Româ nia se situeaz ă pe primul loc (Tabelul 3) în ultimii 4 ani raporta ți
(2015 -2018) (ECDC, 2019) .
Aceea și situa ție se reg ăsește și în cazul tulpinilor de S. aureus rezistente la
metic ilină, raport ându-se valori procentuale de 43,0% ale tulpinilor izolate (Tabelul 4),
media la nivelul Europei fiind de 16,4% (ECDC, 2019). Deși s-au făcut eforturi vizibile
după anii 2015, MRSA rămâne un agent patogen important în Europa . Studii realizate de
ECDC a u concluzionat că incidența tulpinilor de MRSA în populați a din UE/ SEE specifică
grupului de vârstă, a fost cauzată în principal de o creștere a in fecțiilor la sugari și persoane
cu vârste de peste 55 de ani (Cassini și colab., 2019 ).
Tabelul 3
Procentul tulpinilo r de P. aeruginosa cu rezisten ță combinat ă (minim 3 grupe de antibiotice) în țările
UE/EEA , care se claseaz ă sub media ponderat ă a întregii Europe (European Centre for Disease Prevention
and Control , 2019)
Nr.
Crt. Țara 2015 2016 2017 2018 Tendin ța
1 UE/E EA (media
ponderat ă) 15.1 13.6 13.3 12.8
2 Italia 20.0 20.1 17.5 14.9
3 Portugalia 16.9 14.80 16.1 15.3
4 Cipru 2.3 4.7 9.4 16.4
5 Croa ția 28.0 31.9 21.4 19.0
6 Ungaria 20.9 19.1 18.1 20.2
7 Republica Ceh ă 19.0 19.6 17.3 21.9
8 Bulgaria 29.1 35.7 26.8 25.6
9 Grecia 28.4 31.6 32.4 28.7
10 Polonia 29.6 20.6 22.8 29.4
11 Letonia 15.4 18.8 42.9 30.8
12 Slovacia 40.7 33.9 39.1 35.9
13 Rom ânia 63.0 48.9 59.1 49.4
Tabelul 4
Procentul tulpinilor de S. aureus MRSA , în țările din UE/EEA , care se claseaz ă sub media ponderat ă a
întregii Europe ( European Centre for Disease Prevention and Control , 201 7 și 2019)
Nr.
Crt. Țara 2013 2014 2015 2016 2017 2018 Tendin ța
1 UE/EEA (media
ponderat ă) 18.10 17.50 19.00 17.70 16.80 16.40
2 Bulgaria 19.20 20.80 13.10 14.30 13.70 17.60

34
3 Ungaria 24.00 23.10 24.70 25.20 23.60 23.10
4 Spania 22.60 22.10 25.30 25.80 25.10 24.20
5 Croa ția 24.00 21.30 24.50 25.30 28.50 26.40
6 Slovacia 48.40 28.00 28.10 27.10 29.20 26.60
7 Italia 35.80 33.60 34.10 33.60 33.90 34.00
8 Malta 53.80 43.60 49.40 37.10 42.10 36.40
9 Grecia 40.30 37.10 39.40 38.80 38.40 36.40
10 Portugalia 46.80 47.40 46.80 43.60 39.20 38.10
11 Cipru 32.50 36.00 43.40 38.80 31.20 40.20
12 Rom ânia 64.50 56.00 57.20 50.50 44.40 43.00
Persistența și diseminarea RAM în natură este considerat ă o amenințare majoră
pentru săn ătatea publică , la nivel mondial. Prin urmare, strategiile care vizeaz ă încetinirea
răspândirii MRSA , sunt esen țiale. Controlul deversării antibiotice lor în mediu și
monitorizarea emergen ței tulpinilor MRSA la animale și alimente are o mare importanță
(Figura 8).

Figura 8
Căile de transmitere a rezisten ței bacteriene între animale, oameni și mediu l natural (bioMérieux SA, 2016).
Nota: Căile comune prin care bacteriil e rezistente se pot răspândi în mediu includ sisteme le de salubrizare a
apei (1) și utilizarea compostului de origine animal ă în agricultur ă (2 și 3). Adaptarea și răspândirea
bacteriilor rezistente poate apărea prin lanțul alimentar (4 și 5); infrastructu ra de distribuție a apei (6);
animale sălbatice (7); turism, migrație și importuri alimentare (8). La nivelul unități lor de asistență medicală,
bacteriile rezistente se pot răspândi prin contactul dintre pacienți sau cu personalul medical, sau prin
suprafe țe contaminate și dispozitive medicale.
În prezent m onitorizarea tulpinilor rezistente descoperite la animale și alimente este
realizat ă de voluntari și se efectuează numai într -un număr limitat de țări (EFSA -European
Food Safety Authority și ECDC , 2020) . Chiar și în aceste condi ții, această monitorizare
arată o situație în continuă evoluție și astfel a căpătat o atenție din ce în ce mai mare, d in
cauza riscului zoonotic, în special pentru cei care lucrează în contact strâns cu animalele.

35
Capitolul 3
SISTE ME PE BAZ Ă DE POLIMERI PENTRU ELIBERARE A
CONTROLAT Ă A SUBSTAN ȚELOR ANTIMICROBIENE
În anul 1940, la scurt timp dup ă descoperirea antibioticelor , a devenit clar c ă
utilizarea antibioticelor va conduce la apari ția rezisten ței speciil or bacteriene de interes
medical . Acest fenomen a fost controlat timp de aproximativ șase decenii datorit ă
introducerii noilor antibiotice. Însă, în cepând cu anul 1990 , cercetarea din domeniu l
farmaceutic, în scopul puner ii pe pia ță de noi substan țe antimicrobiene , a scăzut dramat ic
în timp ce microorganismele rezistente s -au răspândit rapid în lipsa unor m ăsuri și politici
de supraveghere . Declinul investițiilor private și lipsa inovației în dezvoltarea de noi
antibiotice afectează eforturile de combatere a bacteriilor rezistente la medicamente
(Organizația Mondială a Sănătății – OMS). Circa 60 de substan țe antimicrobiene (50 de
antibiotice și 10 agenti biologic i antibacterieni ) sunt în stadiul de cercetare pre -clinic ă (în
stadiul incipient de testare) și vor trece c âțiva ani p ână când vor fi introdu se pe piață și vor
ajunge la pacienți . Doar trei antibiotice active împotriva tulpinilor produc ătoare de beta-
lactamază de tip New Delhi (NDM -1), sunt î n curs de dezvoltare (OMS, 2019 ). NDM -1
determină rezisten ța la o gamă largă de antib iotice, inclusiv carbapeneme, care reprezintă
ultima linie de apărare împotriva infecțiilor bacteriene rezistente la antibiotic e (Papp –
Wallace și colab., 2016 ). Bacteriile au o rata de multiplicare de aproximativ 20 -40 min ., în
timp ce un nou antibiotic ne cesită cel puțin 10 ani pentru cercetare și dezvoltare (Heller și
Spence, 2019 ). Prin urmare, în războiul dintre bacterii și antibiotice, victoria pare s ă fie de
partea microorganismelor. Nu se poate duce o lupta împotriva evoluției, dar putem încerca
să rămânem cu un pas înaintea acesteia.
Hanan Balkhy, director ul general adjunct al OMS, a declarat c ă ‗‘Este important să
concentrăm investițiile publice și private p entru dezvoltarea de tratamente eficiente
împotriva bacteriilor foarte rezistente, deoarece r ămânem fără opțiuni. Și trebuie să ne
asigurăm că, după ce vom avea aceste noi tratamente, acestea vor fi disponibile tuturor
celor care au nevoie de ele .‖ (WHO/EMP/IAU/2019.12 ).
OMS a publicat în 2017 lista agenți lor patogeni prioritari, 12 specii bacteri ene pe
lângă Mycobacterium tuberculosis , care prezintă un risc tot mai mare pentru sănătatea
umană, deoarece sunt rezistente la majoritatea tratamentelor existente. Lista a fost

36
elaborată pentru a încuraja comunitatea de cercetare medicală să dezvolte trat amente
inovatoare pentru aceste bacterii rezistente (Figura 9).

Figura 9
Nivelul priorit ății, speciile și fenotipurile de rezisten ță care necesit ă dezvoltarea unor noi tratamente
(World Health Organization ; 2017 )
Prin urmare, o tendință care se dezvoltă rapid în zilele noastre este reprezentată de
dezvoltarea și promovarea de noi sisteme farmaceutice inteligente , pentru a asigura livrarea
țintită și con trolată a agenților terapeutici (Karolewicz, 2016, Patra și colab., 2018, Sin gh și
colab., 2019 ). Având în ved ere versatilitatea și rezultatele extraordinar e ale
nanotehnologiilor interdisciplinare, sistemele inovative necesită un design inteligent și
mecanisme veritabile de încărcare/ eliberare, care s ă contribuie la progresul tratamentului
personalizat ( Mudshinge și colab ., 2011 , Fornaguera și Garcia -Celma, 2017 ). Prin
utilizarea principiilor fun damentale ale nanotehnologiei ( care necesită manipularea
materiei la nivel molecular și atomic), s-au proiectat noi structuri farmaceutice la scară de
nivel micro și nano . Aceste sisteme maximizeaz ă eficiența terapeutic ă (prin furnizarea
mecanisme lor adecvate de farmacocinetică și farmacodinamică, solubilitat e, biodistribuție,
absorbție celulară și imunocompatibilitate) și minimiz ează efecte le secundare asupra
țesuturilor țintite și efectele nedorite asupra țesuturilor sănătoase sau nealterate ( Kang și
colab., 2015; Wen și colab. , 201 5; Onoue și colab. , 2014) .

37
Pentru a dezvo lta noi lor sisteme de eliberare țintită și controlat ă a antibiotice lor sau
a altor compu și activi , cu funcționalitate și eficiență exactă, nanostructurile polimerice s -au
dovedit a fi soluția optim ă. Acestea au proprietăți specifice , cum ar fi: raport ridicat
suprafață/ volum, noi caracteristici fizice, chimice și biologice, suprafețe funcționale
versatile care permit legarea compușilor hidrofili sau hidrofobi și funcționalizări fizic e,
chimice sau biologice ușoare (Liechty și colab., 2010) . Nanostructurile polimerice
îndeplinesc și cerințele binecunosc ute pentru astfel de st ructur i: biocompatibilitate,
proprietăți mecanice adecvate, versatilitate chimică și structurală, solubilitate,
degradabilitate și sunt aprobate de instituții specializate , cum ar fi Agenția Europeană a
Medicamentului sau FDA ( Food and Drug Administration -Administra ția Alimentelor și a
Medicamentelor ) (Kim și colab., 2013, Zhao și colab., 201 5; Jeevanandam și colab. , 201 8;
Patra și colab. , 201 8). Acest progres presupune c a substan țele polimerice s ă aibă
capacitatea de a -și schimba caracteristicile fizico -chimice ca răspuns la diferiți stimuli din
mediul local, cum ar fi temperatur a, stres ul mecanic, ultrasunete, lumină, solvenți, câmp
electric, pH, rezistență ionică, enzime, biomolecule ( Liechty și colab., 2010, Karimi și
colab., 2017, Karolewicz, 2015 , Khad ka și colab., 2014).
Polimerii biodegradabili, incluzând acidul poli (lactic -co-glicolic) (PLGA) și acidul
polilactic (PLA), sau combinații cu alți polimeri , sunt printre cele mai studiate sisteme de
eliberare a medicamentelor ( Makadia și Siegel, 2011 ).
3.1 Acid polilactic
Acidul polilactic -(C3H4O2) n este un poliester alifatic versatil, hidrofob și
termoplastic, obținut prin polimerizare, fie a acidului lactic natural sau a lactidei (di -ester
ciclic derivate din acidul lactic). Are are un aspect clar, tran sparent și se g ăsește sub
diferite conforma ții și configura ții: forme cristaline și optic active (poli L -lactidă și poli D –
lactidă), dar și o form ă amorf ă și optic inactiv ă (poli DL -lactidă) ( Su și colab., 201 9; Tsuji
și colab., 2017). Sunt utilizate la scară largă mai multe metode de sintetizare a PLA și
anume: (i) policondensarea termic ă, (ii) policondensare catalitic ă, (iii) polimerizare
enzimatică și (iv) biosinteză (sinteză cu ajutorul microorganismelor modificate genetic)
(Kamaly și colab., 201 6, Diaz și colab., 2012).
Printre proprietățile specifice care recomandă utilizarea PLA în aplicații
biomedicale, se pot menționa: (i) proprietăți mecanice și fizico -chimice adecvate și
manevrabile, (ii) prelucrarea (diverse metode de polimerizare, copolimerizare și

38
funcționalizare pot fi utilizate pentru sinteza sistemelor polimerice), (iii) disponibilitate
largă (monomerii PLA sunt izolați de resurse naturale regenerabile, cum ar fi amidon din
porumb, trestia de zahăr, amidon din orez), (iv) degradabilitate (diz olvarea hidrolitică prin
procese de de -esterificare) și (v) biocompatibilitate (monomerii PLA nu sunt iritan ți și
compu șii rezulta ți în urma degrad ării, nu sunt toxici pentru sănătatea umană)
(Manavitehrani și colab., 201 6;; Alizadeh -Osgouei și colab., 201 9; Narayanan și colab.,
2016). În ceea ce prive ște dezavantajele PLA, se pot e numera: (i) fragilitatea, (ii)
hidrofobicitatea și (iii) rata lentă de degradare. Progresul tehnologic extraordinar poate
depăși aceste dezavantaje prin manipularea proprietățilo r specifice prin metode fizice,
chimice și biologice pentru obținerea combina țiilor complexe și a materialelor hibride
(Patra și colab., 2018, Casalini și colab., 201 9).
Având în vedere proprietățile acidului polilactic, acest polimer s -a dovedit a fi
adecvat pentru aplicații biomedicale, inclusiv dezvoltarea sistemelor de livrare țintit ă și
controlat ă a agen ților terapeutici (Song și colab., 2018 ). Produsul farmaceutic Atridoxt –
proiectat și comercializat de TOLMAR, Inc. din 1999, ce con ține PLA și N -metil-2-
pirolidona (NMP), a fost aprobat de către Food and Drug Administration (FDA) pentru
administrarea controlată de doxiciclină subgingival , în tratamentul parodontit ei cronic e la
adulți ( Atridox, 2015; DrugBank, 2015).
Noi abordari terapeutice ale PLA con stau în sisteme ce au aplicabilitate în
reconstruc ția țesuturilor osoase și în a reduce potențialul eșec al implantului , din cauza
infecțiilor asociate. În acest sens studiile realizate de Loca și colab. (2015), Macha și colab .
(2015), Lian și colab. (2013 ) au proiectat noi sisteme care au în compozi ție hidroxiapatită
și PLA încărcate cu antibiotice precum vancomicină și gentamicin ă.
3.2 Acid poli lactic -co-glicolic
PLGA este un polimer biodegradabil, sintetic, aprobat de FDA pentru utilizare ca
biomaterial în aplicații clinice (de exemplu sisteme de eliberare controlat ă de antibiotice,
proteine, peptide și acizi nucleici), cu proprietăți fizice puternice și biocompatibilitate
ridicată (Makadia și Siegel, 2011). PLGA este un poliester sintetic care rezultă d in
copolimerizarea acidului polilactic (cu raporturi diferite ale celor două forme de izomeri
optici, respectiv, acidul D -lactic și acidul L -lactic) și acidul poliglicolic. Raportul dintre
formele D și L ale PLA influențează proprietățile fizico -chimice al e copolimerului rezultat,
variind de la forme extrem de cristaline la forme complet amorfe. Este solubil într -o gamă

39
largă de solvenți organici, dar mai puțin hidrofil dator ită grupărilor metil ale PLA și prin
urmare, prezintă o rată de degradare mai lentă , începând cu o explozie inițială (în jur de
30%) (Gentile și colab., 2014, Kamaly și colab., 2016 ). În prezența apei, PLGA este
supusă hidrolizei și se degradează până la acidul lactic (care intră în ciclul Krebs) și acidul
glicolic (fiind îndepărtat prin excreție renală sau metabolizat în ciclul acizilor
tricarboxilici) (Lu și colab., 2009) . Viteza de degradare este invers proporțională cu
proporția acidului glicolic, gradul de cristalizare a acidului lactic, raportul dintre suprafață
și volum, variațiile mari de pH (Stewart și colab., 2018) . Polimerii cu mas ă moleculară mai
mare au lanțuri polimerice mai lungi și necesită un timp mai lung pentru a se degrada în
comparație cu lanțurile polimerice mici (Makadia și Siegel, 2011).
PLGA este utilizat cu succe s din punct de vedere clinic ca sistem de eliberare țintită
a diferi ților agen ți terapeutic i datorit ă posibilit ății de a ajusta propriet ățile fizico -chimice și
rata de degradare ( Hines și Kaplan , 2014, Ghitman și colab., 2020 ). Degradarea PLGA , in
vivo, poate dura între 2 și 6 luni . (Shue și colab., 2012). Aceast ă proprietate a fost
exploatat ă pentru a proteja antibioticele peptidice și proteice , față de degradarea hidrolitică
după administrarea orală sau pentru a concepe formulări parenterale, care s ă reducă
numărul de doze terapeutice necesare ( Diab și colab. , 2012). Formulările PLGA încărcate
negativ s -au dovedit a fi de succes pentru încorporarea antibioticelo r hidrofile , cum ar fi
amoxicilina (Xu și colab., 2009), gentamicina (Lecaroz și colab., 2006) și acidul fusidic
(Yang și colab., 2009), dar și a agenți lor antiinflamatori precum: triamcinolon acetonid,
dexametazonă, ibuprofen ( Ho și colab., 2019, Gu și Burgess, 2015, Galeska și colab.,
2005, Jiang și colab ., 2004, Bonelli și colab., 2012, Pang și colab., 2011 ). Nanoparticulele
PLGA au îmbunătățit biodisponibilitatea și proprietățile farmacodinamice ale compușilor
naturali cu activitate antimicrobiană izolate d in plante, precum cinamaldehidă și carvacrol
(Chouhan și colab., 2017, Zodrow și colab., 201 2).
Tratamentul infecțiilor intracelulare este dificil, d in cauza faptului că multe dintre
antibioticele convenționale, cu excepția unor macrolide și tetracicline, nu se acumulează
și/sau activează în diferite compartimente intracelulare ( Beceiro și colab ., 201 3). Prin
urmare, utilizarea sistemelor de administrare țintită ar putea duce la eliberarea controlat ă a
antibioticului în interiorul celulei, prevenirea toxicit ății sistemice și îmbunătă țirea
eficacit ății terapeutice (Chifiriuc și colab., 2014). Sist emele polimerice ce au la baz ă
PLGA au fost utilizate cu succes pentru a livra intracelular substanțe active farmacologic,
cu efecte secundare reduse ( Rezvantalab și colab., 20 18, Ozturk și colab., 201 9). În studiul

40
realizat de Jhunjhunwala și colab. (2009 ), s-a demonstrat c ă microparticulele
biodegradabile PLGA elibereaz ă într-un timp indelungat , rapamicina în interiorul celulelor
dendritice la valori diferite de pH, imitând condițiile din interiorul fagozomului (pH 5) și
din mediul extracelular (pH 7,4).
Nanoparticulele care au în compozi ție copolimerul PLGA , au fost utilizate pentru a
crește eficiența antimicrobiană a l levofloxacin ului (Lopez -Lopez și colab., 2019)
ciprofloxacinei ( Dillen și colab., 20 04), rifampiciei (Malathi și Balasubramanian, 2011),
azitromicinei ( Mohammadi și colab., 201 0), dar și a flurbiprofen ului, după administrarea
locală pe mucoasa conjunctivală ( Vasconcelos și colab., 2015, Vega și colab., 2008).
Administrarea intracelulară și eliberarea susținută și prelungită a substan țelor
antimicrobiene prin înglobarea acestora în nanoparticule PLGA , s-a dovedit că induce o
activitate bacteriostatic ă sau bactericidă ridicată în infec ții cu Mycobacterium tuberculosis
(Malathi și Balasubramanian, 2011) și Brucella melitensis (Imbuluzqueta și colab., 2011).
Una dintre aplicațiile sistemelor derivate de la polimeri i PLGA (PLGA -alcool
polivinilic ) este obținerea unei supraf ețe cu capacitatea de a inhiba colonizarea și formarea
biofilmelor de S. aureus , prin încapsularea acidul usnic ( Grumezescu și colab ., 2014).
3.3 Ciclodextrine
CD sunt o familie de compuși formați din amidon , prin conversie enzimatică
(Biwer și colab., 2002) . Datorită conformației de scaun a unităților glucopiranozice, forma
geometrică a moleculelor de CD este de con trunchiat, cu situsuri hidrofobe în interior și
situsuri hidrofile în exterior (Upadhyay și colab., 2018) . Unitatea centrală a conului este
formată din atomi de carbon și oxigen eterici ale resturilor de glucoză, conferindu -i un
caracter lipofil. Aceste oligozaharid e ciclice conțin cel puțin 6 unități glucopiranozice
atașate prin legă turi glicozidice α-(1,4). CD nu se pot forma cu mai puțin de 6 unități
glucopiranozice din cauza interacț iilor sterice , în timp ce omologii a cestora cu 9 sau mai
multe unităț i sunt foart e dificil de purificat (Rajput și colab., 2016) . Din punct de vedere
structural, CD sunt oligozaharide ciclice cu un num ăr variat de resturi de glucoză ( Figura
10), astfel fiind diferite atât dimensiunea ciclului cât ș i solubilitatea acestora (di Cagno,
2016). CD naturale, î n special β -CD, au solubilitate slabă în apă, acest lucru însemnând că ,
solubilitatea complecș ilor rezultați din interaț iunea substanț elor lipofile cu aceste CD poate
fi și ea limitată , rezultâ nd preci pitarea CD în apă sau î n alte sistem e apoase (Raffaini și
Ganazzoli , 2020 ).

41

Figura 10.
CD v ăzută din lateral (A); perspectivă de sus (B); nomenclatura și caracteristicile chimice ale celor mai
comune CD (C). (după di Cagno , 2016 )
NOTA: Moleculele de o xigen colorat e albastr u reprezintă le găturile eterice 1 -4 (legături inter -monomerice),
în timp ce moleculele de o xigen colorat e roșu reprezintă legături de eter piranoză 1 -5 (legături intra –
monomerice). Liniile verzi reprezintă legăturile de H intramoleculare care se formează în βCD atunci câ nd nu
sunt prezente grupări substituente (R: -H).
Ciclodextrinele (CD) și derivații acestora sunt produși utilizați atât în industria
farmaceutică cât și în agronomie, industria chimică, alimentară sau ingineria mediului.
Marele avantaj al CD este că nu p rezintă efecte adverse, fiind ciclooligozaharide rezultate
prin degradarea enzimatică a amidonului, aprobate de FDA. În industria farmaceutică
astfel de produși sunt folosiți ca sisteme de eliberare a diferiților agenți terapeutici, a
nanoparticulelor, pep tidelor și proteinelor (Crini, 2014).
CD sunt utilizate ca excipienți sau agenți de complexare pentru a crește
biodisponibilitatea, stabilitatea și solubilitatea compușilor în soluții apoase (Saokham și
colab., 2018). În plus, în domeniul farmaceutic, CD s e folosesc pentru reducerea sau
prevenirea iritațiilor gastrointestinale sau oculare, mascarea sau reducerea mirosului și a
gustului neplăcut, prevenirea interacțiunilor între substanțele active sau între substanțele
active și excipienți (Tiwari și colab., 2010). De asemenea, sunt utilizate cu scopul de a
transforma medicamentele care se află sub formă lichidă sau uleioasă în pulberi
microcristaline sau amorfe (Salustio și colab., 2011, Helena și Marques, 2019).
Cea mai utilizată CD este β -CD, atât datorit ă biodisponibilității ridicate, cât ș i
dimensiunii cavității , adecvate încorporă rii celei mai variate game de substanț e activ e

42
(Gidwani și Vyas ., 201 5). Dar solubilitatea sa limitată precum și efectele nefrotoxice i -au
îngrădit folosirea (Saokham și colab. , 2018) .
Spre deosebire de γ -CD, α și β-CD naturale nu pot fi hidrolizate de către amilaze le
salivare și pancreatice. Totuși, cele două pot fi fermentate de către microbiota intestinală.
Ambele CD variază între 1 și 2 kDa, au caracter hidrofil și au un nu măr semnificativ de
atomi de H donori și acceptori, astfel încât nu se absorb în tractul gastrointestinal în forma
lor intactă (Leclercq, 2016) . CD cu caracter hidrofil sunt considerate n etoxice la doze mici
și moderate. Toate studiile de toxicitate au dem onstrat că în urma administr ării orale a CD,
acestea sunt practic n etoxice datorită lipsei absorbției în tractul gastrointestinal (Gidwani și
Vyas., 2015) .
Principale le efecte negative ale α -CD sunt: relativ iritant ă după administratrea
intramuscular ă, se leagă de anumite lipide (Amar și colab., 2016) , provoacă iritație oculară,
se absorb în procent de 2 -3% dup ă administrarea orală la șobolani, nu sunt metabolizate în
tractul intestinal superior și sunt scindate numai de către flora intestinală din cecum și
colon (Minami și colab., 1998) . Se excretă în procent de 7 -14% sub formă de metaboliți în
fecale și urină, majoritatea se excretă nemetabolizate pe cale renală după administrarea
intravenoas ă, t1/2 = 25 de minute la șobolani , DL 50>10.000 mg/kg la șobolani , DL 50 după
administrare intravenoasă la șobolani în intervalul 500 -750 mg/kg
(EMA/CHMP/333892/2013 , Liu și colab., 2010, Lytle și colab., 2018) .
În soluțiile apoase, CD sunt capabile să formeze complecși cu diferi ți agen ți
terapeutici , prin prinderea unei molecule d in substanț a activ ă, în interiorul cavității sale ,
care intră rapid în echilibru cu moleculele libere din soluție (di Cagno, 2016) . Schimbările
de temperatură pot afecta formarea complexului agent terapeutic -CD (Santos și colab.,
2019) . Un alt f actor de care depinde formarea complexului agent terapeutic -CD este
metoda de preparare, care poate consta în măcinare, frământare, dispersie solidă,
evaporarea solventului, co -precipitarea, uscarea prin pulverizare sau liofilizarea (Sareen și
colab., 2012 ). Metodele de complexare cu cel mai bun randament sunt uscarea prin
pulverizare și liofilizarea (Zhang și colab., 2018) .
CD îmbunătățesc biodisponibilitatea m edicamentelor insolubile prin creșterea
solubilității, prevenirea agregării și/sau creșterea perm eabilității pentru acestea (Tiwari și
colab., 2010 , Carneiro și colab., 2019 ). CD cresc permeabilitatea medicamentelor
insolubile la suprafața pielii (Santos și colab., 2019) , mucoaselor sau a corneei, fără să
distrugă stratul lipidic (Moiseev și colab., 2 019). Spre deosebire de detergenți, CD

43
solubilizează membranele fără a le rupe, efectele lor fiind reversibile (Leemhuis și colab.,
2010) . De asemenea, adăugarea polimerilor poate mări permeabilitatea medicamentelor în
soluție (Stella și He, 2008) . CD au c rescut biodisponibilitatea itraconazolului atât din
formele orale cât și din cele parenterale (Vanden și colab., 2003) . Carlotii și colab. (2010)
au observat că prin utilizarea CD ca agenți de încapsulare a principiilor active
medicamentoase puțin solubile , scade concentrația minimă activă necesară pentru a obține
un efect biologic. Aqil și colab. (2013) precizează că principiile active încapsulate în CD
sunt eliberate pe o perioadă de timp semnificativ mai mare comparativ cu principiul activ
liber, neîncap sulat. CD îmbunătățesc stabilitatea medicamentelor la reacții precum
deshidratarea, hidroliza, oxidarea sau descompunerea la lumină, mărind astfel termenul lor
de valabilitate (Saokham și colab., 2018) .
Aceste proprietăți cresc importanța folosirii CD în industria alimentară,
farmaceutică, agricultură sau în tehnicile cromatografice. Datorită tehnicilor î mbunătățit e
de purificare , a structurii lor arhitecturale unice și proprietăților de complexare, CD au
devenit o parte importantă în tehnologie, biocatali ză, încapsulare sau eliberare controlată în
multe aplicații farmaceutice .

44

Capitolul 4
CONTRIBUȚII PERSONALE
INTRODUCERE
Rezistența la antibiotice a înregistrat în ultimii ani rate foarte înalte, îngrijorătoare
si generează probleme grave de săn ătate, astfel că multe dintre antibioticele existente sunt
ineficiente în prezent în tratarea bolilor infecțioase. În ultimii ani, autoritățile internaționale
(WHO, ESCMID) au făcut eforturi considerabile pentru a îmbunătăți capacitatea de
supraveghere a c irculației tulpinilor antibiorezistente . În acest scop a fost creată rețeaua
EARSS -Net ( European Antimicrobial Resistance Surveillance Network ), transferat ă de la 1
ianuarie 2010 Centrului European de Prevenire și Control al Bolilor, cu sediul în Suedia,
organizație care colectează deja date raportate în prezent de către 30 de țări din Europa.
Această rețea, într -o primă etapă, acumulează date despre rezistența la antibiotice (obținute
printr -o metodă unică de lucru, în majoritatea țărilor metoda standardiz ată utilizat ă este
după normele EUCAST – European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing ) pe
care le prelucrează și apoi, într -o a doua etapă, printr -un mecanism de feed-back transmite
informația necesară pentru acțiunile din domeniul sănătății publice, spitale, pentru
clinicieni, microbiologi, etc. pentru a se putea lua măsurile corespunzătoare referitoare atât
la impactul antibiorezistenței asupra morbidității și mortalității generale, cât și a costurilor
rezultate din aceste situații.
Cele mai recente date din literatură menționează drept mecanisme cheie implicate
în rezistenț a la antibiotice: evenimentele mutaț ionale la nivel cromozomal (sint eza de beta –
lactamaze, de ESLB ș i carbapenemaze); mecanisme extracromozom ale; pompe de eflux de
tip ABC și transportori secundari (implicați în eliminarea droguri lor) ș i barierele de
permeabilitate (prin pierderea porinelor).
Mutațiile suferite de agenții patogeni și antibioterapia utilizată fără discernământ
duc în timp la fenomene de rezistență, ceea ce a im pus necesitatea dezvoltării unor noi
strategii de combatere a infec țiilor nosocomiale .
Descoperirea și înțelegerea modului de funcționare a mecanism elor de virulenta ,
patogenitate și rezisten ță a condus la dezvoltarea unei noi strategii terapeutice. Ex ploatarea

45
acestei terapii antipatogenice urmărește descoperirea și utilizarea unor siseme pe baz ă de
polimeri pentru eliberare a controlat ă și eficient ă a agenților antimicrobien i.
SCOPUL ȘI OBIECTIVELE LUCR ĂRII
Având în vedere situa ția alarmant ă a Rom âniei privind rezisten ța la antibiotice,
această teză a avut ca scop: caracterizarea mecanismelor de rezistență și virulență la tulpini
de Pseudomonas aeruginosa și Staphylococcus aureus , două dintre speciile incluse în
grupul ESC(K)APE. De asemenea, în aceast ă teză se propune utilizarea unor sisteme de
eliberare controlată a unor substanțe antimicrobiene, pentru combaterea eficientă a
fenomenului de multi -rezistență (MDR -multidrug resistance ).
Obie ctivele cercetarilor dezvoltate în ace astă teză de doctorat au fost:
1. Caracterizarea potențialului de virulen ță al tulpinilor clinice de P. aeruginosa și S.
aureus , la nivel fenotipic și genotipic.
2. Stabilirea profiluril or de rezisten ță ale tulpinilor clinice de P. aeruginosa și S.
aureus , la nivel fenotipic și genotipi c.
3. Evaluarea unor sisteme de eliberare controlat ă a substan țelor antimicrobiene , pe
bază de polimeri biodegradabili.

46
4.1. OBIECTIVUL 1 Caracterizarea potențialului de virulen ță al tulpinilor clinice de
P. aeruginosa și S. aureus , la niv el fenotipic și genotipic
4.1.1. Materiale și metode
4.1.1.1 Izolarea și identificarea tulpinilor
Pentru efectuarea studiului în vederea evidențierii mecanismelor de virulență și
patogenitate , s-au utilizat 2 0 de tulpini bacteriene, aparținând genurilor S. aureus și P.
aeruginosa , recent izolate de la pacienț i spitalizați în Institutul Clinic Fundeni din
Bucure ști.
Diagnosticul microbiologic s -a realizat în urma însămânțării cu anse calibrate de 1
µl, a produselor biologice pe medii specifice, respectiv Co lumbia agar cu adaos 5% sânge
de berbec (pentru izolarea cocilor) și CLED ( Cystine lactose electrolyte deficient agar ,
mediu lactozat pentru izolarea bacililor). După incubare a timp de 24 ore, la 37o C, s-a
continuat diagnosticul cu identificarea microorga nismelor prin realizarea testelor oxidazei,
catalazei și a coagulazei. Tulpinile și sursele de izolare sunt prezentate în Tabelul 5.
Tabelul 5
Sursa de izolare a tulpinilor bacteriene.
Nr.
Crt. Specia bacteriană Sursa de izolare
1 Pseudomonas aeruginosa 1 Hemocultură
2 Pseudomonas aeruginosa 2 Hemocultură
3 Pseudomonas aeruginosa 3 Hemocultură
4 Pseudomonas aeruginosa 4 Hemocultură
5 Pseudomonas aeruginosa 5 Exsudat faringian
6 Pseudomonas aeruginosa 6 Urocultură
7 Pseudomonas aeruginosa 7 Urocultur ă
8 Pseudomonas aeruginosa 8 Urocultură recoltată intraoperator
9 Pseudomonas aeruginosa 9 Urocultură recoltată intraoperator
10 Pseudomonas aeruginosa 10 Urocultură recoltată intraoperator
11 Staphylococcus aureus 1 Hemocultură
12 Staphylococcus aure us 2 Hemocultură
13 Staphylococcus aureus 3 Hemocultură
14 Staphylococcus aureus 4 Hemocultură
15 Staphylococcus aureus 5 Exsudat faringian
16 Staphylococcus aureus 6 Cateter
17 Staphylococcus aureus 7 Lichid peritoneal
18 Staphylococcus aureus 8 Exsudat faringian
19 Staphylococcus aureus 9 Exsudat nazal
20 Staphylococcus aureus 10 Exsudat nazal

47
4.1.1.2 Evidențierea factorilor de virulență solubili la tulpinile patogene – s-a realizat pe
medii speciale cu substr at încorporat.
Evidențierea produceri i de lecitinaze și lipaze sunt enzime implicate în patogeneza
unor tulpini bacteriene prin capacitatea lor de a induce formarea de pori în membrana
celulelor eucariote, alterând conținutului lipidic al acesteia.
Mediu cu gălbenuș de ou: 40.0g proteaze pep tone, 5.0g KH 2PO 4, 2.0g NaCl, 0.1g
MgSO 4, 2.0g dextroză, 5mg/ml heminǎ, 20.0g Agar în 1000 ml apă distilată. Se sterilizează
15 min. la 1150C. Se răceste mediul la 500C și se adaugă emulsie de gălbenuș de ou (1ml
la 20ml mediu). Mediul astfel preparat a fo st utilizat pentru evidențierea producerii de
lecitinază.
Mediu cu TWEEN (pH = 7,4): 10.0g peptonă pepsică, 5.0g NaCl, 0.1g CaCl 2,
25.0g geloză în 1000 ml AD. Se lichefiază mediul pe baie de apă clocotită, se menține la
45-500C și se adaugă 1% TWEEN 80 (s terilizat în prealabil la 1200C). Mediul astfel
preparat a fost utilizat pentru evidențierea lipazei.
Producerea de lecitinază: Tulpinile au fost însămânțate în spot pe agar conținând
gălbenuș de ou (2,5%) și incubate 24 -48h la 37oC ȋn condiții de aerobioz ǎ. Apariția unei
zone de precipitat în jurul spoturilor a fost înregistrată drept reacție pozitivă (producere de
lecitinază).
Producerea de lipază: Tulpinile bacteriene au fost însămânțate în spot pe agar cu
adaos de 1% Tween 80 (monooleat de sorbitol) și incubate 24 -48h la 37oC. Prezența unei
zone opace de precipitare în jurul spotului de cultură, dată de formarea cristalelor de oleat
de calciu insolubile (cristale formate între acizii grași eliberați și Ca2+), a fost considerată o
reacție pozitivă.
Evidențierea producerii de amilază: Amilazele se detectează utilizând o geloză
simplă la care se adaugă amidon din orez, iar hidroliza se revelează prin inundarea plăcii
cu HCl (halou transparent în jurul spotului de cultură) sau soluție Lugol (inel galben în
jurul spotului de cultură, în timp ce restul mediului se colorează în albastru).
Tulpinile au fost însămânțate în spot pe geloză suplimentată cu 1% amidon. După
incubare la 37oC timp de 24 -48 h, s-a înregistrat prezența zonei de clarificare a mediului în
jurul spoturilor de cultură ale tulpinilor pozitive.
Evidențierea producerii de proteaze: Proteazele sunt enzime extracelulare cu
specificitate scăzută, care hidrolizează proteinele până la peptide și aminoacizi, implicate
în distrugerea integrității țesutu rilor gazdei și în progresia infecției. Pentru evidențierea

48
producerii de proteaze, tulpinile au fost însămânțate în spot pe două tipuri de medii solide –
cu cazeină, respectiv cu gelatină și incubate 24 -48h la 37oC. Prezența unei zone de
precipitare în ju rul ariei de creștere a indicat proteoliza cazeinei/gelatinei (prezența
cazeinazei/gelatinazei ).
Mediu cu cazeină: pentru 1000 ml Bulion Tripticar: 15.0g Agar se dizolvă în 700
ml bulion prin încălzire, iar 15.0g cazeina se dizolvă la cald în restul de 30 0 ml bulion. Se
amestecă cu agarul și se ajustează pH -ul la 7.5 -7.6. Se sterilizează la 1100C, 30 min.
Mediu cu gelatină (pH final = 6.8+/ -0.2): 5.0g peptonă, 3.0g extract carne, 12.0g
gelatină în 1000 ml apă distilată. Sterilizare prin autoclavare la 1210C, 15 minute. Acest
mediu s -a folosit pentru determinarea capacității microorganismelor de a lichefia gelatina.
Evidențierea producerii de DN -ază: această enzimă acționează asupra ADN
eliberând mono – sau dinucleotidele.
S-a utilizat mediu cu ADN: 42.0g ag ar ADN în 1000 ml apă distilată. Sterilizarea
s-a efectuat timp de 15 min. la 121oC.
Tulpinile au fost însămânțate în spot pe geloză cu ADN și incubate 24 -48h la 37oC
ȋn condiții de aerobiozǎ. După incubare, plăcile au fost inundate cu soluție de HCl 1N, c are
a precipitat ADN nedegradat conținut în mediu, producând opacifierea acestuia, cu
excepția zonelor din jurul spoturilor de cultură ale tulpinilor pozitive, care au rămas
transparente, datorită fragmentării anterioare a lanțului de ADN la mononucleotide ,
datorită acțiunii DN -azei bacteriene.
Hidroliza esculinei: Tulpinile au fost însămânțate prin înțepare, cu ansa , în placi
care conțin mediu cu esculină conc. 1% și citrat de fier. După incubare timp de 24 -48h la
37o C, reacția pozitivă s -a înregistrat la nivelul însamânțării ca urmare a hidrolizei
exculinei și formării esculetolului care prin combinație cu sărurile de fier au determinat
înnegrirea mediului (Israil și colab., 2003, 2004).
Mediu cu esculină: peptonă 25.0g, exract din carne 25.0g, esculină 1 0.0g, bilă
20.0g, citrat de fier 10.0 g, agar 10.0g în 1000 ml apă distilată. Se topeste mediul pe baie
de apă. Se verifică pH -ul și dacă este cazul, se ajustează la valoarea 7,4 folosind o soluție
de NaOH 10%, sau o soluție de HCl 10%. Se sterilizează pr in autoclavare la 1210C, 15
minute.
Detectarea producerii de hemolizine: se evidențiază prin apariția unui halou
transparent în urma însămânțării pe geloza cu adaos de 5% sânge de berbec și după
incubare la 370C timp de 24h.

49
4.1.1.3 Determinarea hidrofobi cității înveli șului celular bacterian
Pentru determinarea hidrofobicității suprafeței celulelor microbiene s -au
însămânțat în tuburi Eppendorf , 200 µl inocul microbian de densitate standard 0.5
McFarland într -un volum de 1 ml bulion nutritiv (Tryptic soy broth-TSB) și s-au incubat
24 h la 37 0C. Celulele microbiene au fost spălate în prealabil de 2x cu PBS, centrifugate
10 min. la 10.000 rot ./min., sedimentele au fost reluate în PBS și vortexate. Turbiditatea
ajustată la 2 McFarland , s-a interpretat în urm a măsurării absorbanței (λ=620 nm -A0), cu
ajutorul spectrofotomet rului. Peste suspensiile microbiene r ămase s -au adăugat 0.5 ml
izooctan și s -au vortexat timp de 2 min.. Probele au fost l ăsate în repaus 60 min. pentru a
se separa faza apoasă de faza organi că și ulterior s -a determinat absorbanța fazei apoase
(strat inferior) la λ=620 nm.
4.1.1.4 Studiul capacității de aderență la substrat inert – testul producerii de factor
slime prin metoda microtitrării
Pentru evidențierea cantitativă a gradului de aderen ță la substrat inert prin metoda
microtitrării, s -au preparat suspensii microbiene ajustate conform standardului de
turbiditate McFarland 0,5 , din cultur i proaspete . Tulpinile bacteriene au fost cultivate în
150 µl bulion nutritiv r epartizat în plă ci cu 96 de godeuri și incubate timp de 24 -48h la
37oC. După incubare, plă cile au fost spă late cu AFS (3X) pentru î ndep ărtarea
microorganismelor din suspensie, fixate 5 minute cu 150 µl etanol, colorate cu cristal
violet 1%, timp de 20 minute, spălate cu apă de la robinet ș i uscate la temperatura camerei.
Pentru determinarea capacității de aderență , plăcile s-au resuspend at în acid acetic glacial
33% și s -a măsurat spectro fotometric la 490 nm , intensitatea suspensiei c olorate care este
direct proporțională cu capac itatea de aderență la substrat inert (Chifiriuc și colab., 200 7).
Dupa 48 h, se poate determina formarea biofilmului la nivelul substratului inert,
respectând pa șii descriși mai sus , însă după 24 de ore se adaugă mediu de cultură proasp ăt.
4.1.1.5 Evidenți erea capacitǎții de aderențǎ la substratul celular – Metoda Cravioto
modificată (Saviuc și colab., 2011)
Aderența la suprafața celulelor s -a determinat în urma ȋndepǎrtarii mediului de
creștere suplimentat cu antibiotic, prin spǎlarea (3x) substratului cel ular reprezentat de
linia celular ă Hep-2 (Human Epithelioma ). Linia celulară a fost menținută prin cultivarea
în mediul EMEM ( Eagle Minimal Essential Medium ) suplimentat c u ser fetal bovin 10%,

50
L-glutamin ă 1%, solutie de penicilin ă-streptomicin ă 1% și solu ție fungizon 1%. Fiecare
tulpină bacteriană de densitate optică standard McFarland 0,5 , s-a repartizat într -un volum
de 1 ml peste monostratul celular. Plǎcile s -au incubat la 37șC, timp de 2 h, timp ȋn care
bacteriile au aderat la suprafața celulelor subs tratului. Monostratul celular infectat a fost
spălat cu TFS (Tampon Fosfat Salin) (3x), fixat cu metanol (5 min) și colorat cu soluție
Giemsa – 20 min. Pattern -ul de aderență (localizat, difuz sau agregativ) s -a determinat prin
vizualizarea la microscopul optic, cu ulei de imersie, după sp ălarea cu apă de robinet a
godeurilor cu monostrat celular și uscarea la temperatura camerei.
4.1.1.6 Determinarea capacității de aderență și invazie la substratul celular prin
aprecierea numă rului de celule bacteriene via bile
Aderența și invazia la nivelul celulelor s -a determinat în urma ȋndepǎrtarii mediului
de creștere suplimentat cu antibiotice prin spǎlarea (3x) substratului celular reprezentat de
linia celulara Hep 2 – Human Epithelioma . Fiecare tulpină bacteriană d e densitate optică
standard McFarland 0,5 s -a repartizat într -un volum de 1 ml peste monostratul celular.
Plǎcile s -au incubat la 37șC, timp de 2 h, timp ȋn care bacteriile au aderat la suprafața
celulelor substratului. După primele 2 ore de incubare s -a adăugat câte 1 ml de mediu cu
gentamicină în godeurile unde s -a aprecia t numărul total de bacterii invazive. Plăcile s -au
incubat timp de o ora la 37 0C. Pentru îndepărtarea bacteriilor neaderate , s-a îndepărtat
mediul și s -a spălat monostratul celular cu T FS de 3 ori . În toate godeurile s -a adaugat câte
1 ml Triton X 1% (diluție în TFS) și s -a incubat 5 min. la 37 0C pentru eliberarea
bacteriilor aderate și a celor care au invada t intracelular. S -au realizat diluții zecimale din
suspensiile din fiecare gode u (până la diluția 1/108) în apă fiziologică sterilă (AFS),
ulterior s-a însămânțat, pe geloză nutritivă câte 10 µl din fiecare diluție , în duplicat, pentru
determinarea UFC/ml.
4.1.1.7 Identificarea substratului genetic al factorilor de virulen ță
Extracția ADN matri ță
În vederea realiz ării screening -ului genelor de virulen ță, ADN cromozomal a fost
extras prin metoda a lcalin ă din 10 tulpini de P . aeruginosa și 10 tulpini de S. aureus și
utilizat ca matriță . După obținerea inoculului reprezentat de 1 p ână la 5 colonii din cultura
bacterian ă tânără, dispersat ă în 20 µl de solu ție 0,05 M NaOH (hidroxid de sodiu) și 0,25%
SDS (Sodiu Dedocil Sulfat), se incubeaz ă la 950C, timp de 15 minute. Urm ătoarea etap ă

51
este reprezentat ă de ad ăugarea unui volum de 180 µl de soluție tampon TE (Tris + EDTA)
1X (pH=8). Pentru eliminarea sedimentului celular se supune unui ciclu de centrifugare
timp de 3 min. la 13.000 rota ții/minut, iar supernatantul astfel ob ținut, se transfer ă într-un
tub Eppendorff nou care poate fi stocat l a -20oC.
Amplificarea in vitro a secven țelor de ADN matri ță.
Reac ția PCR ( Polymerase Chain Reaction = Reacția de polimerizare în lanț) este o
metodă de amplificare enzimatică in vitro a unei anumite secvențe de ADN. Din punct de
vedere chimic, reacția PC R constă în cicluri succesive de replicare ADN in vitro , folosind
2 primeri oligonucleotidici ce hibridizează cu cele două catene ale matriței (Figura 11) .
Diferența esențială între o asemenea reacție de replicare și un proces de replicare ADN in
vivo, este reprezentată de faptul că în reacția PCR , etapa de desfacere a dublului helix
matriță și respectiv, cea de atașare a primerilor, nu sunt realizate enzimatic , ci prin
parcurgerea unor trepte de temperatură, iar singura enzimă folosită în reacție este o AD N
polimera ză dependentă de ADN (Vassu și colab., 2001).

Figura 11
Schema general ă a reacției de polimerizare în lanț ( Polymerase Chain Reaction )
Amestecul de r eacția PCR s-a realizat într-un volum final de 20 µl care conținea
0.2Uµl de ADN polimerază Go TaqFlexi, 1.2mM MgCl 2 și 2µM deoxinucleotid -trifosfat
(Tabelul 6). Componentele reac ției (cu excep ția matri ței) au fost amestecate în tuburi
Eppendorf de 0,5 ml, iar matrița ADN a fost adăugată ulterior într-un volum de 1 µl. S-a
utilizat o probă drept con trol negativ ( mixul reac ției, f ără matri ța ADN ). Reacția a fost
realizată în ThermoCycler MyResearch -BioRad .

52
Tabelul 6.
Componentele reac ției PCR.
Concentratie Volum
final Primer MgCl 2 dNTP Taq-pol
ADN Tampon
de reac ție ADN
0.5 µM 1.2 mM 2 µM 0.2U µl 1X 10X 20 µl

Protocoalele de amplificare și secvențele de nucleotide ale primerilor utilizați
pentru reac țiile PCR sunt descrise în Tabel ele 7 și 8 și s-au amplificat gene codificatoare
ale fosfolipazei C hemolitică, fosfolipazei C non -hemoliti că, algina tului, proteazei IV,
exotoxina A, exoenzima S , exoenzima U și T la tulpinile de P. aeruginosa .
Tabelul 7
Etapele și condi țiile reac țiilor PCR pentru detec ția factorilor de virulen ță la P. aeruginosa
Conditii de amplificare
PCR Denaturarea
inițială Denat urarea Alinierea
primerilor Polimerizarea/
Extensia
primerilor Elongarea
finala
plcH/plcN 94o C
3 min. 94o C
30 sec. 55o C
1 min. 72o C
1.5 min. 72o C
5 min.
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
algD 94o C
3 min. 94o C
30 sec. 51o C
1 min. 72o C
1.5 min. 72o C
5 min.
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Proteaza IV
TC 94o C
5 min. 94o C
30 sec. 60o C
30 sec. 72o C
2 min. 72o C
5 min.
1 ciclu 34 cicluri 1 ciclu
ExoS 94o C
5 min. 94o C
30 sec. 65o C
30 sec. 72o C
2 min. 72o C
7 min.
1 ciclu 35 cicluri 1 ciclu
ExoU/E xoT 94o C
2 min. 94o C
30 sec. 59o C
30 sec. 68o C
1 min. 68o C
7 min.
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Tabelul 8
Secvența de nucleotide a le primerilor utilizați pentru amplificarea genelor și mărimea anticipată a primerilor
Gena Denumire
Primer Secv ența de nucleotide Dimensiune
amplicon
(pb) Referin ță
plcH Forward
Reverse 5'- GAAGCCATGGGCTACTTCAA -3'
5'-AGAGTGACGAGGAGCGGTAG -3' 307
Cotar și colab.,
2010 plcN Forward
Reverse 5'-GTTATCGCAACCAGCCCTAC -3'
5'-AGGTCGAACACCTGGAACAC -3' 466
algD Forward
Reve rse 5'-ATGCGAATCAGCATCTTTGGT -3'
5'-CTACCAGCAGATGCCCTCGGC -3' 1310
Proteaza TC-F 5'-TATTTCGCCGACTCCCTGTA -3' 752 Georgescu și

53
IV TC-R 5'-GAATAGACGCCGCTGAAATC -3' colab., 2016
ExoS ExoSf
ExoSr 5‘-ATCGCTTCAGCAGAGTCCGTC -3‘
5‘-CAGGCCAGATCAAGGCCGCGC -3‘ 1352
ExoU ExoU -F
ExoU -R 5‘- CCGTTGTGGTGCCGTTGAAG -3‘
5‘- CCAGATGTTCACCGACTCG -3‘ 134
ExoT ExoT -F
ExoT -R 5‘-AATCGCCGTCCAACTGCATGCG -3‘
5‘-TGTTCGCCGAGGTACTGCTC -3‘ 152
Pentru S. aureus au fost analizate gene codificatoare ale sistemului de virulență
reprezentați de: molecule de adeziune – ebpS (protein a de legare a elastinei), fnbB (protein a
B de legare a fibronectinei), fib (proteina de legare la fibrinogen), clfA și clfB (factorul A și
B de aglutinare) și bbp (proteina de legare la sialoproteine osoase), cna (proteina de legare
la colagen); proteine extracelulare (coagulaze, leucocidina Panton -Valentine și γ-
hemolizina) și enterotoxine (SEA, SEB, SEC, SED și SEE). Primerii utilizați pentru cei 16
determinanți de virulență sunt prezentați în Tabelul 9.
Tabelul 9
Secvența de nucleotide a le primerilor utilizați pentru amplificarea determinanților de virulență de la
S. aureus
Gena Primer Secvența de nucleotide Mărime
amplicon
(bp) Referin ță

Bbp BBP-1
BBP-2 5′-AACTACATCTAGTACTCAACAACAG -3′
5′-ATGTGCTTGAATAACACCATCA TCT -3′ 575
Cotar și
colab., 2010
ebpS EBP-1
EBP-2 5′-CATCCAGAACCAATCGAAGAC -3′
5′-CTTAACAGTTACATCATCATGTTTATCTTTG -3′ 186
fnbB FNBB -1
FNBB -2 5′-GTAACAGCTAATGGTCGAATTGATACT -3′
5′-CAAGTTCGATAGGAGTACTATGTTC -3′ 524
fib FIB-1
FIB-2 5′-CTACAACTACAATTGCCGTCAA CAG -3′
5′-GCTCTTGTAAGACCATTTTCTTCAC -3′ 404
clfA CLFA -1
CLFA -2 5′-ATTGGCGTGGCTTCAGTGCT -3′
5′-CGTTTCTTCCGTAGTTGCATTTG -3′ 292
clfB CLFB -1
CLFB -2 5′-ACATCAGTAATAGTAGGGGGCAAC -3′
5′-TTCGCACTGTTTGTGTTTGCAC -3′ 205
fnbA forward
reverse 5′-CACAACCAGCAAATATAG -3′
5′-CTGTGTGGTAATCAATGTC -3′ 1362
cna forward
reverse 5′-AGTGGTTACTAATACTG -3′
5′-CAGGATAGATTGGTTTA -3′ 617 Johnson și
colab., 1991
luk-PV luk-PV-1
luk-PV-2 5′-ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA -3′
5′-GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC -3′ 433
Cotar și
colab., 2010 hlg hlg-1
hlg-2 5′-GCCAATCCGTTATTAGAAAATGC -3′
5′-CCATAGACGTAGCAACGGAT -3′ 938
tst tst-1
tst-2 5‘-ATGGCAGCATCAGCTTGATA -3‘
5‘-TTTCCAATAACCACCCGTTT -3‘ 350 Johnson și
colab., 1991
coag c-1
c-2 5‘-ATAGAGATGCTGGTACAGG – 3‘
5‘- GCTTCCGATTGTTCGATGC – 3‘ 812

54
seA SEA -1
SEA -2 5′-TTGGAAACGGTTAAAACGAA -3′
5′-GAACCTTCCCATCAAAAACA -3′ 120 Cotar și
colab., 2010
seB SEB-1
SEB-2 5′-GTATGGTGGTGTAACTGAGC -3′
5′-CCAAATAGTGACGAGTTAGG -3′ 478
Mansour și
colab., 2017 seC SEC-1
SEC-2 5′-AGATGAAGTAGTTGATGTGTATGG -3′
5′-CACACTTTT AGA ATCAACCG -3′ 257
seD SED -1
SED -2 5′-CCAATAATAGGAGAAAATAAAAG -3′
5′-ATTGGTATTTTTTTTCGTTC -3′ 317
seE SEE-1
SEE-2 5′-AGGTTTTTTCACAGGTCATCC -3′
5′-CTTTTTTTTCTTCGGTCAATC -3′ 170
Reacțiile PCR s -au realizat în ThermoCycler MyResearch -BioRad , iar condiți ile de
amplificare sunt prezentate în Tabelul 10.
Tabelul 10
Condițiile de amplificare ale genelor de virulență la S. aureus
Conditii de amplificare
Tip PCR Gena Denaturare
inițială Denaturare Aliniere Extensie Elongare
Multiplex bbp
ebpS 5‘, 940C 1‘, 940C 1‘, 550C 1‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 25 cicluri 1 ciclu
Multiplex fnbB
fib
clfA/clfB 5‘, 940C 1‘, 940C 1‘, 550C 1‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 25 cicluri 1 ciclu
Simplu fnbA 5‘, 940C 1‘, 940C 1‘, 500C 2‘, 700C 10‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Simplu cna 5‘, 940C 1‘, 940C 1‘, 550C 2‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Multiplex luk-PV
hlg 5‘, 940C 30‘‘, 940C 2‘, 550C 1‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Simplu tst 5‘, 940C 30‘‘, 940C 30‘‘, 580C 2‘, 720C 5‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Simplu coag 5‘, 940C 30‘‘, 940C 30‘‘, 550C 1.5‘, 720C 5‘, 720C
1 ciclu 40 cicluri 1 ciclu
Multiplex Sea/seb/se
c 5‘, 950C 1‘, 940C 1‘, 550C 1,5‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Multiplex sed
see 5‘, 950C 1‘, 940C 1‘, 550C 1,5‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu

55
Electroforeza în gel de agaroz ă
Verificarea produșilor de amplific are s-a realizat conform schem ei de protocol
prezentat ă în figura 12, respectiv prin migrarea produșilor de PCR în gel de agaroză 1%,
preparat în tampon T AE (Tris/ Acid acetic /EDTA) 1X și colorat cu bromură de etidium de
concentra ție de 10 mg/ml. Tamponul de electroforez ă utilizat a fost TBE 0.5X, tampon
recomandat pen tru fragmente de ADN dublu catenar de dimensiuni relativ mici.

Figura 12.
Schema electroforezei acizilor nucleici în gel de agaroz ă (imagine realizat ă cu programul BioRender)
Lungimea produșilor PCR a fost estimată prin compararea cu un marker molecular
de ADN de greutate de 1000 pb. Vizualizarea gelurilor s -a realizat cu ajutorul unui
transiluminator cu UV.

56
4.1.2 Rezultate și discu ții
În pre zent, patologiile infecțioase reprezintă o problemă importantă de sănătate cu
care ne confruntăm, fiind printre cele 10 cauze principale ale decesului la nivel mondial.
Acest lucru se datorează mai multor factori, printre care: schimbările de mediu, lipsa
metodelor de preven ție a infecțiilor, călătoriile și comerțul global, apărarea deficitară a
gazdei și în special, schimbările adaptative survenite la nivelul materialului genetic al
microorganismelor.
Factori i de virulență au impact asupra patogenezei infe cțiilor cu P. aeruginosa si S.
aureus . Asocierea factori lor de virulență exprimați de fiecare tulpină determin ă rezultatul
unui proces infecțios. În unitățile spitalicești, adesea este dificil să se facă distincția între
colonizare și infecție și nu este d isponibil un instrument de diagnostic pentru a evalua
potențialul de virulență al un ui patogen izolat .
4.1.2 .1. Evidențierea factorilor de virulenț ă solubili
Determinarea profil urilor factorilor de virulență solubili la tulpinile studiate a
evidențiat prez ența unui echipament enz imatic slab reprezentat ( Tabelul 11 și 12). Factorii
de virulență cei mai frecvenți , în cazul tulpinilor P. aeruginosa , sunt reprezentați de
cazeinază , hemolizine și esculinază. Cazeinaza hidrolizează proteinele gazdei și duce la
distrugerea integrității țesuturilor asftel încât să favorize ze progresia infecției.
Tabelul 11
Factorii de virulență solubili ai tulpinilor de P. aeruginosa .
Legendă : ―- ― – absența factorului de virulență
‘‘+‖- activitate moderată a factorului de virulență analizat
―++‖ – inaltă activitate enzimatică a factorului de virulență
―+++‖ – factor de virulență extrem de act iv. Factori de virulență
Nr.crt Tulpina Lecitinază Lipază Amilază DN-ază Cazeinază Gelatinază Esculinază Hemolizine
1 P. aeruginosa 1 – – + + – + + + + + + + +
2 P. aeruginosa 2 + – + – – – + + + + – + +
3 P. aeruginosa 3 – + – – – + + + + – + + +
4 P. aeruginosa 4 + – + – – – + + + – + +
5 P. aeruginosa 5 – – – – + + + + + + +
6 P. aeruginosa 6 – – – – + + + – + + + +
7 P. aeruginosa 7 + – – + – – + + + + – + + + +
8 P. aeruginosa 8 + – – + – – + + + – + + + +
9 P. aeruginosa 9 + – – + – – + + + + + + + +
10 P. aeruginosa 10 + – – ++ – + + + + + + +

57
Un num ăr semnificativ de tulpini prezintă capacitatea de a hidroliza esculina,
eliberând esculetolul care reprezintă un important chelator al fierului. Gelatinaza implicată
în distrugerea țesuturilor și generarea unui răspuns inflamator este unul din f actorii de
virulență sintetizat într -o proporție mai redusă de tulpinile analizate . Tulpinile incluse în
studiu , nu au capacitatea de a hidroliza moleculele de acizi nucleici cu ajutorul DN-azei și
de a elibera fosfomononucleotide , pe care să le utilizeze în propria sinteză. Amilaza este o
enzimă implicată în patogeneza bacteriilor, furnizând un avantaj competitiv, sintetizată
însă de un procent redus de tulpini de P. aeruginosa . Dintre tulpinile testate, un procent
relativ scăzut prezintă invazine de tipul lipazei și lecitinazei. În ceea ce privește sinteza
hemolizinelor, toate tulpinile de P. aeruginosa studiate au produs o hemoliză completă
caracterizată de un halou clar sau incomplet , caracterizată de un halou verde/roz (Fig ura
13).

Figura 13
Evidențierea factorilor de virulență solubili – lipază, cazeinază, hemoli zine (de la stânga la dreapta).
Tulpinile de S. aureus sunt caracterizate în principal de sinteza lipazelor și
lecitinazelor (Fig urile 14 și 15 ). Lipazele și lecitinazele sunt enzime c are alterează lipidele
membranare și plasmatice cu rolul de a forma pori în membrana celulelor gazd ă. Tulpinile
de S. aureus care s -au eviden țiat printr -o paletă mai extinsă de factori de virulență
sunt tulpinile izolate din hemocultură, exsudat f aringian și lichid peritoneal, respectiv
tulpinile cu indicativele : 3, 4, 5, 7, 8. Amilaza, DN -aza și gelatinaza nu au fost produse de
tulpinile de S. aureus testate.

58

Figura 14
Evidențierea factorilor de virulență solubili – lecitinază, lipază, caze inază, hemolizine (de la stânga la
dreapta).
Tabelul 12
Factorii de virulență solubili ai tulpinilor de S. aureus .
Legendă : ―- ― – absența factorului de virulență
‘‘+‖- activitate moderată a factorului de virulență analizat
―++‖ – inaltă activitate enzimatică a factorului de virulență
―+++‖ – factor de virulență extrem de activ.
Factori de virulență
Nr.crt Tulpina Lecitinază Lipază Amilază DN-ază Cazeinază Gelatinază Esculinază Hemolizine
1 S. aureus 1 + + + + + – – – – + + +
2 S. aureus 2 – – – – + – – –
3 S. aureus 3 + + + + + + – – + – + –
4 S. aureus 4 + + + + + + – – + – + + ++
5 S. aureus 5 + + + + + + – – + + + – + – –
6 S. aureus 6 + + + – – – + – – +
7 S. aureus 7 + + + + + + – – + – + + + +
8 S. aureus 8 + + + + + – – + – + + + +
9 S. aureus 9 – + – – + + – – –
10 S. aureus 10 – – – – + + – – + + +

59

Figura 15
Reprezentarea grafică a profilului factorilor de virulență solubili , prezenți la tulpinile de P. aeruginosa și S.
aureus .
Tulpinile multirezistente de P. aeruginosa analizate în acest studiu, prezintă un
arsenal enzimatic de virulență mai bogat în compara ție cu tulpinile MRSA atât ca num ăr
total de factori de virulență (6 factori de virulență pentru P. aeruginosa vs. 5 pentru
tulpinile de S. aureus ), cât și ca frecvență de izolare (cazeinaza și hemolizinele sunt
sintetizate de c ătre toate tulpinile de P. aeruginosa ) (Figura 15). Sursa de izolare reprezintă
un parametru important în interpretarea rezultatelor obținute. Astfel, ideea menționată
anterior este susținută și de reprezentarea grafică a factorilor de virulență solubili, în
funcție de sursa de izolare, conform careia echipamentul de patogenitate al tulpinilor de P.
aeruginosa izolate din hemoculturi, este superior celui prezent la tulpinile MRSA (Figura
16). În schimb, tulpinile de S. aur eus izolate din exsudate depășesc mecanismele de
virulență ale bacililor piocianic, izolați din același situs.

Figura 16
Reprezentarea grafică a factorilor de virulență solubili, în funcție de sursa de izolare, prezenți la tul pinile de
P. aeruginosa și S. aureus .

60
4.1.2 .2. Demonstrarea capacității de aderență și a poten țialului invaziv
Determinarea hidrofobicității învelișului celular bacterian
Aderența bacteriilor la diferite suprafețe abiotice și biotice este inf luențată și de
caracteristicile suprafeței celulare bacteriene. Hidrofobicitatea relativă și încărcătura de
suprafață joacă un rol important în atașarea bacteriilor la suprafața materialelor, forțele
hidrofobe aducând bacteriile la o distanță minimă necesa ră pentru ca structurile hidrofobe
ale celulei bacteriene să poat ă forma legături cu substratul. Hidrofobicitatea celulară
favorizează atât stabilirea interacțiunilor cu substratul cât și formarea legăturilor între
celulele bacteriene, contribuind astfel l a procesul de aderență și de formare a biofilmelor
(Donlan, 2002).
Prin determinarea spectrofotometrică a absorbanței amestecurilor culturilor
bacteriene cu izooctan, s -au obținut valorile reprezentate grafic în Fig urile 17 și 18.
Tulpinile car acterizate printr -un nivel crescut de hidrofobicitate sunt: S. aureus 5, 7, 9 și P.
aeruginosa 3, 9, 5, 2, tulpini izolate preponderent din exsudate, uroculturi și hemoculturi.

Figura 17
Hidrofobicitatea suprafeței celulare t ulpinilor de P. aeruginosa .
Unul din mecanismele prin care tulpinile de P. aeruginosa prezintă o creștere
semnificativă a hidrofobicității suprafeței celulare este eliberarea unor vezicule de către
membrana externă. Prin acest mecanism se favorize ază interacția cu celulele și penetrarea
țesuturilor gazdei ( Krasowska și colab., 2014 ).

61

Figura 18
Hidrofobicitatea suprafeței celulare tulpinilor de S. aureus .
Studiul capacității de aderență la substrat inert
Microorganismele au evoluat de -a lungul anilor și au dezvoltat noi mecanisme
care să le ajute să se multiplice atât în mediu cât și în organismul uman. Printre diferitele
strategii de supraviețuire utilizate de către patogeni se numără producerea fact orului slime.
Prin capacitatea lor de a adera și de a forma biofilme la suprafața cateterelor sau a altor
suprafețe inerte prezintă rezistență la concentrații semnificative de antibiotice datorită
faptului ca sunt protejate de matricea exopolizaharidică și astfel provoacă infecții severe și
greu de tratat. Factorul slime (exopolizaharid hidrofil secretat de unele tulpini care
determinǎ aderența celulelor bacteriene la suprafețe inerte, abiotice) este un indicator al
gradului de rezistență și al capacității de supraviețuire a tulpinilor bacteriene în mediul
extern, putând constitui un factor de virulență, în cazul infecției unui organism gazdă, prin
blocarea procesului de fagocitoză (Hrv R. și colab., 2016).
În urma studiului de evaluare cantitativă al gradul ui de aderență la substrat inert
mai mult de 50% din totalul tulpinilor au fost pozitive la testul producerii de factor slime ,
prin metoda microtitrării (Fig urile 19 și 20). Tulpinile care s -au remarcat printr -un nivel
crescut al gradului de aderență la su bstrat inert sunt: S. aureus 3, 7, 9 (izolate din
hemocultură, lichid peritoneal și exsudat nazal) și P. aeruginosa 6, 9, 10 (izolate din
urocultură).

62

Figura 19
Exprimarea cantitativă a gradului de aderență la substrat inert a tulpinilor de P. aeruginosa .
După incub area tulpinilor timp de 48 de ore pentru evidențierea formării
biofilmelor la nivelul substratului inert reprezentat de plăcile cu 96 de godeuri, s -a
demonstrat că nivelul gradului de aderență a crescut la majoritat ea tulpinilor studiate în
raport cu datele obținute după incubarea timp de 24 de ore (Fig urile 19, 20). O creștere
semnificativă a absorbanței echivalentă cu un grad ridicat în formarea biofilmului este
asociată tulpinilor de P. aeruginosa codificată cu nu mărul 1 (izolată din hemocultură) și S.
aureus codificat cu numarul 5 (izolată din exsudat faringian).

Figura 20
Exprimarea cantitativă a gradului de aderență la substrat inert a tulpinilor de S. aureus .
Evidențierea capacitǎ ții de aderențǎ la substratul celular
Aderența bacteriilor la suprafața celulelor reprezintă o etapă esențială în colonizarea
și formarea biofilmului în procesul infecțios. Capacitatea de a adera la celulele eucariote
este caracteristică unui procent de 80 % din totalul tulpinilor incluse în studiu. Pattern -ul de
aderență de tip localizat este exprimat de către 55% dintre speciile aderente, iar un procent

63
de 45% dintre tulpini determină aderența de tip agregativ (Fig ura 21). Tulpinile de P.
aeruginosa izolat e din urocultură, prezintă un pattern de aderență predominant agregativ,
din acest motiv infecțiile cauzate de acești agenți patologici sunt dificil de tratat și de
eradicat recurența acestora și prin urmare sunt justificate diferitele metode de diagnostic și
terapie. În ceea ce privește tulpinile de S. aureus incluse în studiu, aderă la un substrat
celular cu un pattern de aderență de tip agregativ, tulpinile izolate din hemocultură, lichid
peritoneal și exsudat nazal respectiv tulpinile codificate cu indi cativele 3, 7 și 9.

Figura 21
Aderența de tip agregativ (dreapta) și aderenta de tip localizat (stânga) a tulpinilor de P. aeruginosa la linia
celulara H Ep(1000X) .
Determinarea capacității de aderență și invazie la substratul celular
Aderența și inva zia bacteriană la nivelul diferitelor substraturi celulare reprezintă
procesul cheie esențial pentru persistența, virulența și transmiterea infecției. Rezultatele
obținute relevă faptul că în special tulpinile uropatogene manifestă in vitro proprietăți de
aderență și de invazie față de un substrat celular eu cariot sensibil. Atât tulpinile de P.
aeruginosa cât și cele de S. aureus izolate din hemoculturi exprimă un nivel scăzut de
aderență și invazie la nivelul celulelor, excepție fiind tulpina de P. aerugin osa 3 (Fig ura
22). Tulpinile de P. aeruginosa 6, 8, 10, izolate din uroculturi, prezintă un potențial crescut
de a adera la nivelul celulelor, iar tulpinile 3 și 9, izolate din hemocultura, respectiv
urocultura, au o capcitate crescută de a invada celulele gazdei.

64

Figura 22
Determinarea cantitativă a capacității de aderență și invazia ale tulpinilor de P. aeruginosa și S. aureus la
linia celular ă HEp.
Tulpinile de S. aureus 5, 7 și 9 (izolate din exsudate și lic hid peritonea l) au
proprietatea de invada celulele, spre deosebire de tulpinile 3, 4, 10 (izolate din hemoculturi
si exsudat nazal), care posedă doar abilitatea de a se atașa la nivelul celulelor eucariote
(Figura 22).
4.1.2 .3. Detec ția genelor care codifică expresia factorilor de virulență la tulpinile de P.
aeruginosa
Tehnicile moleculare îmbun ătățite au dus cu un pas înainte studiul factorilor de
virulen ță, contribuind astfel la lupta împotriva bacteriilor capabile s ă colonizeze și să
infecteze cu succes gazdele euc ariote.
Tulpinile de P. aeruginosa sunt capabile s ă sintetizeze doua proteine solubile
responsabile pentru invazie și anume fosfolipaza C hemolitic ă (PlcH) și fosfolipaza C non –
hemolitic ă (PlcN) , codificate de genele plcH și plcN . Aceste dou ă proteine sunt identice în
propor ție de 40%. Operonul plcH conține pe l ângă genele structural, genele plcR1 și plcR2
care codific ă un complex heterodimer (PlcHR1 și PlcHR2) care acționeaz ă ca proteine
chaperon necesare solubilit ății și secre ției fosfolipaz ei C hemolitic e (Stonehouse și colab.,
2002 , Truan și colab., 2013 ).
PlcH este o protein ă de 78 kDa (Luberto și colab., 2003) are o specificitate ridicat ă
pentru fosfatidilcolin ă și sfingomielin ă și este o enzim ă implicat ă în patogenitate , dar și o

65
proteina proinflamat oare (Wargo și colab., 2009). Rahme și colab. (2000) și Hogan și
Kolter (2002) au prezentat implicare a enzimei PlcH în abilitatea P. aeruginosa de a infecta
o varietate larg ă de gazde printre care: vertebrate, nevertebrate, plante, Candida albicans .
Fosfat idilcolina și sfingomielina , în prezen ța enzimei PlcH , se desfac în fosforilcolin ă, care
la rândul ei poate fi defosforilat ă în periplasm de către fosfataza PchP, rezultând în final
colina. Fosfatul și colina rezultat e din activitatea PlcH particip ă la reg larea transcrierii
genei plcH (Wargo și colab., 2008). În urma analizelor de microarray ale unor probe de
spută de la pacien ți cu fibroz ă chistic ă, s-a eviden țiat că P. aeruginosa induce catabolismul
colinei și al diacilglicerolului prin exprimarea genei plcH în plămânii pacien ților (Son și
colab., 2007). Acest studiu întărește ide ea conform c ăreia PlcH este un important factor de
virulen ță, responsabil de colonizarea plămânilor cu bacil piocianic.
PlcN (73.5 kDa ) acționeaz ă în sinergism cu PlcH , respectiv în urma degrad ării de
către PlcH a membrane i eritrocitelor (fosfatidilcolina și sfingomielina), PlcN ar putea apoi
hidroliza fosfatidilserina prezentă în membrana intern ă (Voulhoux și colab., 2001, Bleves
și colab., 2010) .
Din analiza genotipului s-a obs ervat că toate tulpinile izolate de P. aeruginosa
posedă gene le responsabile pentru s inteza fosfolipazelor C (Figura 23) comparativ cu alte
studii din țară în care numai gena plcH a fost de tectat ă în rândul tulpini lor izolate din
hemoculturi (Holban și colab., 2013) . Cotar și colab. (2013) au analizat secre ții biologice
de la nivelul sistemului respirator și au detectat prezenta genelor plcH și plcN în procente
de 92.85% și respectiv100%, rezultate concordante cu cele ob ținute în acest studiu , în
cazul tulp inii P. aeruginosa 5 (izolat ă din exsudat faringian). În cazul tulpinilor izolate din
urocultur ă, studiile arat ă că s-au găsit diferite profiluri de virulen ță și nu se cunosc foarte
bine mecanismele și factorii implica ți în colonizarea epiteliului renal (Tielen și colab.,
2011, Newman și colab., 2017) . O ipotez ă plauzibil ă ar fi c ă după liza mediat ă de PlcH a
globulelor ro șii și eliberarea hemului , se asigur ă o surs ă de fier necesar ă multiplic ării
bacteriilor (Mittal și colab., 2008) . Analiza tulpinilor uro patogene, respectiv P. aeruginosa
6, 7, 8, 9 și 10, a eviden țiat prezen ța ambelor gene responsabile pentru sinteza
fosfolipidelor C.

66

Figura 23
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR multiplex pentru genele plcH și plcN. Toate
tulpinile sunt pozitive. Marker PCR (Promega) – 1000 pb – linia 1 , 13, linia 12 -control negativ.
Investigarea in vitro a produc ție de algin at prin detec ția gen ei algD , au arătat că
toate izolate le exprimă această genă (Fig ura 24). Gena algD codifică enzima GDP manoz –
dehid rogenaz ă, primul element esen țial din clusterul de biosintez ă al alginatului (Franklin
și colab., 2011) . Alginatul este un polizaharid linear care confer ă bacteriilor rezisten ță la
antibiotic e și la mecanismele de ap ărare ale gazdei eucariote (Riquelme și colab., 2020) .
Enzima GDP manoz o-dehidrogenaz ă care se încadreaz ă în clasa adezinelor bacteriene, este
prezentă la toate izolatele analizate în acest studiu. Aceste rezultate sunt în discorda nță cu
raportul analizei bacteriilor multirezistente din studiul autorilor Hassuna N., Mandour S. și
Mohamed E. (2020) . Omniprezenta genei algD în rândul tulpinilor izolate demonstrează
implicarea acest or tulpini în infecții cu formare a de biofilm e. Într-adevăr, nivelul ridicat al
expresiei gen ei algD se corelează cu re zultatele fenotipice, ader ența la substratul inert fiind
observată în rândul tulpinilor testate ( Figura 19 ).

Figura 24
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gen a algD : toate tulpinile sunt pozitive.
Linia 1 și 13 – Marker PCR (Promega) – 1000 pb , linia 12 -control negativ .

67
Tulpinile de P. aeruginosa izolate din hemoculturi și uroculturi s-au remarcat
printr -o frecvență ridicată a proteazei IV (TCF / TCR) spre deosebire de tulpina izolat ă din
exsudat faringian care este caracterizat ă de lip sa acestui factor de virulen ță (Figura 25).
Cotar și colab., (2010) și Holban și colab. (2013) au raportat o frecvență crescut ă a genelor
proteazei IV la tulpinile de P. aeruginosa analizate.
Proteaza IV (~27 kDa ) codificat ă de gena piv, face parte din fa milia serin –
endoproteazelor și joacă un rol important în producerea leziunil or tisulare (Bradshaw și
colab., 2018) . Proteaza IV purificat ă a demonstrat că posedă capacitatea de a degrada un
număr mare de proteine cum ar fi imunoglobuline, componentele comp lementului,
fibrinogenul, plasminogenul, lactoferina, transferina, elastina ( Beaufort și colab., 2010 ). La
nivelul pl ămânilor, proteaza IV poate cliva proteinele A și D din surfactan ți, dar și IL-22,
efectorul final al imunit ății înnăscute, responsabil pen tru protec ția la acest nivel (Guillon și
colab., 2017, O‘Callaghan și colab., 2019 ).

Figura 25
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena piv: tulpinile pozitive sunt P1 – P4, P6 –
P10. Marker PCR (Promega) – 1000 pb – linia 1, 13, linia 12 -control negativ.
Sistem ul de secre ție de tip III a fost identificat ca fiind elementul major al virulen ței
și responsabil de eșecul tratamentului infec țiilor de cornee, pneumonie i, otitei externe
(Galle și colab., 2012 ), prin faptul c ă injecteaz ă exotoxi nele ExoS, ExoY și ExoT direct în
citosolul celulei eucariote (Park și colab., 2017 ). Este cunoscut faptul că exotoxinele ExoS,
ExoY și ExoT inhibă invazia (Klockgether și Tummler, 2017) , în timp ce ExoU determină
citotoxicitate a (Foulkes și colab., 2019). Rezultatele lui Shaver și Hauser indică faptul că în
cazurile de pneumonie acut ă, ExoU (74 kDa) are cel mai amplu efect citotoxic dintre
proteinel e secretate de sistem ul de secre ție de tip III , în antitez ă cu ExoT (Shaver și
Hauser, 2004 ).

68
ExoS este o ex otoxina bifunc țional ă având activitate de protein ă activator a
hidrolazei de tipul GTPazei ( guanozin 5' -trifosfat hidrolaza) , dar și activitate de ADP –
riboziltransferaza (Rangel și colab., 2015) . ExoT produce deregl ări în procesul citokinezei
și inhib ă fagocitoza (Riquelme și colab., 2020).
Tulpinile analizate s -au remarcat prin prezenț a ridicată a gene lor exoS și exoT
(Figur ile 26 și 27), gene ce codific ă toxine bifunc ționale , cu o omologie de 76% a structurii
primare . Aceste toxine acționează asupra pro teinelor G mici ale celulei gazdei, modificând
astfel filamentele de actin ă si căile de semnalizare (Sawa și colab., 2014). Rezultatele
noastre sunt similar e altor studii care arată prevalen ța ridicată a gene lor exoS și exoT în
izolate din diferite surse (Stewart și colab., 2011, Georgescu și colab., 2016, Ruiz-Roldan
și colab., 2018, Subedi și colab., 2018) .

Figura 26
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena exoS: toate tulpinile sunt pozitive , cu
excepția tulpin ii P9. Marker PCR (Prom ega) – 1000 pb – linia 1, linia 12 -control negativ.

Figura 27
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena exoT: toate tulpinile sunt pozitive
(liniile 2 -11). Marker PCR (Promega) – 1000 pb – linia 1, linia 12 -control negativ.
Gena exoU , un adjectiv important de virulență detectat cu o frecvență mare în
tulpinil e analizat e (Figura 2 8), indică faptul că tulpinile prezintă fenotipul citotoxic, care
este asociat cu avantaje în a produce leziuni pulomonare mai frecvent decât în cazul

69
fenotipuri lor invazive. Rodulfo și colab. (2019) au asociat fenotipul MDR cu prezen ța
semnificativ crescut ă a genei exoU , în compara ție cu prezen ța genei exoS . Exotoxina ExoU
are activitate de serin -acilhidrolaz ă, induce necroza celulei prin distrugerea membrane i
celulare și poate contribui la r ăspunsul inflamator mediat de eicosanoide în celulele
epiteliale ale c ăilor respiratorii (Sawa și colab., 2014).

Figura 28
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena exoU: toate tulpinile sunt pozitive
(liniile 2 -11). Marker PCR (Promega) – 1000 pb – linia 1, linia 12 -control negativ.
Majoritatea izolatelor de P. aeruginosa MDR au prezent at toate gene le de virulență
analizate și doar două tulpini au prezentat doar 6 gene de virulență (Tabelul 13). Tulpinile
analizate sunt împărțite în 3 profiluri diferite de virulență , tipul predominant fiind cel cu
toți factorii de virulen ță exprima ți. Între tulpinile i zolate din situsuri diferite nu s -au decelat
diferen țe semnificative.
Tabelul 13
Profiluri le factorilor de virulen ță la tulpinile de P. aeruginosa .
Nr.crt Tulpina Sursa de izolare Gene de virulență
plcH plcN algD piv exoS exoU exoT
1 P. aeruginosa 1 Hemocultură + + + + + + +
2 P. aeruginosa 2 Hemocultură + + + + + + +
3 P. aer uginosa 3 Hemocultură + + + + + + +
4 P. aeruginosa 4 Hemocultură + + + + + + +
5 P. aeruginosa 5 Exsudat faringian + + + – + + +
6 P. aeruginosa 6 Urocultură + + + + + + +
7 P. aeruginosa 7 Urocul tură + + + + + + +
8 P. aeruginosa 8 Urocultură recoltată
intraoperator + + + + + + +
9 P. aeruginosa 9 Urocultură recoltată
intraoperator + + + + – + +
10 P. aeruginosa 10 Urocultură recoltată
intraoperator + + + + + + +

70
Este crucială i dentificarea arsenalului de factori de virulență ai tulpinilor de P.
aeruginosa , pentru a înțelege patogeneza acestui bacil Gram negativ oportun ist și pentru
identificarea unor noi strategii antimicrobiene, în special în cazul tulpinil or MDR .
4.1.2.4. Detec ția genelor care codifică expresia factorilor de virulență la tulpinile de S.
aureus
Infecțiile cu S. aureus , în special cele necutanate, sunt adesea cronice sau
recidive ază și sunt dificil de eradicat chiar și cu un tratament adecvat (Tong și colab.,
2015) . Agentul etiologic al acestor infec ții dezvolt ă și exprimă numeroase strategii și
factori de virulență (Tabelul 14) care contribuie la patogeneza și persistența sa ( Lakhundi
și Zhang, 2018 ), incluzând invazia celule lor gazdă și supraviețuirea în fago zom sau
citoplasmă ( McLean și colab., 2019 ).
Tabelul 14
Profiluri le factorilor de virulen ță la tulpinile de S. aureus
Tabelul 14 (cont.)
Profiluri le factorilor de virulen ță la tulpinile de S. aureus Gene de virulență
Nr.crt Tulpina Sursa de izolare bbp ebpS fnbB fib clfA clfB fnbA cna
1 S. aureus 1 Hemocultură – – – + – – + –
2 S. aureus 2 Hemocultură – – – + – – + –
3 S. aureus 3 Hemocultură – – – + – – + –
4 S. aureus 4 Hemocultură – – – + – – + –
5 S. aureus 5 Exsudat faringian – – – + – – + –
6 S. aureus 6 Cateter – – – + – – + –
7 S. aureus 7 Lichid peritoneal – – – + – – + –
8 S. aureus 8 Exsudat faringian – – – + – – + –
9 S. aureus 9 Exsudat nazal – – – + – – + –
10 S. aureus 10 Exsudat nazal – – – + – – + –
Gene de virulență
Nr.crt Tulpina Sursa de izolare Luk-Pv hlg tst coag seA seB seC seD seE
1 S. aureus 1 Hemocultură – + – + – – – – –
2 S. aureus 2 Hemocultură – + – + + – – – –
3 S. aureus 3 Hemocultură – + – + – – – – –
4 S. aureus 4 Hemocultură – + – + – – – – –
5 S. aureus 5 Exsudat faringian – + – + – – – – –
6 S. aureus 6 Cateter – + – + + – – – –
7 S. aureus 7 Lichid peritoneal – + – + – – – – –
8 S. aureus 8 Exsudat faringi an – + – + – – – – –
9 S. aureus 9 Exsudat nazal – + – + – – – – –

71
Succesul unui patogen se datoreaz ă în mare parte capacit ății sale de a adera la o
gamă largă de țesuturi . Capacitatea S. aureu s de a adera la proteinele plasmatice și la
proteinele matricei extracelulare depozitate pe biomateriale , este un factor important în
patogeneza infecțiilor asociate cu dispozitivele medicale. Aderen ța tulpinilor de S. aureus
este mediat ă de proteine atașate covalent la peptidoglicanul peretelui celular bacterian,
proteine încadrate în familia receptinelor asociate suprafetei celulare MSCRAMM (Foster,
2019) . Liganzii acestor receptine pot fi reprezentați de molecule de elastină, colagen,
laminină, fibrinoge n, fibronectină. Genele care codific ă proteinele încadrate în aceast ă
familie sunt: bbp, clfA, clfB, fnbA , fnbB , cna.
Proteina de legare a sialoproteinei osoase (Bbp) exprimată pe suprafața tulpinilor de
S. aureus , mediază prima etapă în inițierea infecți ei stafilococice, respectiv aderen ța la
fibrinogen α (Fg α) (Zhang și colab., 2015). Proteina Bbp , codificat ă de gena bbp, este
absent ă la tulpinile incluse în acest studi u (Figura 29), fapt ce explic ă exprimarea acestui
factor de virulen ță la tulpinile iz olate de la pacien ți care sufer ă de artrit ă și osteomielit ă
(Pers son și colab., 2009).
Aceea și situa ție se reg ăsește și în cazul genei care codific ă proteina care leagă
elastina ( ebpS ). Aceste rezultate indică faptul c ă tulpini le analizate nu sunt implica te în
infecții inva zive (Figura 28). Proteina EbpS este responsabil ă de ata șarea la celula gazd ă a
bacteriilor prin legarea sa la elastin ă. În ciuda contribu ției reduse la procesul de ade rență ,
gena ebpS este foarte conservat ă în rândul tulpinilor de S. au reus, ceea ce poate sugera alte
funcții cruciale în patogenez ă, cum ar fi implicarea în formarea biofilmelor bacteriene
(Atshan și colab., 2012, Nakakido și colab., 2014, Chen și colab., 2020).

Figura 29
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR multiplex pentru detecția simultană a genelor bbp și ebpS .
Linia 1 2 – martor de greutate moleculară -marker DNA 100 0bp (Promega), 11 – control negativ. 10 S. aureus 10 Exsudat nazal – + – + – – – – –

72
Factorii de a derență codificaț i de genele clfA și clfB sunt implicați în numeroase
afecț iuni, printre ca re endocardită, infecț ii endovasculare, abces subcutana t, artrită . Acești
factori sunt implicați și î n supraviețuirea patogenului î n circulaț ie, prin reducerea
opsonofagocitozei ( Foster și colab., 201 4). Genele clfA și clfB sunt reglate diferi t și anume,
gena clfB este exprimată î n faza ex ponențială de creș tere, iar expresia genei clfA la sfârșitul
etapei de creș tere exponențială (Crosby ș i colab., 2016).
Deși factorii de a derență ClfA ș i ClfB sunt esențiali î n patogeneza tulpinilor de S.
aureus , în urma an alizei genomului tulpinilor MRSA in cluse î n acest studi u, s-a constat at
lipsa acestor determinanți de virulență (Figura 30). În studiul molecular -epidemiologic,
efectuat pe 5 ani (2013 -2018) , pe tulpini de S. aureus cu rezistență inductibilă la
clind amicin ă, Goudarzi și colab. ( 2020 ), au identificat factorii de a derență în procente
ridicate, respectiv 93.7% ( clfA) și 87.3% ( clfB).

Figura 30
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR multiplex pentru detecția simultană a genelor clfA și clfB.
Linia 1 și 13 – martor de greutate moleculară -marker DNA 1 000bp (Promega), 1 2 – control negativ.
În cazul genei cna, rezultatele reacției PCR au demonstrat absenț a acestei gene la
tulpinile de S. aureus analizate (Figura 31). Analiza genomică realizat ă de Io nescu și
colab. (2015) confirmă și susț in rezultat ele obținute î n acest studiu. În studiul realizat de
Chen și colab. (2020) , proteina care leagă colagenul a fost sintetiz ată predominant de către
tulpinile producă toare de biofi lme. În schimb, î n studiul autor ilor Khoramian și colab.
(2015) , asocierea d intre biofilm și prevalenț a genei cna nu a fost observată .

73

Figura 31
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena cna. Linia 2 – marker DNA 100 0bp (Promega)
și 1 – control negativ.
Studii diferite arată că invazia eficientă a tulpinilor de S. aureus este dependentă de
una din cele două proteine Fn BP: FnbpA sau FnbpB , care condiționează endocitarea în
celulele fagocitice neprofesioniste (Alva -Murillo și colab., 2014) , dar și aderența la
epiteliul că ilor respiratorii (Mongodi n și colab., 2002). Aceș ti autori au demonstrat că 97%
din 32 de tulpini izolate de la pacienți cu fibroză chistic ă și pneumonie nosocomială , dețin
ambele forme ale proteinei. Booth ș i colab. (2001) a u evidentiat pr ezenț a genei fnbA într-
un procent de 89,7% la tulpini izola te din diferite tipuri de infecții (septicemii, infecții
asociate cateterizării, osteomielite, infecț ii ale trac tului respirator, infecții oculare, infecții
ale tegumentelor și țesut urilor moi), î n timp ce gena fnbB a fost observată la doar 20,1%
din izolate, în mare parte î n hemoculturi.
Singurul factor de virulență din cadrul familiei proteinelor MSCRAMM prezent în
rândul tulpinilor analizate este protein a de legare a fibronectinei A (FnBPA) (Figura 3 2),
prin care bacteria se poate ataș a la f ibrinogen ș i elastina . Legătura care se stabilește î ntre
tulpina de S. aureus și fibronectina umană , prin intermediul FnBPA, este co nsiderată etapa
inițială critică în patogeneza infecț iilor asoc iate dispozitivelor protetice (Ton g și colab.,
2015).

74

Fig. 32
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena fnbA. Linia 1 – marker DNA 100 0bp
(Promega), toate tulpinile sunt pozitive (liniile 2 -11) și 12 – control negativ.
Studiile de a naliză genomică a numeroase tulpini de S. aureus MRSA izolate din
diferite situsuri au confirmat rezultatele noastre (Peacock ș i colab., 2002, Cot ar și colab.,
2010, Liu ș i colab., 2012, Aggarwal și colab., 2019, Verdu -Expo sito și colab., 2020). Însă,
în studi ile realizat e de Ionescu ș i colab ., în anul 2015 și de Sedagha t și colab., 2018, tulpini
de S. aureus MRSA și MSSA au fost negative pentru gena care codifică proteina de legare
a fibronectinei A .
Rezultatele pe ntru detecția simultană a genelor fnbB și fib, au demonstrat abse nța
genei fnbB și pre zența genei fib (Figura 33). Familia receptinelor secretate sau a
moleculelor de aderență secretate (Secretable Expanded Repertoire Adhesive Molecules –
SERAMs), este intens reprezentată în râ ndul tulpinilor a nalizate, genele fib și coag
regăsindu -se la toate tulpinile (Figura 3 4).

Figura 33
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR multiplex pentru detecția simultană a genelor fnbB și fib.
Linia 12 – martor de greutate moleculară -marker DNA 100 0bp (Pr omega), 1 1 – control negativ.
Fibrinogenul are rol atât în apărarea antiinfecț ioasa a gazdei, câ t și în virulenț a
patogenilor. Capacitatea fibrinogenului de a com bate patogenii este contracarată de
multiplele s trategi i ale tulpinilor de S. aureus din medi ul spitalicesc, cum ar fi secreț ia

75
coagulazelor , ce determină coagular ea sâ ngelui prin activarea protrombinei . Complexul
coagul ază-protrombină recunoaște î n mod specific fibrinogenul și î l transformă în fibrină
(Crosby ș i colab., 2016 ; Pietrocola ș i colab. , 2017).

Fig. 34
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena coag . Linia 1, 5, 6, 15 – marker DNA 10 00bp
(Promega) și 14 – control negativ.
S. aureus produce o varietate largă de toxine ș i proteine, care inactivează celulele
sistemului imunitar prin eliberarea de citokine mediată de superantigene sau prin
citotoxicitate directă, în cazul acțiunii hemolizinelor.
Numeroase tulpinile secretă un grup de citotoxine care include 4 hemolizine
distincte antigenic (alfa, beta, gamma și delta). Funcția principală a hemolizinelor este de a
converti componentele tisulare în nutrienți disponibili metabolismului bacterian. Unele
tulpini produc una sau câteva exoproteine suplimentare, reprezentate de toxina sindromului
de șoc toxic (TSST -1), enterotox inele stafilococice (SEA…SEE și SEG…SEQ), toxinele
exfoliative (ETA, ETB) și leucocidina Panton -Valentine. Funcția principală a toxinelor
este de a inhiba răspunsul imun al gazdei față de S. aureus , dar fiecare toxină exercită și
funcții biologice specific e, responsabile de manifestări clinice particulare ( Tam ș i Torres,
2020 ).
Rezultatele PCR multiplex pentru detecția genelor care codifică toxinele produse de
S. aureus , au arătat că gena hlg a fost prezentă în toate tulpinile testate, în timp ce gena luk-
PV a fost absent ă (Figura 3 5). Aceste rezultate sunt în concordanță cu datele din literatură
conform cărora toate tulpinile ar prezenta gama -hemolizine, în timp ce PVL este produsă
de mai puțin de 9% dintre tulpini ( Ionescu ș i colab ., 2015, Hague ș i colab., 2017 ,
Aggarwal ș i colab., 2019 , Monteiro ș i colab. , 2019) . Totuși, gena PVL este frecvent
asociată cu leziuni necrotice ale pielii și cu pneumonia hemoragică necrotică severă și rar
întalnită în alte infecții produse de S. aureus , precum infecții le nosocomiale .

76

Figura 35
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru genele luk-PV și hlg. Linia 1 și 13 – marker DNA
1000bp (Promega) și 12 – control negativ.
În ceea ce priveș te gena tst responsabilă de producerea toxinei sindromului de șoc
toxic, rezultatele au arătat că nici o tulpină nu posedă capacitatea de a secreta această
exoproteină (Figura 3 6). Printre studii le care confirmă rezultatele obț inute se numără
analiza profilului molecular al factorilor de virulență realizată de Schaumburg ș i col ab.
(2011) , pe tulpini izolate de la voluntari asimp tomatici, personal medical dar și de la
pacienț i spitali zați. Procente s căzute de până în 20% au fost gă site și în cazu l studiilor
efectuate pe pacienț i din țări precum Olanda (Rijn ders ș i colab., 2009 ), Belgia (Nulens ș i
colab., 2008), Japonia (Parsonnet ș i colab., 2008).

Figura 36
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena tst. Linia 1 – marker DNA 100 0bp (Promega)
și 12 – control negativ.
Rezultatele PCR multiplex pentru detecția gen elor pentru enterotoxine ( seA, seB,
seC, seD și seE) au arătat prezența genei seA la 2 tulpini de S. aureus , respectiv tulpina 2
izolat ă din hemocultură și tulpina 6 izolată dintr-o infecție asociată cateteriză rii (Figura
37). Genele seb, sec, sed și see nu au fost evidențiate la nici una dintre tulpinile testate
(Figura 3 8).

77

Figura 37
Electroforegrama ampliconil or obținuți prin PCR pentru genele seA, seB și seC. Linia 1 și 13 – marker DNA
1000bp (Promega) și 12 – control negativ.

Figura 38
Electroforeg rama ampliconil or obținuți prin PCR pentru genele seD și seE. Linia 1 și 13 – marker DNA
1000bp (Promega) și 12 – control negativ.
Enterotoxinele au activitate proteazică, sunt difuzibile și manifestă tropism față de
mucoasa intestinală. Enterotoxinele sun t cauza frecventă a intoxicațiilor alimentare. Au
fost identificate 17 enter otoxine stafilococice (SEA…SEE ș i SEG…SEQ). Au calitate de
superantigene, se leagă de moleculele CMH II și induc stimularea policlonală a
limfocitelor T și manifestările de sindrom de soc toxic; prezintă numeroase variante
antigenice și sunt produse de 50% dintre tulpinile de S. aureus , atunci când contaminează
produse alimentare bogate în glucide și proteine ( Principato ș i Qian, 2014 ). Genotiparea
tulpinilor de S. aureus prin deter minarea pattern -ului toxinelor ar putea fi util ă în studiile
epidemiologice.

78
4.1.3 Concluzii
Sursele de izolare ale tulpinilor incluse în studiu au fost variate și reprezentate de
hemocultur i, exsudat e faringiene și nazale, uroculturi , cateter, lichid p eritoneal .
Determinarea profilurilor factorilor de virulență solubili la tulpinile studiate a
evidențiat faptul că tulpinile P. aeruginosa produc mai ales cazeinază, esculinază și
hemolizine, în timp ce cele de S. aureus sunt frecvent producătoare de lipa ze și lecitinaze.
Tulpinile de P. aeruginosa izolate din uroculturi și hemoculturi și cele de S. aureus
izolate din exsudate, sunt caracterizate printr -un nivel crescut de hidrofobicitate de peste
60%, corelat cu gradul ridicat de interacție cu celulele de la nivelul respectiv și capacitatea
crescută de a penetra țesuturile gazdei.
În urma studiului de evaluare cantitativă al gradului de aderență la substrat inert,
mai mult de 50% din totalul tulpinilor au fost pozitive la testul producerii de factor slime.
Tulpinile care s -au remarcat printr -un nivel crescut al gradului de aderență la substrat inert
fiind cele izolate din urocultură ( P. aeruginosa), hemoculturi și exsudate ( S. aureus ).
Un procent de 60% dintre tulpinile analizate au prezentat capacitatea de a forma
biofilme pe substrat inert și 80% au aderat la substratul celular, cu un pattern de aderență
de tip localizat sau agregativ.
Tulpinile de P. aeruginosa cât și cele de S. aureus izolate din hemoculturi exprimă
un nivel scăzut de aderență și invazi e a substratului celular, spre deosebire de cele izolate
din uroculturi care manifestă o capacitate ridicată de colonizare a celulelor epiteliale,
respectiv din ex sudate care au manifestat potenț ial invaziv.
În rândul tulpinilor de P. aeruginosa , analiza d istribuției genelor de virulență a
relevat faptul că t oate tulpinile prezintă minim șase gene de virulență din cele șapte
analizate, iar 80% au exprimat toți factorii de virulență. Profilurile genelor de virulență la
tulpinile de S. aureus au fost: fib+/fnbA+/hlg+/coag+/seA+ și fib+/fnbA+/hlg+/coag+/seA-.

79
4.2. OBIECTIVUL 2 Stabilirea profilurilor de rezisten ță ale tulpinilor clinice de P.
aeruginosa și S. aureus, la nivel fenotipic și genotipic
Una dintre strategiile timpurii de supraviețuire a le microorganismelor a implicat
producerea și secreția de molecule antimicrobiene care ar elimina orice concurent din
competiț ia pentru resursele energetice , dar nu ar afecta producătoru l. Fenomenul se
numeș te antibioz ă și are o semnificație funcțională opusă simbioze i. Dar bacteriile
producă toare de antibiotic e reprezintă o proporție foarte mică din tota lul
microorganismelor. Faptul că antibioticele se sintetizează la sfârșitul fazei de creștere, pare
să nu le confere un avantaj competitiv real. Următorul pas în acest război biochimic a
implicat dezvoltarea mecanismelor de rezistență ca metode de apă rare ale bacteriil or care
nu produc metaboliț i secundari antimicrobien i.
Astfel, pentru a înțelege originea și evoluția setului global de molecule care conferă
microorganismelor rezistența antimicrobiană, este necesar să conștientizăm că antibiotice le
acționează ca selectori și acceleratori ai mecanismelor de rezistență . Mecanisme le de
rezistență sunt selectate și transferate de la o bacterie la alta, deoarece trans ferul genic
orizontal este avantajos în medii le dinamice . Mai m ult, nivelul presiunii determină rata
evolutivă .
4.2.1 Materiale ș i metode
4.2.1.1 Determinarea calitativă a spectrului de sensibilitate la antibiotice – Metoda
difuzimetrică (Kirby -Bauer)
Pentru realizarea antibiogramelor s -au preparat suspensii bacteriene la densitatea
corespunzătoare standardului 0,5 Mc Farland (1.5 x 108 UFCml) din culturi tinere (culturi
de 24 h, dezvoltate pe mediu solid -Cetrimid – pentru tulpinile de P. aeruginosa și Chap man
– pentru tulpinile de S. aureus ). Plăcile cu mediu Mueller Hinton s -au însămânțat prin
tehnica însămânțării ,,în pânză‘‘, cu tamponul, folosind tulpinile de testat. La suprafața
mediului însămânțat s -au dispus în mod steril, discurile cu antibiotice la distanțe egale cu
ajutorul pensei sterile (Buiuc ș i Negut, 2009) . S-au utilizat antibiotice semnificative clinic
(Tabelul 15 și 16). Plăcile au fost incubate la 37 șC, timp de 24 h. Citirea și interpretarea
rezultatelor s -a realizat prin măsurarea diametr elor zonelor de inhibiție generate de diferite
antibiotice, cu ajutorul unei rigle gradate , în conformitate cu normele CLSI 2017 ( Clinical
and Laboratory Standards Institute ).

80
Interpretarea rezultatelor s -a realizat în funcție de dimensiunea zonelor de inh ibiție,
exprimând rezultatul prin folosirea termenilor de sensibil (S), rezistent (R) sau intermediar
(I), conform Tabe lelor cu puncte critice standardizate și corespunzătoare metodei de lucru .
Termenii S, I, R definesc și categoriile de antibiotice, în fu ncție de efectul lor clinic
(Mihaescu și colab. , 200 7):
 categoria S – există probabilitate a mare ca antibioticul să elimine infecția determinată
de tulpina testată (CMI are valori net inferioare celor ale concentrațiilor umorale
obișnuite în urma administ rării unei doze obișnuite);
 categoria I – probabilitatea ca antibioticul să fie eficient in vivo prin administrare locală
sau prin realizarea în mod fiziologic a concentrațiilor mari în organe sau țesuturi la
nivelul cărora este localizat procesul infecți os;
 categoria R – administrarea antibioticului nu va determina eliminarea din organism a
microorganismului a cărui sensibilitate a fost testată sau rezultatul tratamentului este
imprevizibil.
Tabelul 15.
Antibioticele folosite pentru testarea s ensibilită ții tulpinilor de P. aeruginosa
Antibiotic Abreviere Clasa Concentraț ie (µG)
Colistin CS Polimixine
Amoxicilină -acid
clavulanic AMC Β-lactamină/inhibitor i
de β-
Lactamază 3
Ampicilină -sulbactam SAM 30
Piperacilină –
tazobactam TZP 40
Imipenem IPM Carbapeneme 10
Meropenem MER 10
Cefotaxim CTX Cefalosporine IIIG 30
Ceftazidim CAZ 10
Cefepim FEP Cefalosporine IVG 30
Gentamicină CN Aminoglicozide 30
Amikacină AK 30
Ciprofloxacin CIP Fluorochinolone 5
Levofloxacin LEV 5
Trimethoprim –
sulphamet hoxazol SXT Sulfamide 25
Tabelul 16.
Antibioticele folosite pentru testarea sensibilit ății tulpinilor de S. aureus
Antibiotic Abreviere Clasa Concentraț ie (µG)
Penicilină P Peniciline 10 U
Ampicilină AMP 30
Cefoxitin FOX Cefalosporine IIG 30
Gentam icină CN Aminoglicozide 30
Amikacină AK 30
Rifamicină RA Rifamicine 30
Tetraciclină TE Tetracicline 30

81

Linezolid LZD Oxazolidinone 30
Eritromicină E Macrolide 15
Claritromicină DA Lincosamide 2
Ciprofloxacin CIP Fluorochinolone 5
Levofloxacin LEV 5
Trimethoprim –
sulphamethoxazol SXT Sulfamide 25
Vancomicină VA Glicopeptide 30
4.2.1.2 Evidenț ierea fenotipică a mecanismelor de rezistență la antibiotice
Testul ,,treflei’’ sau Hodge modificat
Pentru evidențierea metalo β -lactamazelor produse
de tu lpinile de P. aeruginosa , s-a insămânțat ,,în pânză‘‘ o
tulpină de E. coli sensibilă la carbapeneme, s -a dispus în
centrul plăcii un disc de imipenem și s -au însămânțat în
striuri perpendiculare pe disc , tulpinile de testat. Apariția
unui aspect de treflă datorat inducerii zonei de inhibiție
indică prezența carbapenemazelor (Figura 39).
FIGURA 39
Hodge modificat. (Tulpinile 1 ș i 3 sunt tulpini pozitive , producătoare de metalo β -lactamazele ) – Schemă
realizată cu ajutorul programul ui BioRender .
Fenotipul MLSb inductibil
Pentru evidențierea mecanismului de rezistență inductibilă la tulpinile de S. aureus ,
s-au plasat discuri cu
eritromicină și clindamicină, pe
aceeași placă, la o distanță de 25
mm (Figura 40). Apariția
fenomenului d e antagonism
între cele doua discuri indică
prezența mecanismului de
rezistență inductibilă la
lincosamide și streptogramine.
FIGURA 40
Fenotipul MLSb . Schemă realizată cu ajutorul programului
BioRender.
4.2.1.3 Eviden țierea genelor de rezisten ță
Obținerea ADN bacterian pentru screening -ul genelor de rezistență s -a rea lizat pri n
metoda extracț iei alc aline. Verificarea produsului obținut s -a realizat prin electroforeză în

82
gel de agaroză 1% și colorare cu bromură de etidiu 3,5 μg/ml. În urma observării
fenotipurilor bacteriene obținute cu aj utorul testelor anterioare, s -a realizat veri ficarea
existenței câtorva gene frecvent asociate c u producerea de β -lactamaze, β -lactamaze de
spectru extins și quinolone și anume genele: bla VIM, bla IMP, bla SPM, bla SIM, bla PER, bla TEM,
bla SHV, bla CTX -M, bla GES, bla NDM, bla OXA -48, bla KPC, bla VEB, qnrA, qnrB, qnrS, utilizând
mixul de reacț ie – GoTaq® Green Master Mix (Promega , USA) . Pentru amplificarea
acestor gene, s-au folosit primeri descriși în literatură, conform Tabelul ui nr. 17.
Tabelul 17
Secvența de nucleotide a primerilor utilizați pentru ampli ficarea genelor de rezist ență de la P.
aeruginosa

Gena Primer Secvența de nucleotide Mărime
amplicon (bp) Referință
bla VIM VIM -F
VIM -R 5‘-GATGGTGTTTGGTCGCATA -3‘
5‘-CGAATGCGCAGCACCAG -3‘ 390
Poirel ș i colab.,
2011 bla IMP IMP-F
IMP-R 5‘-GGAATAGAGTGGCTTAA(C/T )TCT C-3‘
5‘-GGTTTAA(C/T)AAAACAACCACC -3‘ 232
bla SPM SPM -F
SPM -R 5´AAAATCTGGGTACGCAAACG 3´
5´ACATTATCCGCTGGAACAGG 3´ 271
bla SIM SIM-F
SIM-R 5´TACAAGGGATTCGGCATCG 3´
5´TAATGGCCTGTTCCCATGTG 3´ 570
bla PER PER-F
PER-R 5‘-AATTTGGGCTTAGGGCAGAA -3‘
5‘-ATGAATGT CATT ATAAAAGC -3‘ 925 Jiang și colab.,
2005
bla TEM TEM -F
TEM -R 5'- ATAAAATTCTTGAAGACGAAA -3'
5'- GACAGTTACCAATGCTTAATC -3' 1080 Farkas ș i colab.,
2019
bla SHV SHV -F
SHV -R 5'- TGGTTATGCGTTATATTCCCC -3'
5'- GGTTAGCGTTGCCAGTGCT -3' 868 Tew ș i colab.,
2016
bla CTX-
M CTX -M-F
CTX -M-R 5‘-CGCTGTTGTTAGGAAGTGTG -3‘
5‘-GGCTGGGTGAAGTAAGTGAC -3‘ 754 Ramachandran ș i
colab., 2017
bla GES GES -F
GES -R 5´GTTTTGCAATGTGCTCAACG 3´
5´TGCCATAGCAATAGGCGTAG 3´ 371 Queenan și Bush,
2007
bla NDM NDM -F
NDM -R 5‘-GGTTTGGCGATCTGGTTTTC -3‘
5‘-CGGAATGGCTCATCACGATC -3‘ 621
Poirel ș i colab.,
2011 bla OXA –
48 OXA -F
OXA -R 5‘-GCGTGGTTAAGGATGAACAC -3‘
5‘-CATCAAGTTCAACCCAACCG -3‘ 438
bla KPC KPC -F
KPC -R 5´CGTCTAGTTCTGCTGTCTTG 3´
5´CTTGTCATCCTTGTTAGGCG 3´ 798
bla VEB VEB -F
VEB -R 5‘-CGACTTCCATTTCCCGATGC -3‘
5‘-GGACTCGCAACAAATACGC -3‘ 643 Shariati și colab.,
2017
qnrA QnrA -F
QnrA -R 5‘- AGAGGATTTCTCACGCCAGG -3‘
5‘- TGCCAGGCACAGATCTTGAC -3‘ 580
Cattoir ș i colab.,
2007 qnrB QnrB -F
QnrB -R 5‘-GGAATAGAAATTCGCCACTG -3‘
5‘-TTTGCCGCCCGCCAGTCGAA -3‘ 264
qnrS QnrS -F
QnrS -R 5‘- GCAAGTTCATTGAAC AGGGT -3‘
5‘- TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG -3‘ 428
Reacțiile PCR s -au realizat în ThermoCycler MyResearch -BioRad , iar condițiile de
amplificare sunt prezentate în Tabelul 18.

83
Tabelul 18.
Etapele și condițiile reacț iilor PCR pentru detecț ia genelor de rezistență la P. aeruginosa
Condiț ii de amplificare
Tip PCR Gena Denaturare
inițială Denaturare Aliniere Extensie Elongare
Multiplex bla VIM
bla IMP 5‘, 950C 30‘‘, 950C 40‘‘, 550C 50‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Simplu bla SPM
5‘, 950C 30‘‘, 9 50C 40‘‘, 550C 50‘‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Simplu bla SIM 5‘, 950C 30‘‘, 950C 40‘‘, 520C 50‘‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Simplu bla PER
5‘, 950C 30‘‘, 950C 40‘‘, 550C 50‘‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Simplu bla TEM 5‘, 950C 30‘‘, 950C 40‘‘, 520C 70‘‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Simplu bla SHV
5‘, 950C 30‘‘, 950C 40‘‘, 560C 1‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Simplu bla CTX-M 5‘, 950C 30‘‘, 950C 40‘‘, 560C 1‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Simplu bla GES
5‘, 950C 30‘‘, 950C 40‘‘, 560C 50‘‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Simplu bla NDM 5‘, 950C 30‘‘, 950C 40‘‘, 550C 50‘‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Simplu bla OXA -48
5‘, 950C 30‘‘, 950C 40‘‘, 550C 50‘‘, 720C 5‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Simplu bla KPC 5‘, 950C 30‘‘, 950C 40‘‘, 550C 50‘‘, 720C 5‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Simplu bla VEB
5‘, 950C 30‘‘, 950C 40‘‘, 58.50C 50‘‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Multiplex QnrA
qnrB
qnrS 10‘, 950C 1‘, 950C 1‘, 540C 1‘, 720C 10‘, 720C
1 ciclu 35 cicluri 1 ciclu
În cazul tulpinilor de S. aureus , s-a verifica t existenț a gene lor blaZ, aacA -aphD,
ermA, ermC, tetK, tetM, cfr, 23S ARNr , utilizând u-se mixul de reacție – GoTaq® Green
Master Mix (Promega, USA). Pentru amplificarea acestor gene, au fost folosiți primeri
descriși în literatură, conform Tabelului 1 9, iar condițiile reactiilor PCR au fost descrise în
Tabelul 20.

84
Tabelul 19
Secvența de nuc leotide a primerilor utilizați pentru ampli ficarea genelor de rezist ență de la S. aureus
Gena Primer Secvența de nucleotide Mărime
amplicon
(bp) Referin ță
blaZ blaZ 1
blaZ 2 5‘-ACTTCAACACCTGCTGCTTTC -3‘
5‘- TGACCACTTTTATCAGCAACC -3‘ 173 Duran ș i colab.,
2012
aacA –
aphD aacA -aphD F
aacA -aphD R 5‘- TAATCCAAGAGCAATAAGGGC -3‘
5‘- GCCACACTATCATAACCACTA -3‘ 227
Dormanesh și
colab., 2015 ermA ermA -F
ermA -R 5´-AAGCGGTAAACCCCTCTGA – 3´
5´- TTCGCAAATCCCTTCTCAAC 3´ 190
ermC ermC -F
ermC -R 5´-AATCGTCAATTCCTGCATGT – 3´
5´-TAATCGTGGAATACGGGTTTG -3´ 299
tetK tetK 1
tetK 2 5‘- GTAGCGACAATAGGTAATAGT -3‘
5‘- GTAGTGACAATAAACCTCCTA -3‘ 360
tetM tetM 1
tetM 2 5'- AGTGGAGCGATTACAGAA -3'
5'- CATATGTCCTGGCGTGTCTA -3' 158
cfr Cfr-fw
Cfr-rv 5'-TGAAGTATAAAGCAGGTTGGGAGTCA -3'
5'-ACCATATAATTGACCACAAGCAGC -3' 746 Kehrenberg ș i
Schwarz, 2006
23S
ARN r 23S ARNr F
23S ARNr R 5‘-GCGGTCGCCTCCTAAAAG -3‘
5‘-ATCCCGGTCCTCTCGTACTA -3‘ 420 Pillai ș i colab.,
2002
Tabelul 20
Etapele și condițiile reacț iilor PCR pentru detecț ia genelor de rezistență la S. aureus
Condiț ii de amplificare
Tip PCR Gena Denaturar
e inițială Denaturare Aliniere Extensie Elongare
Simplu blaZ
3‘, 950C 30‘‘, 950C 30‘‘, 540C 30‘, 720C 4‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Simplu aacA-aphD
3‘, 940C 30‘‘, 940C 30‘‘, 550C 30‘‘, 720C 4‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Multiplex ermA
ermC 3‘, 940C 30‘‘, 940C 30‘‘, 550C 30‘‘, 720C 4‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Multiplex tetK
tetM 3‘, 940C 30‘‘, 940C 30‘‘, 550C 30‘‘, 720C 4‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Multiplex Cfr
23S ARN r 2‘, 940C 10‘‘, 940C 30‘‘, 550C 30‘‘, 720C 7‘, 720C
1 ciclu 30 cicluri 1 ciclu
Produ șii reacției PCR au fost evaluați cu ajutorul electroforezei în gel de agaroză
1%. Lungimea moleculelor de ADN obț inute a fost estimată prin compararea cu un marker
molecular de ADN de greutate de 100 0 pb. Rezultatele au fost examinate cu ajutorul unui
transiluminator cu UV.

85
4.2.2 Rezultate și discuț ii
4.2.2.1. Determinarea calitativă a spectrului de sensibilitate la antibiotice
În urma citirii rezultatelor prin măsurarea diametrelor zonelor de inhibiție a
creșterii determinate de diferitele antibiotice, s -a constatat că majoritatea tulpinilor incluse
în studiu sunt multirezistente ( Figurile 41, 42 ). În rândul tulpinilor de P. aeruginosa ,
singura tulpină sensibilă la acțiunea mai multor clase de antibiotice și anume la:
cefalosporine, carbapeneme și aminogl icozide este P. aeruginosa 5, izolată dintr -un
exsudat faringian (Tabelul 21) .
Tabelul 21
Profilul de rezistență al tulpinilor de P. aeruginosa .
CT-colisti n, AMC -amoxicilin -acid clavulanic, CAZ -ceftazidim, FEP -cefepim, AK-amicacin ă, IMP-imipenem , TZP-piperacilină –
tazobactam, MEM -meropenem, CN-gentamicină , CIP-ciprofloxacin, LEV -levofloxacin, SXT -Trimetoprim /Sulfametoxazol , SAM –
ampicilină -sulbactam, CTX -cefotaxim.

Figura 41
Reprezentarea grafic ă a profilului de rezisten ță al tulpinilor de P. aeruginosa .
Tulpina Antibiotice
P.
aeruginosa Sursa de izolare CT AMC CAZ FEP AK IMP TZP MEM CN CIP LEV SXT SAM CTX
1 Hemocultură S R R R R R R R R R R R R R
2 Hemocultură S R R R R R I R R R R R R R
3 Hemocultură S R R R R R R R R R R R R R
4 Hemocultură S R R R R R R R R R R R R R
5 Exsudat faringian S R S S S S R S R R R R R R
6 Urocultură S R R R R R R R R R R R R R
7 Urocultură S R R R R R R R R R R R R R
8 Urocultură recoltată
intraoperator S R R R R R I R R R R R R R
9 Urocultură recoltată
intraoperator S R R R S R S R R R R R R R
10 Urocultură recoltată
intraoperator S R R R R R S R R R R R R R

86

Figura 42
Reprezentarea grafic ă a profilului de rezistență al tulpinilor de S. aureus .
Comparativ , tulpinile de S. aureus prezintă un pattern de rezistență multiplă net
scăzut față de tulpinile de P. aeruginosa . Tulpinile de S. aureus cu un spectru larg de
rezistență sunt: S. aureus 2, 6 și 7 (izolate din hemocultură, de la nivelul cateterului urinar
și din lichid peritoneal) (Tabelul 22) .
Tabelul 22.
Profilul de rezistență a tulpinilor de S. aureus
VA-vancomicină , LZD -linezolid, CIP -ciprofloxacin, RF -rifampicin, LEV -levofloxacin, AK -amicacin ă, SXT –
Trimetoprim/Sulfameto xazol , CN -gentamicină, AMP – ampicilină, P -penicilină, FOX -cefoxitin, E -eritromicină, DA -clindamicină , TE –
tetracicli nă.
4.2.2.2. Evidenț ierea fenotipică a mecanismelor de rezistență la antibiotic e
Fenotipul de rezistență MRSA
Prin plasarea discurilor de ant ibiotice pe placă într -o anumită ordine, s -a permis
citirea interpretativă a testelor de sensibilitate și detectarea fenotipică a unor mecanisme de
rezistență. Rezistența la cefoxitin, un marker al polirezistenței , a evidențiat faptul că toate Tulpina Antibiotice
S.
aureus Sursa de izolare VA LZD CIP RF LEV AK SXT CN AMP P FOX E DA TE
1 Hemocultură S S S S S S S S R R R R R R
2 Hemocultură S S R R R R S R R R R R R R
3 Hemocultură S S S S S S S S R R R R R R
4 Hemocultură S S S S S S S S R R R R R R
5 Exsudat faringian S S S S S S S S R R R R R R
6 Cateter S S R R R R S R R R R R R R
7 Lichid peritoneal S S R R R R S R R R R R R R
8 Exsu dat faringian S S S S S S S S R R R R S R
9 Exsudat nazal S S S S S S S S R R R R R R
10 Exsudat nazal S S S S S S S S R R R R R R

87
tulpinile de S. aureus sunt tulp ini meticilino -rezistente , tulpini care în mediul
intraspitalicesc creează probleme terapeutice dificile de tratat.
Testul ,,treflei’’ sau Hodge modificat
Tulpinile de P. aeruginosa producătoare de metalo -β-lactamaze sunt patogeni
noso comiali de temut datorită faptului că prezintă rezistență la toate antibioticele β –
lactamice, cu excepția monobactamilor. Prin realizarea testului Hodge modificat, s -a
evidentiat că 3 dintre tulpinile de P. aeruginosa sunt producătoare de metalo -β-lactamaz e,
și anume tulpinile 2, 3, 8 (izola te din hemoculturi și urocultură ) (Tabelul 23, Figura 43).
Tabelul 23
Prezența metalo β -lactamazelor, în urma efectuă rii testului ‗‘treflei‘‘
Tulpina Metalo -β-lactamaze
P. aeruginosa 1 Negativ
P. aeruginosa 2 Pozitiv
P. aeruginosa 3 Pozitiv
P. aeruginosa 4 Negativ
P. aeruginosa 5 Negativ
P. aeruginosa 6 Negativ
P. aeruginosa 7 Negativ
P. aeruginosa 8 Pozitiv
P. aeruginosa 9 Negativ
P. aeruginosa 10 Negativ
Figura 43
Testul ,,treflei‘‘ sau Hodge modificat – evidențierea metalo β -lactamazelor.
Fenotipul de rezistență MLSb inductibil
Macrolidele, lincosamidele și streptogramina B sunt antibiotice cu structură
diferită, dar cu aceeași țintă de acțiune. Aceste antibiotice inhibă sinteza proteinelor
bacteriene prin legarea la ARNr 23S în subunitatea ribozomală 50S. Eritromicina
(macrolid) și clindamicina (o lincosamidă) sunt utilizate la scară largă în tratamentul
infecțiilor cu S. aureus . Clindamicina reprezinta o opțiune de tratament ideală datorită
absorbției ora le foarte eficientă, capacității crescute de a penetra țesuturi și posibilitatea
utilizării acesteia ca antibiotic alternativ la pacienții alergici la penicilină. De asemenea, s -a
demonstrat că clindamicina inhibă producerea toxinelor și a factorilor de vi rulență datorită
faptului că inhibă sinteza proteinelor (Abbas și colab., 2015). Cu toate acestea, rezistența la
eritromicină și clindamicină este într -o continua creștere în rândul izolatelor clinice de S.
aureus . Expresia rezistenței la MLSb poate fi con sititutivă (ARN -metilaza este sintetizată
continuu, fără preexpunere la antibiotic) sau inductibilă (ARN -metilaza este produsă numai
în prezența unui agent inductor). Șase dintre tulpinile testate prezintă fenotipul de

88
rezistență inductibilă (Figura 44), iar 3 dintre tulpini sunt caracterizate de rezistență
constitutivă (Tabelul 24).
Tabelul 24.
Prezenta fenotipului de rezistență MLSb
Tulpina MLSb
S. aureus 1 Inductibil
S. aureus 2 Inductibil
S. aureus 3 Constitutiv
S. aureus 4 Constitutiv
S. aureus 5 Inductibil
S. aureus 6 Inductibil
S. aureus 7 Inductibil
S. aureus 8 Negativ
S. aureus 9 Constitutiv
S.aureus 10 Inductibil

Figura 44
Fenotipul de rezistență MLSb inductibil.
Datorită rezistenței antimicrobiene intrinseci și dobândite, numai anumite clase de
antibiotice sunt eficiente în tratamentul infecțiilor cu P. aeruginosa . Dintre aceste
antibiotice, carbapenemele au fost considerate ca fiind cele mai eficiente β-lactamice
împotriva bacililor Gram negativi MDR, inclusiv P. aeruginos a datorită afinității lor înalte
pentru proteinele care leagă penicilina, stabilității față de β -lactamazele cu spectru extins
(ESBL) și capacităț ii de a traversa membran a extern ă bacteri ană (Hong și colab., 2015).
Rezistența la carbapeneme este considerat ă o provocare în clinică , în momentul de față
exist ând puține opțiuni terapeutice pentru pacienții infectați cu tulpini de P. aeruginosa , în
timp ce rezistența la carbapeneme este frecvent asociată cu multirezistența.
4.2.2.3. Evidenț ierea genelor de rezi stență la tulpinile de P. aeruginosa
Tulpinile de P. aeruginosa prezintă rezistență naturală prin mecanisme de
impermeabilitate, eflux, prod ucerea de enzime inactivatoare și modificarea ț intelor.

89
Fenotipul să lbatic este legat de producerea un ei cefalospor inaze inductibile în
prezența aminopenicilinelor și cefalosporinelor din prima ș i a doua gener ație, cuplată cu
impermeabilitate și un sistem de eflux constitutiv. Acest e mecanisme determină apariția
rezistenț ei la aminopeniciline, ca atare sau asociate c u inhibitori ai β -lactamazelor ș i la
cefalosporinel e din prima ș i a doua gener ație, cu conservarea sensibilităț ii la
carboxipeniciline, ureidopeniciline, la a numite cefalosporine din generația a treia, la
monobactami ș i carbapeneme.
Rezistența dobândită apar e în urma manifestă rii mecanismelor enzimatice
(penicilinaze, cefalosporinaze, β -lactamaze cu spectru extins -BLSE, metalo -enzime ).
Tabelul 25
Profilul genelor de rezistență la tulpinil e de P. aeruginosa .
Tabelul 25 (cont.)
Profilul genelor de rezistență la tulpinil e de P. aeruginosa . Tulpina Determinantul de rezistență
P.
aeruginosa Sursa de izolare bla VIMlike bla IMPlike bla SPMlike bla SIMlike Bla NDMlike Bla PERlike Bla VEBlike Bla TEM like
1 Hemocultură – + – – – – + –
2 Hemocultură + – – – – – – –
3 Hemocultură + – – – – – – –
4 Hemocultură + – – – – – – –
5 Exsudat faringian – – – – – – – –
6 Urocultură – + – – – – + –
7 Urocultură – – – – – – + –
8 Urocultură recoltată
intraoperator – + – – – – + –
9 Urocultură recoltată
intraoperator – – – – – + – –
10 Urocultură recoltată
intraoperator – – – – – – + –
Tulpina Determinantul de rezist ență
P.
aeruginosa Sursa de izolare Bla CTX-
Mlike Bla GESlike Bla SHV like Bla OXA -48like Bla KPClike qnrA qnrB qnrS
1 Hemocultură + – – – – – – –
2 Hemocultură + + – – – – + –
3 Hemocultură + + – – – – + –
4 Hemocultură + + – – – – + –
5 Exsudat faringian + + – – – – – –
6 Urocultură + + + – – + + –
7 Urocultură + + + – – + – –
8 Urocultură recoltată
intraoperator + + + – – + – –
9 Urocultură recoltată
intraoperat or + + – – – + + –
10 Urocultură recoltată
intraoperator + + + – – + – –

90
Metalo -β-lactamazele din familia VIM (Verona Integron -Encoded Metallo -beta-
lactamase ) au fost descrise prima dată în Europa în 199 9, în Italia . În prezent, β –
lactamazele blaVIMlike constau în 60 de variante, identificate în cea mai mare parte la
izolate clinice de P. aeruginosa (Lopez ș i colab., 2019 ) și asociate casetelor genice ale
integronilor din clasa 1 (Nordmann și colab., 2011). Dintre acestea mai puț in de 10 enzime
au fost ca racterizate biochimic și structural (Makena și colab., 2015 ). Gena bla VIM-4 a fost
descrisă prima dată la izolate clinice de P. aeruginosa din Grecia în 2001, ulterior
semnalată în Suedia și reprezintă o variantă a genei bla VIM-1, având o substituție la ni velul
unui singur aminoacid (Ser228Arg) (Pournaras și colab., 200 2). Tulpinile de P. aeruginosa
prezintă cel mai des g ena bla VIM-2, care are o secvență cu o similitudine de ~90% cu gena
bla VIM-1 (Borgianni și colab., 2010). În Norvegia și Suedia genele bla VIM-2 și bla VIM-4 au fost
semnalate în cocirculație cu bla IMP-14 la izolate clinice de P. aeruginosa (Samuelson și
colab., 2010).
Metalo -β-lactamazele VIM prezintă specificitate de substrat mai ridicată
comparativ cu cele din familia IMP, fiind capabile s ă hidrolizeze 6 -α-metoxi -penicilinele;
în plus acestea prezintă cea mai mare afinitate pentru carbapeneme (Docquier și colab.,
2003).
În urma analizei rezultatelor produș ilor de amplificare a i reacției multiplex PCR
pentru detecția simultană al genelor blaVIMlike și bla IMPlike , au arătat că trei din ce le 10
tulpini analizate prezintă gena bla VIMlike, și anume tulpinile 2, 3, 4 izolate exclusiv din
hemoculturi (Figura 45). În ceea ce priveș te gena bla IMPlike, două tulpini izolate din
uroculturi și o tulpină izolată din hemocultură au prezentat acest tip de metalo -β-lactamaz ă
(P. aeruginosa 1, 6, 8). În 2015, î ntr-un studiu realizat de Dortet și colab., s -a dovedit
circulația genelor care codifică carbapenemazele de tip VIM -2 și IMP -13 în râ ndul
tulpinilor de P. aeruginosa circula nte în Spitalul de Boli Infecț ioase, Cluj -Napoca.
Tulpinile au fost izolate cu precădere, din hemoculturi ș i uroculturi. Diseminarea la nivel
național al genelelor bla VIMlike și bla IMPlike a fost evidențiată și î n studi ile realizat e de
Gheorghe ș i colab. (2015) , Mereuta ș i colab. (2013) și Matros ș i colab. (2016) .

91

Figura 45
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR multiplex PCR pentru detecția simultană a genelor
bla VIMlike și bla IMPlike . Liniile 1, 13 – martor de greutate mol eculară -marker DNA 100 0bp (Promega), 1 1 –
control negativ .
Imipenemaza 1 a fost izolată pentru pr ima oară în Japonia, în 1988, având
localizare extracromozomală ș i anume pe un integron localizat pe o plasmidă conjugativă .
Din cele 51 de variante cunoscute de blaIMP (imipenem -hydrolyzing β -lactamase ), 33 au
fost identificate la tulpini de P. aeruginosa (Potron ș i colab., 2015) . Enzimele IMPlike sunt
împărțite î n mai multe subgrupuri, iar pr ocentul de identitate al secvenței aminoacizilor
variază foarte puțin , între 90 ș i 99 de procente . Toate imipenemaze le prezintă activităț i
hidrolitice foarte similare iar acest lucru denotă din faptul că au o similitudine a secvenț ei
de aminoacizi (Pournaras și colab., 2013).
Metalo -β-lactamaza SPM ( Sao Paulo metallo -β-lactamase ) conferă rezistență la
toate an tibioticele β -lactamice, mai puțin la aztreonam. Această enzimă a fost izolată
pentru prima dată în 1997, î n Brazilia , la o tulpină de P. aeruginosa multi -rezistentă, de la
o pacientă în vârstă de 4 ani cu leucemie, din Sao Paolo (Toleman și colab., 2002) . În 2007
s-a semnalat prezenț a genei bla SPM -1 în Europa , mai e xact î n Elveția la o tulpină de P.
aeruginosa provenit ă de la un pacient internat inițial î n Brazilia (Sal abi și colab., 2010).
Gena poate fi codificată crom ozomal sau plasmidial. Tulpinile analizate nu au prezentat
carbapenemaze codificate de gena bla SPM (Figura 46).

92

Figura 46
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena bla SPM like. Linia 11 – martor de
greutate moleculară -marker DNA 100 0bp (Promega), 1 2 – control negativ .
Gena bla SIMlike (Seoul imipenemase ) codifică metalo -β-lactamaze cu o similitudine
de până la 69% cu cele din familia IMP. Aceste enzime fac parte din c lasa B a
carbapenemazelor, clasă care se diferențiază prin susceptibilita tea la acid
etilendiaminotetraacetic (EDTA) și la alți cationi divalenț i deoarece sunt chelatori de Zn2+
(Queenan ș i Bush, 2007) .
Investigarea in vitro a secreț iei de enzimă SIMlike prin detecț ia genei bla SIMlike au
arătat că nici unul dintre izolatele an alizate nu exprimă a ceastă genă . Acest lucru se
datorează faptului că această proteină a fost izola tă destul de rar, iar până în momentul de
față s -au găsit doar două forme al e acestei proteine. SIM -2 diferă de SIM -1 prin substituți a
glicinei cu aspartat î n pozitia 198 (Sun ș i colab., 2016).
Enzimele NDM ( New Delhi metallo -β-lactamase ) sunt printre cele mai noi metalo –
β-lactamaze identificate, capabile să hidrolizeze toate penicilinele, cefalosporinele și
carbapenemele, cu excepț ia aztreon amului. Sunt gene localizate atât la nivelul
cromozomilor cât și la nivelul plasmidelor (Khan ș i colab., 2017). NDM -1 a fost izolată
pentru prima dată la tulpini de Klebsiella pneumoniae și E. coli, de la un pacient care a fost
internat anterior la un spital din New Delhi, India, în 2007 (Johnson ș i Woodford, 2013).
De atunci, mai mult de 21 de variante suplimentare de NDM au fost identificate în P.
aeruginosa , Acinetobacter baumannii și Enterobacteriaceae (Cheng ș i colab., 2018).
Tulpinile de P. aeruginosa producătoare de N DM-1 au fost raport ate pentru prima dată în
Europa, în 2011, în Serbia (Jovcic ș i colab., 201 1). În Roman ia primele date legate de
apariția genei NDM au fost făcute în anul 2014, enzimele regă sindu -se la tulpini de
Enterobacter cloacae (Deshpande și colab. , 2014). În schimb, în studiul de față, nici o
tulpină nu a prezentat capacitatea de a sintetiza enz imele din familia NDM .

93
Analiza produ șilor de amplificare ai reac ției PCR pentru detec ția genei bla PERlike a
arătat că doar tulpina de P. aeruginosa 9 (Figur a 47), izolat ă din urocultur ă posed ă aceast ă
β-lactamaz ă de spectru extins. β -lactamazele de spectru extins (BLSE) confer ă patogenilor
rezisten ță extins ă la cefalosporine, dar in vitro sunt inhibate de acid clavulanic și
tazobactam (Potron și colab., 2015) .

Figura 47
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena bla PERlike. Liniile 1, 13 – martor de
greutate moleculară -marker DNA 100 0bp (Promega), 1 2 – control negativ .
Gena bla PERlike (P. aeruginosa extended resistance ) a fost inițial descr isă în 199 1, la
un izolat clinic de P. aeruginosa de la un pacient turc spitalizat în Franța ( Tada și colab.,
2017 ), doi ani mai t ârziu izolându-se și la tulpini de Salmonella enterica și Acinetobacter
sp. în Turcia (Moghaddam și colab., 2014). În prezent au fost descrise opt variante ale
genei bla PERlike care prezintă omologie de p ână la 85% și pot fi transmise at ât pe orizontal ă
(plasmidial) c ât și pe vertical ă, prin localizarea acestora pe cromozom (Li și colab., 201).
O alt ă enzim ă care este înrudită cu PER-1 este β-lactamaz a de tip VEB -1, între
acestea exist ând un grad de omologie de 40-50%. Aceste enzime confer ă rezisten ța la
oxyimino -cefalosporine și aztreonam. Tulpinile identificate ca av ând gena bla VEBl ike sunt
predominant cele izolate din urocult uri, respectiv tulpinile 6, 7, 8, 10 dar și tulpina 1 care
este izolat ă din hemocultur ă (Figura 48).

94

Figura 48
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena bla VEBlike. Liniile 1, 13 – martor de
greutate moleculară -marker DNA 100 0bp (Prom ega), 1 2 – control negativ .
Deși este una din cele mai frecvent întâlnite β -lactamaze în rândul tulpinilor Gram
negative, în urma analizei genomului s-a observat c ă ampliconul de aproximativ 1080 bp,
ce confirmă prezența β -lactamaze i de tip TEM nu a fost identificat la tulpini le studiate.
Până în prezent au fost descrise 204 variante ale genei bla TEMlike (Temone ira) care
difer ă structural prin pozi ția a 87 de aminoacizi, ceea ce le confer ă o stabilitate diferit ă.
Substitu țiile aminoacizilor din structura p roteinelor TEM au fost selectate eficient, sub
presiunea utiliz ării excesive a β-lactam icelor , ceea ce a dus la împărțirea acestor enzime în
două grupe (Dhara și colab., 201 3):
 β-lactamaze de spectru larg ce hidrolizează penicilinele și cefalosporinele
 β-lactamaze rezistente la inhibitori (prezintă spectru similar de hidroliză cu prima
categorie , însă nu sunt inhibate de acidul clavulanic )
Enzimele de tip CTX -M (cefotaxime -hydrolyzing β -lactamase ) au fost singurele β-
lactamaze de spectru larg detectate la toate tulpinile analizate (Figura 49). Beta-lactamaza
CTX -Mlike a fost descrisă inițial în 1989, la o tulpină de E. coli izolată în Germania.
BLSE de tipul CTX -M conferă rezistență la peniciline, cefalosporine, inclusiv la
ceftazidim și cefotaxime (Walther -Rasmussen și Hoiby, 2004) . În urma studiilor de
farmacocinetic ă s-a eviden țiat că β-lactamaz ele de tip CTX -M hidrolizeaz ă într-o propor ție
crescut ă antibioticele cefalotin și cefaloridine , comparativ cu benzilpenicilina. Cefotaxim a
este hidrolizat ă prefer ențial de c ătre CTX -M, în compara ție cu ceftazidim a. Referitor la
sensibilitatea fa ță de inhibitori, tazobactam are efect represor asupra genelor bla CTX-Mlike
mai intens spre deosebire de sulbactam și acid clavulanic (Tzouvelekis și colab., 2000).

95

Figur a 49
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena bla CTX-Mlike. Linia 1 – martor de
greutate moleculară -marker DNA 100 0bp (Promega), 2 – control negativ .
Din electroforegramă se observă ampliconul de aproximativ 371 bp, ceea ce
confirmă prez ența unei β-lactamaze de tip bla GESlike la 90% dintre tulpini le de P.
aeruginosa analizate (F igura 50).

Figura 50
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena bla GESlike. Liniile 1, 13 – martor de
greutate moleculară -marker DNA 100 0bp (Pro mega), 12 – control negativ .
Gena bla GESlike (Guyana Extended Spectrum β -lactamase ) a fost descris ă inițial în
2000, la o tulpină de K. pneumoniae (blaGES -1) din Guyana Franceză (Poirel și colab.,
2000). Genele care codific ă enzimele din familia GES au loc alizare plasmid ială (Dang și
colab., 2016). Denumite ini țial β-lactamaze de spectru extins (clasa A, Ambler) datorit ă
faptului c ă similar cu celelalte β -lactamaze nu hidrolizează monobactamii și sunt inhibate
de acidul clavulanic, piperacilină -tazobactam ș i imipenem. Ulterior, Poirel și colab. (2001)
au arătat că o substitu ție a glicinei din gena GES -1 cu asparagin ă, face ca enzima GES -2 să
capete activitate hidrolitic ă și asupra imipenemului. Până în prezent au fost identificate 31
de variante genice bla GESlike (Bonnin și colab., 201 7).
Gena bla SHVlike responsabil ă pentru transmiterea mediat ă cromozomal a rezisten ței
de tip BLSE a fost eviden țiată la tulpinile de P. aeruginosa codificate cu indicativele 6, 7,

96
8, 10, tulpini i zolate din uroculturi (Figura 51). Genele bla SHVlike sunt mai des întâlnite la
tulpini de K. pneumoniae . Majoritatea variantelor de enzime SHV sunt caracterizate de
prezen ța rezidului de serin ă în pozi ția 238 , prezența acesteia fiind critic ă pentru hidroliza
eficient ă a ceftazidimului, iar lizina din pozi ția 240 este esential ă pentru hidroliza
cefotaximului (Pf aller și Segreti, 2006).

Figura 51
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena bla SHVlike. Liniile 1, 4 – martor de
greutate moleculară -marker DNA 100 0bp (Promeg a), 13 – control negativ .
Enzimele de tip OXA confer ă rezisten ță la ampicilin ă și cefalotin , având activitate
hidrolitic ă ridicat ă împotriva oxacilinei și a cloxacilinei. Sunt enzime slab inhibate de
acțiunea acidului clavulanic ( Sahuquillo -Arce și colab. , 2015 ). Carbapenemazele de tip
OXA sunt grupate în nou ă clustere , dintre care clusterul 6 fiind asociat familiei
Enterobacteriaceae și incluz ând subfamilia OXA -48 (Hafi și colab., 2019).
Analiza genom ului tul pinilor MDR de P. aeruginosa incluse în studiu nu a
evidențiat prezența genei bla OXA -48like.
Enzima KPC ( Klebsiella pneumoniae carbapenemase ) este o enzim ă transferat ă
plasmidial. Aceste carbapenemaze pot hidroliza aminotiazol -cefalosporinele, cum ar fi
cefotaxim . Expansiunea KPC la nivelul Europei a f ost ini țiată în anul 2005, în Fran ța,
pornind de la un pacient tratat ini țial în New York (Naas și colab., 2005). Deși s-a
considerat c ă β-lactamazele KPC sunt caracteristice tulpinilor de Klebsiella pneumoniae ,
izolându-se cu prec ădere la aceste tulpini , prima raportare a genei bla KPC -2 la tulpini de P.
aeruginosa a fost în 2006 (Villegas și colab., 2007). Tulpinile din acest studiu nu au
prezentat gena pentru această carbapenemaz ă (Figura 52).

97

Figura 52
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena bla KPC like. Liniile 1, 9, 14 – martor de
greutate moleculară -marker DNA 100 0bp (Promega), 13 – control negativ .
Prima semnalare a rezisten ței la quinolone mediat ă plasmidial, prin determinan ții
Qnr, a fost în Statele Unite în 1998 , în cazul une i tulpini multirezistente de Klebsiella
pneumoniae , izolat ă din urocultur ă (Robicsek și colab., 2006) . Genele plasmidiale qnrA,
qnrB, qnrC, qnrD, qnrS , si qnrVC codific ă proteinele familiei de pentapeptide repetitive
care protejeaz ă ADN girazele și topoizo merazele IV de ac țiunea antibioticelor din clasa
quinolonelor. Prezen ța genelor qnrA, qnrB, qnrS protejeaz ă ADN giraza, cee a ce conduce
la o cre ștere de p ână la 32 de ori a concentra ției minime inhibitorii la quinolone (Jacoby și
colab., 2014 ). Genele qnr se găsesc adesea pe plasmide care con țin mai mul ți determinan ți
ai rezisten ței. În repetate r ânduri a fost raportat ă asocierea dintre genele qnr și
determinanții rezisten ței BLSE, prin asocierea cu enzimele CTX -M (Castanheira și colab.,
2008, Yang și colab ., 2012) , IMP (Espedido și colab., 2008) , VIM ( Aschbacher și colab.,
2008), KPC (Chmelnitsky și colab., 2008) , SHV (Pai și colab., 2007) , VEB (Poirel și
colab., 2007) .
În ceea ce prive ște rezultatele acestui studiu, în urma analizei genomului , gene le din
familia Qnr, responsabile de rezisten ța la quinolone , au fost qnrA și qnrB (Figura 53).
Gena qnrA a fost regăsită exclusiv la tulpinile uropatogene (tulpini codificate cu
indicativele 6 -10). Gena qnrB a fost caracteristic ă atât tulpinilor izolate din hemoc ulturi ( P.
aeruginosa 2, 3, 4), c ât și celor izolate din uroculturi ( P. aeruginosa 6, 9).

98

Figura 53
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR multiplex pentru detecția simultană a genelor
qnrA, qnrB și qnrS. Liniile 1, 13 – martor de greutate molec ulară -marker DNA 100 0bp (Promega), 1 2 –
control negativ .
Majoritatea izolatelor prezint ă între 2 și 5 gene de rezisten ță, iar tulpinile 6 și 8
izolate din urocultur ă prezint ă cei mai mul ți determinan ți, 7 respectiv 6 gene de rezisten ță.
În antitez ă, tulpin a de P. aeruginosa 5, izolat ă din ex sudat fariangian prezint ă cel mai mic
număr de determinan ți genetici (genele bla GESlike și bla CTX-Mlike). Tulpinile se pot încadra
așadar în mai multe profiluri, în func ție de gene le de rezisten ță identificate . În func ție de
prezen ța genelor care codific ă diferitele β -lactamazele (Figura 54), tulpinile au prezentat 6
pattern -uri. Izolatele din hemocultur ă, respectiv tulpinile 2, 3, 4 prezint ă acela și genotip de
rezisten ță, bla VIMlike -bla GESlik e-bla CTX-Mlike .

Figura 54
Distribuția genotipurilo r caracteristice β -lactamazelor la izolatele de P. aeruginosa MDR .
Cele mai commune genotipuri de rezistență la quinolone au fost qnrA+/qnrB- și
qnrA-/qnrB+ (Figura 55). Tulpinile 2, 3 și 4 izolate din hem ocultur i, au o caracteristic ă
comun ă legat ă de rezisten ța la quinolone, și anume profilul qnrA-/qnrB+.

99

Figura 55
Distribuția genotipurilor qnrA, qnrB la izolatele de P. aeruginosa MDR .
4.2.2. 4. Eviden țierea genelor de rezisten ță la tulpinile de S. aureus
Tulpinile MRSA sunt în lista agenților patogeni rezistenți la antibiotice cu priorita te
pentru g ăsirea unor tratamente eficiente. Încă de la prima datare a apari ției tulpinilor
MRSA asociate asisten ței medicale în 1961 , au apăr ut noi clone epidemice de MRSA care
nu afectează doar unit ățile spitalice ști, ci amenință întreaga comunitate. Rezisten ța la
meticilin ă (respe ctiv oxacilin ă) este considerat ă un marker al polirezisten ței incluz ând:
cefalosporinele, eritromicina și clinda micina, iar izbucnirile cu acest tip de tulpini au creat
probleme din punct de vedere al terapiei și imp licit al costului spitaliz ării. Multiple
fenotipuri de rezisten ță se reg ăsesc și în cazul tulpinilor de S. aureus analizate în acest
studiu ( Tabelul 26).
Tabelul 26
Profilul genelor de rezistență la tulpinil e de S. aureus .
Tulpina Determinant de rezisten ță
S. aureus Sursa de izolare blaZ aacA -aphD ermA ermC tetM tetK cfr Domeniul V –
23 S ARNr
1 Hemocultură + – – + – + – +
2 Hemocultură + + + – + – – +
3 Hemocultură + – – + – + – +
4 Hemocultură + – – + – + – +
5 Exsudat faringian + – – + – + – +
6 Cateter + + + – + – – +
7 Lichid peritoneal + + – + – + – +
8 Exsudat faringian + – – – – + – +
9 Exsudat nazal + – – + – + – +
10 Exsudat nazal + – – + – + – +

100
β-lactamicele sunt cele mai utilizate antibiotice datorit ă faptului c ă sunt mai pu țin
toxice și eficiente pentru o varietatea larg ă de infec ții. Cu toate acestea, r ezisten ța la
penicilin ă mediat ă prin producerea de penicilinaz ă a pus în eviden ță prezen ța gen ei blaZ la
toate tulpinile MRSA analizate (Figura 56). Enzima extracelular ă, penicilinaza ,
hidrolizeaz ă nucleul β-lactamic al penicilinei, inactiv ând-o.

Figura 56
Electroforegrama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena blaZ. Liniile 1, 12 – martor de
greutate moleculară -marker DNA 100 0bp (Promega), 13 – control negativ .
Genele care codific ă aminozid acetiltransferaza și aminozid fosfotransferaza sunt
responsabile de modificarea enzimatic ă a aminoglicozidelor. Cele doua gene au fost
dobândite din surse diferite, au fuzionat și au generat o ge nă hibrid ă, cu distribu ție larg ă la
stafilococi și enterococi. Enzima bifunc țional ă codificat ă de gena aacA -aphD este
sintetizat ă constitutiv și are localizare citoplasmatic ă. Modificarea enzimatic ă a
antibioticului este asociat ă cu o diminuare a afinit ății sale pentru proteinele ribozomale și
cu alterarea transportului antibioticului (Khoramrooz și colab., 2017) . Tulpinile de S.
aureus 2, 6 și 7 au ech ipamentul enzimatic de tip AAC6‘ -APH2‘‘ (Figura 57), acest
fenotip fiind clasificat ca cel mai r ăspândit determinant de rezisten ță, atât în Europa c ât și
în restul continentelor ( Mahdiyoun și colab., 2016, Fukutsuji și colab., 2013, Duran și
colab., 2012, M elter și colab., 2003) .

101

Figura 57
Electrofore grama ampliconilor obținuți prin PCR pentru gena aacA -aphD . Linia 1 – martor de
greutate moleculară -marker DNA 100 0bp (Promega), 2 – control negativ .
Tulpinile de S. aureus care de țin una din genele ermA , ermB și ermC prezint ă
rezisten ță la macrolide, stre ptogramine și lincosamide (MLSb) . Deși macrolidele,
lincosamidele și streptograminele au structur ă chimic ă diferit ă, genele de rezisten ță la
aceste antibiotice sunt studiate simultan deoarece ac ționeaz ă într-o maniera asemanatoare.
Aceste gene sunt purtate de transpozoni ( ermA ) sau plasmide ( ermB, ermC ) și induc
rezisten ța prin modificarea țintei ribozomale (Zhang și colab., 2019) . Tulpinile care posed ă
genele erm produc o metilaz ă responsabil ă de N6-dimetilarea specific ă în pozi ția 2058 a
adenine i din ARNr 23S. Dimetilarea determin ă schimbarea conforma ției molecule i de
ARN, iar acest proces reduce afinitatea MLS pentru ribozomi (Strommenger și colab.,
2003) .
Determinant ul genetic responsabi l pentru rezisten ța la MLSb, predominant
identificat în rândul tulp inilor de S. aureus analizate, a fost ermC . În consecin ță, în cazul
tulpinilor 1, 3, 4, 5, 7, 9, 10, rezisten ța la MLSb a fost dob ândită prin intermediul
plasmidelor. Tulpinile 2 și 6 au prezentat gena ermA (Figura 85).

Figura 58
Electroforegrama ampli conilor obținuți prin PCR multiplex pentru detecția simultană a genelor
ermA și ermC. Liniile 1, 9, 15 – martor de greutate moleculară -marker DNA 100 0bp (Promega), 2, 14 –
control negativ .

102
Genele tetK codific ă proteinele membranare tet care împiedic ă conce ntrarea
intracelular ă a antibioticului , datorit ă efluxului excesiv al acestuia prin membran a
citoplasmatic ă. Acest mecanism confer ă rezistent ă la tetraciclin e, dar nu și la minociclin e.
Genele tetM contribuie la mecanismul de rezisten ță la tetraciclin ă și minociclin ă prin
modificarea țintei ribozomale a acestor antibiotice (Khoramrooz și colab., 2017). Genele
tetK sunt sintetizate datorită codific ării plasmidial e, în schimb genele tetM sunt transmise
cromozomal sau prin transpozoni (Schmitz și colab., 2001) .
În urma caracteriz ării ampliconilor ob ținuți, au fost eviden țiate dou ă gene tet, dintre
care tetK a fost identificat ă la tulpinile 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10. Tulpina 2 prezint ă genotipul
tetM, iar tulpina MRSA 6, izolat ă dintr -o infec ție produs ă în urma ca teteriz ării, are ambele
gene prezente (Figura 59). Studiile realizate de Shittu și colab. (2011 ) și Khoramrooz și
colab. (2017 ) confirmă prezen ța predominant ă a genotipului de rezisten ță la tetracicline
transmis plasmidial. În studiul realizat de Schmitz și colab. (2001) s -au analizat peste 3000
de tulpini de S. aureus , din 20 de spitale și 12 țări europene și s-a observat c ă 50,5% dintre
tulpinile MRSA rezistente la tetraci cline prezentau ambele gene, tetM și tetK.

Figura 59
Electroforegrama ampliconilo r obținuți prin PCR multiplex pentru detecția simultană a genelor tetK
și tetM. Liniile 1, 13 – martor de greutate moleculară -marker DNA 100 0bp (Promega), 1 2 – control negativ .
Gena cfr și muta țiile punctiforme în domeniul V al genei 23S ARNr sunt
reprezen tative pentru determinarea rezisten ței la antibioticele care sunt active asupra
sintezei proteinelor bacteriene (cloramfenicol, lincosamide, oxazolidinone, pleuromutiline,
streptogramina A).
Amplificarea regiunii V a genei 23S ARNr s -a realizat utiliz ând primeri care
corespund secven ței de nucleotide a genei de la tulpini sensibile la linezolid. În urma
analizei fenotipului, s -a eviden țiat că toate tulpinile studiate sunt susceptibile la linezolid,
fenotip confirmat și genotipic, prin prezen ța secven ței regiunii V a genei 23S ARNr

103
(Figura 60). Linezolid este un antibiotic ob ținut prin sintez ă chimic ă și face parte din clasa
oxazolidinonelor (Hashemian și colab., 2018) . Rata de rezisten ță global ă la linezolid este <
1% (Pfaller și colab., 2017). Pe de alt ă parte achizi ția pe orizontal ă sau vertical ă a genei cfr
este un important obstacol în tratarea infec țiilor al căror agent etiologic este S. aureus
MDR , inclusiv la linezolid. De și nivelul de rezisten ță la linezolid sus ținut de gena cfr este
moderat, în stud iile in vivo , pe modele experimentale, realizate de Zhou și colab. (2018 ,
2020 ) s-a demonstrat capacitatea genei cfr de a îmbun ătăți supravie țuirea bacteriilor în
prezen ța linezolidului.
Absen ța genei cfr la tulpinile analizate indic ă faptul c ă tulpinile n u au capacitatea
de a sintetiza o metil -transferaz ă 23S ARNr și nu prezint ă rezisten ță încruci șată între
linezolid și alte antibiotice care inhib ă sintez a proteic ă. În concluzie, oxazolidinonele
rămân încă active asupra tulpinilor MRSA.

Figura 60
Electr oforegrama ampliconilor obținuți prin PCR multiplex pentru detecția simultană a genelor cfr și
23 S ARNr . Liniile 1, 13 – martor de greutate moleculară -marker DNA 100 0bp (Promega), 1 2 – control
negativ .
Tulpinile MRSA analizate au prezentat 4 profil uri de rezisten ță (Figura 61), cel mai
comun genotip reg ăsit fiind blaZ-aacA -aphD -ermC -tetK, identificat la 6 dintre tulpinile
MRSA.

104

Figura 61
Distribuția genotipurilor determinan ților de rezisten ță, între izolatele MRSA .
Deși toate tulpinile de S. aureus sunt rezistente la eritromicin ă, nici o tulpină nu
prezintă niciuna din tre gene le erm analizate , ceea ce indică prezența altor mecanisme care
induc rezistența la aceste antibiotice . Printre aceste mecanisme se pot enumera
permeabili tatea redusă a peretelui celular , pompele de eflux activ al antibioticului din
celula bacteriană , inactivarea antibioticelor prin clivaj enzimatic sau prin modificarea
structurii lor , modificarea muta țional ă a țintei antibioticului și accesul bacteriilor l a căi
metabolice secundare care compensează reacțiile inhibate de antibiotice.

105
4.2.3 Concluzii
Majoritatea tulpinilor incluse în studiu au fost multirezistente, cel mai extins profil
de rezistență fiind identificat la tulpinile de P. aeruginosa , urmate de cele de S. aureus
izolate din hemocultură, de la nivelul cateterului urinar și din lichid peritoneal.
Rezistența la cefoxitin a evidențiat faptul că toate tulpinile de S. aureus sunt tulpini
meticilino -rezistente (MRSA), 60% dintre tulpini prezint ă fenotipul de rezistență MLSb
inductibilă, iar 30% MLSb constitutivă.
Testul Hodge modificat a relevat producerea de metalo -β-lactamaze la tulpinile de
P. aeruginosa, izolate din hemoculturi și uroculturi.
Screening genelor de rezistență la carbapeneme a demonstrat prezența genelor
bla VIMlike la tulpinile de P. aeruginosa izolate din hemoculturi și bla IMPlike la tulpini izolate
din uroculturi și hemoculturi, precum și absența genelor pentru metalo -β-lactamaze de tip
SPMlike, SIMlike și NDMlike.
β-lactamaze le de spectru extins identificate la tulpinile de P. aeruginosa au fost:
bla CTX-Mlike prezentă la toate tulpinile de P. aeruginosa , urmată de bla GESlike , bla VEBlike și
bla SHVlike prezente în principal la izolatele din uroculturi.
Rezistența la quinolone m ediată de genele qnrA și qnrB a fost identificată la
majoritatea tulpinilor de P. aeruginosa .
Cel mai comun genotip prezent la tulpinile MRSA incluse în studiu a fost blaZ-
aacA -aphD -ermC -tetK.

106
4.3. OBIECTIVUL 3 Evaluarea unor sisteme pe baz ă de polimeri biodegradabili,
pentru eliberare a controlat ă a unor subs tanțe antimicrobiene
Structurile polimerice naturale sau sintetice, de dimensiuni reduse sunt o provocare
în lumea științifică, datorită caracteristicilor versatile ale compoziție i și structu rii,
comportamentul ui specific in vivo și posibilităților diverse de a proiecta substanțe
antimicrobiene micro – sau nanometrice (Jahangirian și colab., 2014). Sistemele de
eliberare controlată care au la bază polimeri , sunt utilizate pentru administrarea i nteligentă
a diferiților agenti antimicrobieni prin diferite căi și mecanisme de acțiune.
Avantajul polimerilor biodegradabili, naturali sau sintetici este biodegradabilitatea
ridicată in vivo , pe cale enzimatic ă și/sau nonenzimatic ă, rezultând monomeri
biocompatibili și netoxici care pot fi eliminați prin căile metabolice normale (Calzoni și
colab., 2019). Polimerii obtinu ți prin sinteza chimică sunt sustenabili pentru aplicații
biomedicale , deoarece pot fi obținuți mai ușor, iar proprietățile lor mecanic e și fizico –
chimice pot fi controlate mai amănunțit (Vasile și colab., 2020, Song și colab., 2018).
4.3.1 Materiale și metode
Activitatea antimicrobiană a fost testată pe două tulpini bacteriene Gram pozitive
(Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212) și două tulpini
Gram negative ( Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922) .
Capsaicina (CAP) și α-CD au fost ach iziționat e de la EMD Chemicals Inc,
Darmstadt, German ia, iar p robele testate au fost reprezentate de suspensii de 10 mg/mL în
dimetilsulfoxid (DMSO) și codificate după cum urmează: 1) Amestec mecanic α -CD-CAP ;
2) Complexul de sinteză α -CD-CAP ; 3) CAP standard; 4) DMSO . În cazul sistemelor pe
baza de PLGA pentru eliberarea controlat ă a gentamicinei , probel e testate au fost de
asemenea reprezentate de suspensii de 10 mg/mL în DMSO și codificate după cum
urmează: 1) PLGA -hidroxiapatită -gentamicină (PLGA -HA-CN); 2) PLGA -CN; 3) CN
standard ; 4) DMSO -control negativ.
4.3.1.1 Sintez a complexului α -CD-capsaicină
Inițial, o soluție de 3,05×10-3 M a fost preparată prin dizolvarea CAP într -un
amestec apă -alcool (v:v=7: 3). Prin solubilizarea atât a CAP cât și a α-CD s -a constatat că
este îmbun ătățită formarea complex ului α-CD-CAP . Pentru formarea complex ului s-au

107
utiliz at diferite concentrații de α-CD, cuprinse între 0 -2 mM. Apa și alcoolul (cei doi
solvenți) utilizați în sinteză au fost îndepărtați din faza lichidă prin evaporare până la
uscare (la etuvă). Cu ajutorul unui spectrometru de fluorescență și al unui spectro metru
UV-VIS, s-a stabilit stoechiometria complexului de incluziune.
4.3.1. 2 Sintez a complexului PLGA -gentamicină
În primul rând, o cantitate de 150 mg de gentamicină s-a dizolvat în faza apoasă
(400 ul de fosfat monosodic 0,1 M și fosfat disodic 0,1 M, pH = 6,3 cu 0,5% alcool
polivinilic -PVA) și apoi această soluție, A1, a fost adăugat ă la faza organică uleioasă (O),
200 mg PLGA în 5 ml diclorometan (DCM). Ini țial emulsia apă -ulei a fost agitată puternic
timp de 2 -3 minute la 45.000 rpm cu un omogenizato r special SilentCrusher. Soluția A1 -O
a fost adăugată , sub agitare, la o a doua faz ă apoas ă (A2) care con ține 0,4 g PVA în 40 ml
apă. Următorul pas a fost reprezentat de evaporarea solventului organic , sub agit are, timp
de 3 ore la 1500 rpm. Suspensia rezu ltată a fost înghețată la -45 °C , liofilizat ă în 2 etape și
anume 10 ore la 0,014 mbar , -9 °C, urmat ă de încă 10 ore l a 0,014 mbar și 20 °C (Figura
62). Microparticulele rezultate au fost menținut e la rece, între 4 și 5 °C.

Figura 62
Prezentarea schemati că a sintez ei complexului PLGA -gentamicină , prin metoda emulsiei duble.
Sinteza biocompozitului PLGA -hidroxiapatită -gentamicină
150 mg de gentamicină au fost dizolvate în faza apoasa A1 (400 ul de fosfat
monosodic 0,1 M și fosfat disodic 0,1 M , pH = 6,3 cu 0,5% PVA) și apoi agitat ă puternic
timp de 2 -3 minute la 45.000 rpm cu faza organică O (200 mg PLGA în 5 ml DCM).
Emulsia apă -ulei obținută a fost adăugat ă la faza apoasă secundară A2 (0,4 g de PVA în 40

108
ml apă) , la care s -au adăugat 100 mg hidroxiapati tă. Evapora rea solventul ui organic prin
liofilizare s-a realizat conform condiți lor experimentale descris e mai sus.
Ca metodă de sinteză s -a ales metoda emulsiei duble, aceasta fiind cea mai adecvată
pentru încapsularea medicamentelor hidrosolubile, precum gentamicina. Pentru
determinarea cantitativă a gentamicinei s -a utilizat metod a cromatografică HPLC, care a
presupus inițial derivatizarea gentamicinei cu clorură de 9 -fluorenilmetoxicarbonil
(FMOC -Cl), urmată de detecția UV a derivatului la λ = 265 nm.
4.3.1. 3 Screeningul calitativ al proprietăților antimicrobiene
Pentru testarea calitativă a activității antimicrobiene s -au preparat suspensii
microbiene ajustate conform standardului de turbiditate McFarland 0,5 din culturi
proaspete de 24h, dezvoltate de mediu solid (P.C.A. -Plate count agar). Activitatea
antimicrobiană s -a determinat prin metoda difuzimetrică adaptată ce presupune
însămânțarea în ,,pânză‖ pe pl ăci cu mediu Mueller -Hinton a inoculului bacterian și
plasarea în spot a unei cantități de 10 µL , la distanțe egale, a compușilor care s -au dorit a fi
testați. Soluția stoc pentru testarea calitativă a activității antimicrobiene a fost obținută prin
diluarea a 10 mg compus în 1 mL DMSO, favorizând difuzia și realizând un gradient de
concentrație inve rs proporțional cu diametrul zonei de difuzie. Controlul negativ a fost
reprezentat de spotul de DMSO. Plăcile au fost lăsate timp de 10 minute la temperatura
camerei pentru a asigura difuzia egală a compușilor activi în mediul de cultură și apoi au
fost i ncubate timp de 24h la 37șC. Interpretarea rezultatelor s -a realizat prin aprecierea
apari ției zonelor de inhibiție a creșterii.
4.3.1. 4 Analiza cantitativă a proprietăților antimicrobiene
Analiza cantitativă s -a realizat prin metoda microdiluțiilor serial e binare în mediu
lichid Mueller Hinton , în plăci de microtitra re cu 96 de godeuri , în conformitate cu
standardul de performanță pentru testarea sensibilității antimicrobiene (CLSI, 201 7).
Mediul steril a fost adăugat în plăci sterile în fiecare godeu și d iluțiile binare ale fiecărei
suspensii analizate , s-au realizat într-un volum final de 100 μL. După efectuarea diluțiilor,
în fiecare godeu s-au inoculat 10 μL de suspensie bacteriană ajustată la o densitate optică
McFarland 0,5 în AFS, mai puțin în godeur ile în care s -a testat sterilitatea mediului.
Concentrația minimă inhibitorie s -a stabilit atât macroscopic, ca fiind ultima concentrație
la care nu s -a observat apariția creșterii microbiene, respectiv apariția turbidității mediului,

109
cât și prin determina rea spectrofotometrică a densității optice a culturilor microbiene
măsurată la lungim ea de undă de 6 00 nm , cu ajutorul spectrofotometrului Synergy™ HTX
Multi -Mode Microplate Reader (BioTek ).
4.3.1. 5 Evaluarea cantitativă a influenței suspensiilor testate a supra aderenței
microbiene pe substratul inert
Conținutul plăcilor din plastic cu 96 de godeuri utilizate pentru testul CMI , a fost
îndepărtat, spălat de trei ori cu soluție de tampon fosfat salin pentru îndepartarea
microorganismelor din suspensie . Celule le bacteriene aderente la pereții godeurilor au fost
fixate cu metanol 70%, timp de 5 minute și ulterior s -au colora t plăcile cu cristal violet 1%,
timp de 15 minute (soluția de colorare a fost ȋndepărtată prin spălare sub jet de apă de la
robinet ). Biofil mul a fost ulterior resuspendat cu soluție de acid acetic glacial 33%.
Densitatea optică a suspensiei a fost măsurată la 49 0 nm, valorile obținute fiind
proporționale cu numărul celulelor microbiene aderente.

110
4.3.2 Rezultate și discu ții
Datorit ă biocompatibilității lor ridicate și proprietăților fizice și biologice reglabile,
α-ciclodextrinele și PLGA au fost intens studia te și s-au dovedit a fi candidați excelenți
pentru transportul țintit și eliberarea controlată a unei mari varietăți de medic amente și a
altor categorii de substanțe bioactive (gene, peptide, proteine, antigene, vaccinuri, factori
de creștere, etc.), precum și suporturi pentru regenerarea țesuturilor moi și dure. În ciuda
cercetărilor ample asupra capacit ății de biodegradare, mu lte aspecte importante trebuie
elucidate, pentru a înțelege rolul parametrilor cheie care influențează proprietățile
mecanice, stabilitatea, biodistribuția, biodegradarea, rata de eliberare , toxicitatea și a
selecta cea mai potrivită compoziție și formular e dedicată aplicațiilor clinice pe termen
scurt sau lung.
4.3.2.1. Sinteza complecșilor de incluziune α -ciclodextrină -capsaicină
Capsaicina (8 -metil -N-vanilil -6-nonenamida sau C₁₈H₂₇NO₃) este o biomoleculă cu
proprietăți farmaceutice deosebite, inclusă în clasa terpenoidelor, av ând o mas ă moleculară
de 305,71 g/mol (Figura 6 3). Capsaicina (CAP) acționează asupra receptorilor durerii
declanșând formarea endorfinelor și encefalinelor. Efectul analgezic al capsaicinei a fost
fructificat în industria farmaceuti că prin includerea în concentrații de 0 ,025% -8% în
preparate topice, având ca indicație terapeutică durerea provocată de artrita reumatoidă,
durere neuropatică cauzată de anumite leziuni tisulare, migrene (Stein și colab., 2009,
Anand și Bley, 2011, Henric h și colab., 2015). CAP este un cardioprotector bun, inhibă
oxidarea LDL , contribuind la sc ăderea nivelului de colesterol seric total (Qin și colab.,
2017).
Acest alcaloid se găsește în diferite specii de ardei iute și este insolubil în apă rece,
dar cu o solubilitate extrem de redusă în apă cald a (28.93 mg/L ) (O‘Neill și colab., 2012) .
Solubilizarea și implicit creșterea biodisponibilității capsaicinei s-a obținut prin includerea
acesteia în ciclodextrine.

Figura 63
Structura capsaicinei .

111
În ciuda faptul ui că pentru încapsularea numero șilor agenți terapeutici se utiliz ează
β-CD datorit ă cavității acesteia de dimenisiune mai mare, în acest studiu s -a utilizat α -CD
care prezint ă avantajul costurilor accesibile de achiziție și al masei moleculare relativ mic ă,
care favorizează formarea unui complex de incluziune .
Există numeroase metode de formare a complecșilor de incluziune CD-CAP ,
metode care presupun reacții de neutralizare, coprecipitare, agitare, etc. În momentul
alegerii u nei metode de obținere a aces tor complecși de incluziune , s-a ținut cont de
proprietățile fizico -chimice ale capsaicin ei, cât și de costurile aferente .
Procesul de incluziune implică o substituție a moleculelor de apă din cavitatea cu
caracter hidrofob a CD cu moleculele de compus lip ofil. Prin urmare, în acest proces
aparent simplu, nu se formează și nici nu se rup legături covalente , ci apar alte forțe
precum interacțiuni hidrofobe, uneori se formea ză legături de hidrogen, forțe van der
Waals (Marques, 2010 , Zhu și colab., 2014 ).
Din punct de vedere al stoechiometriei complexului de încorporare, raporul dintre
numărul d intre molecule le de CAP și α-CD este de 1:1 (Figura 6 4). Acest raport a fost
utilizat și în cadrul altor studii , care au realizat complecși de incluziune cu alte tipur i de
CD (hidroxiprop il-beta-ciclodextrin ă) cu capsaicina (Wang și colab., 2007, Zi și colab.,
2008 , Chen și colab., 2010 ). Există și câteva studii în literatura de specialitate în care
raportul CD: moleculă bioactivă a fost de 1:2 sau 2:1, dar aceste rapoa rte sunt extrem de
rare (Modarressi și colab., 2016) .

Figura 6 4
Formarea complexului de incluziune α -ciclodextrină -capsaicină .
Constanta de echilibru între moleculele necomplexate și cele complexate obținută
în cazul complexul ui de incluziune a fost de 86 M-1, rezultatul fiind concordant cu
literatura de specialitate care spune că valoarea K 1:1 este cuprinsă între 50 și 2000 M-1 (Del
Valle, 2004, Brewster și Loftsson, 2007).

112
4.3.2. 2 Screeningul calitativ al proprietăților anti microbiene ale comple cșilor
Rezultatele testului calitativ al e activității antibacteriene a compușilor testați sunt
prezentate în F igura 65. Cele mai sensibile s-au dovedit a fi tulpinile de S. aureus și E. coli ,
iar CAP standard a produs cele mai evidente zone de inhibare a creșterii (Tabelul 27). CAP
și analogii înrudiți (numiți capsaicinoizi) sunt raportate în literatura de specialitate ca
având activitate antimicrobiană împotriva mai multor specii bacteri ene (Zeyrek și Oguz,
2005, Santos și colab., 2012 , Nascimento și colab., 2014 , Marini și colab., 2015 ). Sunt însă
și deriva ți ai CAP care, din păcate, a u efecte prea slabe pentru a fi folosi ți ca noi agenți
antibacterieni ( Cong și Yu, 2011, Ramsaywack și colab., 2018 ). Astfel, propriet ățile
antibacterian e trebuie să fie în continuare îmbunătățite pentru a face ca derivații de
capsaicină să devină potențiali agenți antibacterieni și în special care sa fie eficien ți
împotriva tulpini lor multirezistente.

Figura 65
Aspecte ale testului calitativ c are arată apariția zonei de inhibare a creșterii tulpinilor bacteriene testate.
Metoda difuzimetrică adaptată .

Pseudo monas aeruginosa
ATCC 27853 . Escherichia coli
ATCC 25922 Enterococcus faecalis
ATCC 29212 . Staphylococcus
aureus ATCC 25923

113

Tabel ul 27
Rezultatele determinării calitative a activității antimicrobiene a le compu șilor forma ți din αCD și CAP și ale
controlului negat iv – DMSO.
Compus α-CD-CAP
amestec mecanic α-CD-CAP
complex de sinteză CAP
control DMSO
Tulpină
P. aeruginosa ATCC 27853 – + + –
E. coli ATCC 25922 + + + –
S. aureus ATCC 25923 + + ++ –
Ent. faecalis ATCC 29212 – – – –
Legenda:
(-) – Combinația nu prezintă activitate antimicrobiană; diametrul zonei de inhibiție < 5 mm
(+) – Combinația prezintă activitate antimicrobiană slabă; diametrul zonei de inhibiție aprox. 5 mm
(++) – Combinația prezintă activitate antimicrobiană bună; diametrul zonei de in hibiție 6 -10 mm
4.3.2.3 Analiza cantitativă a proprietăților antimicrobiene ale comple cșilor
Determinarea spectrofotometrică a densității optice a culturilor bacteriene cultivate în
prezența diferi ților compuși , a evidențiat faptul că valorile concentrații lor minime
inhibitorii ale complexelor α -CD-CAP, pentru tulpinile testate au fost cuprinse între 5 și
0,62 mg/mL (Tabel ul 28), cele mai sensibile dovedindu -se a fi tulpinile de E. coli ATCC
25922 și S. aureus ATCC 25923. Nu s -au înregistrat diferențe între cele trei suspensii
testate, cu excepția capsaicinei și a amestecului mecanic α -CD-CAP care au prezentat o
activitate inhibitorie mai bună, comparativ cu complexul α -CD-CAP obținut prin
incluziune, împotriva tulpinii de E. coli . Cre șterea tulpinilor de P. aeruginosa ATCC
27853 și Ent. faecalis ATCC 29212, nu a fost inhibată de suspensile testate.
Tabelul 28
Valori le CMI pentru tulpinil e microbiene testate
Tulpini
microbiene Concentrație minimă inhibitorie (mg/mL)
α-CD-CAP
amestec mecanic α-CD-CAP
comp lex de sinteză Capsaicină
control DMSO
S. aureus
ATCC 25923 1.25 1.25 1.25 2.5
Ent. faecalis
ATCC 29212 5
5 5 5

P. aeruginosa
ATCC 27853 2.5
2.5
2.5
2.5

E. coli
ATCC 25922 0.62 1.25 0.62 5
4.3.2. 4 Evaluarea cantitativă a influenței comple cșilor asupra aderenței microbiene pe
substratul inert
Capacitatea concentrațiilor scăzute de capsaicină de a reduce virulența bacteriană a
fost recent demonstrată in vitro atât față de bacteriile Gram pozitive, cât și față de cele
Gram negative (Xu și co lab., 2005; Chatterjee și colab. , 2010; Kalia și colab., 2012; Qiu și

114
colab.., 2012; Zhou și colab., 2014). În acest studiu, s -au evaluat efectele expunerii a
diferitelor concentra ții de α -CD-CAP asupra proprietăților de virulență, și anume
capacitatea pri ncipalelor tulpini de referință de a forma biofilme. Efectele induse de
complexele α -CD-CAP asupra formării biofilmului sunt similare cu cele ale capsaicinei
standard, dar și cu cele ale anumitor antibiotice, precum aminoglicozide, care la
concentrații sub inhibitorii (mai mici decât valorile CMI ) sunt capabile să inducă aderența
bacteriană la un substrat inert (Kaplan, 2011; Andersson și Hughes, 2014).
Evaluarea capacității de a forma biofilme monospecifice la 24 de ore de la punerea
în contact a suprafețe i inerte tratată cu complexele α -CD-CAP cu suspensiile bacteriane, a
evidențiat o activitate inhibitorie moderat îmbunătățită. Referitor la activitatea inhibitorie a
suspensiilor testate împotriva dezvoltării biofilmului de S. aureus ATCC 25923 , complexul
de incluziune s -a dovedit a fi cel mai eficient, inhibând dezvoltarea biofilmului în
intervalul 5 -1,25 mg/mL (Figura 6 6).

Figura 66.
Reprezentarea grafică a dezvoltării biofilmului de S. aureus ATCC 25923 în prezența suspensii lor testate.
În ceea ce privește activitatea inhibitorie a suspensiilor testate față de dezvoltarea
biofilmului de Ent. faecalis ATCC 29212 , toate cele trei suspensii s -au dovedit a fi fo arte
eficiente, inhibând semnificativ dezvoltarea biofilmelor în in tervalul 5 -1,25 mg/mL (F igura
67). Cu toate acestea, la concentrații mai mici, complexul de incluziune și -a păstrat
capacitatea de a inhiba biofilm ul bacterian, pe întreg intervalul de concentrații testate.

115

Figura 67.
Reprezenta rea grafică a dezvoltării biofilmului de Ent. faecalis ATCC 29212 , în prezența suspensiilor testate.
În urma studiului realizat pe tulpinile de referin ță Gram negative, nu s-a evidențiat
un comportament anti -biofilm semnificativ crescut . Complexul de incl uziune a inhibat
aderența celulelor de E. coli ATCC 25922 , în domeniu l de concentrație de 5-1,25 mg/ml
(Figura 68), după primele 24 de ore de contact . În cazul tulpinii de P. aeruginosa ATCC
27853, nici una dintre suspensiile testate nu a fost eficien tă împotriva dezvo ltării
biofilmului (Figura 69).

Figura 68.
Reprezentarea grafică a dezvoltării biofilmului de E. coli ATCC 25922 în prezența suspensiilor testate.

116

Figura 6 9.
Reprezentarea grafică a d ezvoltării biofilmului de P. aeruginosa ATCC 27853 , în prezența suspensiilor
testate.
4.3.2.5 Sinteza complexului PLGA -gentamicină
În acest studiu pentru sinteza complexului PLGA -CN s-a utilizat metoda emulsiei
apă-ulei-apă, cea mai potrivită metodă pentru încapsularea medicamentelor solubile în apă
(Giri și colab., 2013), spre deosebire de metodele simple de emulsie ulei -apă, care sunt
ideale pentru medicamentele insolubile în apă (Wang și colab., 2017). Eficiența absorbției
gentamicinei de către PLGA este guvernată de interacțiunile medicament -polimer. Sinteza
nanoparticulelor ce au la baz ă PLGA , a făcut obiectul numeroase lor investigații și recenzii
excelente (Hong și colab., 2013, Han și colab., 2016, Brzezinski și colab., 2018, Hill și
colab., 2019).
În prezent sunt necesare noi sisteme de eliberare controlat ă a unor antibiotice
hidrofile, în special pentru tratarea anumitor infecții , cum ar fi cele cu Mycobacterium
tuberculosis sau infecțiile cu alte bacterii intracelulare (Gelperina și colab., 2005). Mulți
agenți terapeutici prezint ă o eficacitate terapeutică mai mare în urma încărc ării în
nanoparticule, bazate pe potențialul lor de orientare precisă și eliberare susținută a
medicamentelor (Sanchez și colab., 2002, Pandey și colab., 2003, Wang și colab ., 2016).
Cu toate acestea, această formulare rămâne greu de obținut pentru antibioticele solubile în
apă, extrem de polare. În timp ce hidrofilicitatea unei substan țe antimicrobiene poate oferi
avantaje, inclusiv o biodisponibilitate și absorbție îmbunătă țită, în același timp poate duce
la o încărcare slabă în nanoparticule, dacă interacțiunile dintre medicament și carrier sunt
slabe (Shen și colab., 2017). Gradul de încapsulare a fost calculat prin extrapolarea masei
de gentamicină recuperată prin HPLC în probă (0,400 mg gentamicină în PLGA -CN și
respectiv 0,058 mg în PLGA -HA-CN), cu masa microparticulei. Astfel, în PLGA -CN,

117
procentul de gentamicină a fost de 2,85% și doar 0,64% gentamicină s -a regasit în
biocompozitul PLGA -HA-CN. Explicația acestui procen t mic de gentamicină încapsulată
în microparticulele PLGA -HA-CN, rezultă din competiția de încapsulare dintre
hidroxiapatit ă și gentamicin ă.
4.3.2 .6 Analiza cantitativă a proprietăților antimicrobiene a le complexului
Gentamicina face parte din clasa amin oglicozidelor și acționează prin inhibarea
traducerii , prin legarea la situsul A de pe subunitatea 30S a ribozomului , ceea ce duce la
încorporarea incorectă a aminoacizi lor și la sinteza unor proteine nefunc ționale,
inducându -se astfel moartea celulei bact eriene (Shi și colab., 2013).
În studiul de față, activitatea antimicrobiană a compușilor obținu ți prin încapsularea
gentamicinei și a hidroxiapatitei în polimerul PLGA a fost testată, in vitro , pe culturi de
tulpini de referință Gram pozitive și Gram nega tive. Concentrațiile minime inhibitorii ale
PLGA -CN, au fost determinat e atât prin m ăsurarea spectrofotometrică a densității optice,
cât și prin evaluarea macroscopic ă a culturilor lichide obtinute . În godeurile care conțin
concentrații mari de compuși, cr eșterea culturii nu a fost vizibilă, celulele microbiene fiind
inhibate de compușii testați. În urma cercetărilor desfășurate în scopul îndeplinirii acestui
obiectiv, s -a constatat că microorganismul cel mai sensibil a fost P. aeruginosa ATCC
27853, caz în care compozitele au prezentat aceelași grad de efic iență ca cel a l
antibioticului liber. În cazul tulpinii de referință de S. aureus ATCC 25923, valorile CMI
ale sistemelor de eliberare ale gentamicinei au avut acelea și valori ale CMI ca cele ob ținute
în cazul test ării tulpinii de P. aeruginosa , cu precizarea că antibioticul în form ă liberă
prezint ă o concentra ție minim ă inhibitorie mult mai mică (Tabelul 29). Acest lucru este
deosebit de important, deoarece includerea gentamicinei în hidroxiapatită contri buie la
reintegrarea osoasă a unui implant , prin îmbunătățirea biocompatibilității materialelor
ortopedice, dar păstr ează și activitatea antimicr obiană . În ceea ce privește tulpinile de Ent.
faecalis ATCC 29212 și E. coli ATCC 25922 , gentamicina neîncapsul ată a prezentat valori
ale CMI net superioare comparativ cu complexele PLGA -CN și PLGA -HA-CN.

118
Tabelul 29
Valori le CMI pentru tulpinil e microbiene testate
Nr.
Crt. Tulpini Concentrație minimă inhibitorie ( µg/mL)
PLGA -HA-CN PLGA -CN CN Standard
1 S. aureus
ATCC 25923 0,0097 0,0097 0,00029
2 Ent. faecalis
ATCC 29212 0,31 0,31 0,0097
3 P. aeruginosa
ATCC 27853 0,0097 0,0097 0,0097
4 E. coli
ATCC 25922 0,039 0,039 0,0005
4.3.2. 7 Evaluarea cantitativă a influenței complexului asupra aderenței microbi ene pe
substratul inert
În ceea ce privește activitatea inhibitorie a suspensiilor testate împotriva dezvoltării
biofilmelor, PLGA -HA-CN și PLGA -CN, s-au dovedit a fi capabile să inhibe aderența
tulpinilor de Ent. faecalis ATCC 29212, după primele 24 de o re de contact (Figura 70).

Figura 70.
Reprezentarea grafică a dezvoltării biofilmului de Ent. faecalis ATCC 29212 , în prezența suspensiilor testate.
Numărul celulelor microbiene care aderă la suprafața unui substrat inert/cel ular și
capacitatea lor de a se multiplica și ulterior de a se desprinde și de a se dispersa sunt
fenomene influențate nu numai de tipul și gradul de exprimare a l moleculelor de aderență
de la suprafața celulelor microbiene ci și de proprietățile fizico -chimice ale materialelor,
proprietăți care pot fi modificate în urma funcționalizării suprafeței acestora. Adăugarea
unui sistem de eliberare controlată a gentamicinei pe suprafața unui substrat inert ar putea
reprezenta o abordare potențial utilă de a reduc e incidența infecțiilor datorate
cateterizărilor, prin proprietățile antibacteriene ale gentamicinei obținându -se inhibarea
colonizării inițiale și formării ulterioare a biofilmului. Cateterizare a tractului urinar poate
duce la apariția și recurența infecț iilor urinare. Biofilmel e dezvoltate la nivelul cateterelor

119
urinare oferă protecție împotriva antibioticelor și asftel pot duce la apariția complicațiilor
severe, cum ar fi pielonefrita acută, bacteriemie, urosepsis și moarte. Într -un model
experimental re alizat de Horsley și colab., s -a demonstrat că în urma implantării unui
cateter urinar, acesta a fost inductorul principal al infecției. În absența unui cateter, Ent.
faecalis induce un proces inflamator minim și poate fi eliminat prin urină. Ent. faecalis are
capacitatea de a produce biofilme evitând reacțiile de aparăre ale sistemului imunitar, iar
prezența cateterului determină persistența în vizica urinară a patogenului (Horsley H. și
colab., 2013). Un aspect important de care depinde rezistența unui ca teter la colonizare,
este calitatea agentului antimicrobian adăugat, de a rămâne legat de cateter și de a nu fi
eluat în timp. În acest sens, tratarea cateterului cu astfel de sisteme pe bază de polimeri
complexate cu cantități minime de antibiotice care p ot eliberara controlat și într -un timp
mai îndelungat antibioticul, poate îmbunătăți procedura de cateterizare a pacienților cu
infecții bacteriene recurente.

Figura 71.
Reprezentarea grafică a dezvoltării biofilmului de S. au reus ATCC 2 5223, în prezența suspensiilor testate.
În cazul celorlalte tulpini de referință și anume S. aureus ATCC 25923, P.
aeruginosa ATCC 27853 și E. coli ATCC 25922, PLGA -HA-CN și PLGA -CN s-au
dovedi t a fi ineficiente față de biofilmele monospecifice (Figurile 71-73).

120

Figura 72.
Reprezentarea grafică a dezvoltării biofilmului de P. aeruginosa ATCC 2 7853, în prezența suspensiilor
testate.

Figura 73.
Reprezentarea grafică a dezvoltării biofilmu lui de E. coli ATCC 2 5922, în prezența suspensiilor testate.
Compozitele obținute au fost mai eficiente față de multiplic area bacteriilor
planctonice, dar mai puțin eficiente împotriva biofilmelor bacteriene.

121
4.3.3 Concluzii
Rezultatele testelor de activitate antimicrobiană au relevat o eficiență similară a
celor două tipuri de sisteme de eliberare controlată a capsaicinei (amestec mecanic și
complex de sinteză α -CD-CAP) împotriva celulelor planctonice, cele mai sensibile fiind
tulpinile de S. aureus și E. coli . Totuși, c apsaicina standard a prezentat capacitate
antimicrobiană superioară complecșilor.
Complexul de incluziune s -a dovedit a fi cel mai eficient împotriva biofilmelor
formate de tulpinile Gram pozitive testate, respectiv S. aureus (CMEB 5-1,25 mg/ml) și
Ent. faecalis (CMEB 5-0,0097 mg/ml), dar și față de biofilmul produs de E. coli (CMEB 5-
1,25 mg/ml). Amestecul mecanic a demonstrat o activitate anti -biofilm superioară
capsaicin ei neîncapsulat e ceea ce sugerează că , complexul de incluziun e al capsaicinei
îmbunătățește semnificativ activitatea anti -biofilm, fiind astfel recomandat pentru
dezvoltarea strategiilor preventive sau terapeutice necesare pentru gestionare a adecvată a
infecțiilor asociate cu formarea biofilmelor.
În urma test ării a ctivit ății antimicrobi ene a le comp lecșilor obținu ți prin
încapsularea gentamicinei și a hidroxiapatitei în polimerul PLGA, s -a constatat că
microorganismele de referință cele mai sensibile au fost tulpinile de P. aeruginosa și S.
aureus . În cazul tulpinilo r de Ent. faecalis și E. coli , gentamicina neîncapsul ată a prezentat
activitate superioar ă comparativ cu complexele PLGA -CN și PLGA -HA-CN.
În ceea ce privește activitatea inhibitorie a suspensiilor testate împotriva dezvoltării
biofilmelor, PLGA -CN și PLGA -HA-CN, s-au dovedit a fi capabile să inhibe doar
aderența tulpinilor de Ent. faecalis ATCC 29212. Așadar, complexele de încapsulare a
gentamicinei în PLGA sunt utile în primul rând în gestionarea infecțiilor cu bacterii
planctonice.
Studii viitoare in vit ro și in vivo sunt necesare pentru investigarea efectelor
particulare ale acestor sisteme de eliberare a agenților antimicrobieni , asupra caracterelor
fenotipice și moleculare ale celulelor bacteriene , precum și a interacțiunilor și a
biodistribuției acest ora. Evaluarea atentă a potențialelor efecte benefice și adverse, precum
și a tehnicilor eficiente și practice de sinteză, ar fi extrem de benefică pentru susținerea
eforturilor mari de a combate fenomenul antibiorezistenței.

122
CONCLUZII GENERALE
Tulpini le de P. aeruginosa și S. aureus sunt două dintre cele mai frecvente cau ze
ale infecțiil or asociate îngrijiri lor medicale , cumulând costuri ridicate pentru gestionarea
acestora . Aceste tulpini prezintă o gamă largă de factori de virulență, dar și de mecanisme
de rezistenț ă la antibiotice , ceea ce conduce la apariția unor rate ridicate de recurenț ă și
cronicizare și la necesitatea acută a descoperirii de noi strategii terapeutice.
În cadrul acestei teze de doctorat au fost caracterizate mecanismele de rezistenț ă și
virulență la tulpini de P. aeruginosa și S. aureus izolate din clinică și a fost evaluată
eficiența unor sisteme de eliberare controlată a unor substanțe antimicrobiene față de celule
bacteriene în fază de creștere planctonică și aderată.
Tulpinile P. aeruginosa incluse în studi u au fost izolate din hemoculturi, exsudat
faringian și uroculturi și au produs în special cazeinază, esculinază și hemolizine, în timp
ce cele de S. aureus izolate din hemoculturi, exsudate, cateter, lichid peritoneal sunt
frecvent producătoare de lipaze și lecitinaze . Majoritatea tulpinil or de P. aeruginosa au
prezentat toate genele de virulență testate , iar cele de S. aureus au avut predominant un
profil de 4 -5 gene de virulență .
Tulpinile de P. aeruginosa izolate din urocu lturi și hemoculturi și cele de S. aureus
izolate din exsudate, sunt caracterizate printr -un nivel de hidrofobicitate de peste 60%,
corelat cu un nivel crescut al gradului de aderență la substrat inert . Un procent ridicat al
tulpinilor analizate a u aderat la substratul celular, cu un pattern de aderență de tip localizat
sau agregativ.
Tulpinile izolate din hemoculturi prezintă un indice scăzut de aderență și invazie a
substratului celular, spre deosebire de cele izolate din uroculturi care manifestă o
capacitate ridicată de colonizare a celulelor e ucariote , respectiv cele din exsudate care au
poten țial invaziv.
Tulpinile de P. aeruginosa incluse în studiu au fost multirezistente, iar testul Hodge
modificat a relevat producerea de metalo -β-lactamaze la tulpi nile izolate din hemoculturi și
uroculturi.
Toate t ulpinile de S. aureus sunt MRSA , 60% dintre tulpini prezintă fenotipul de
rezistență MLSb inductibilă, iar 30% MLSb constitutiv . Cel mai comun genotip a fost

123
blaZ-aacA -aphD -ermC -tetK, iar r ezistența multi plă a fost întâlnită la tulpini izolate din
hemocultură, de la nivelul cateterului și din lichid peritoneal .
Screening genelor de rezistență a demonstrat prezența frecventă a genelor bla VIMlike ,
bla CTX-Mlike, bla IMPlike , urmate de bla GESlike , bla VEBlike și bla SHVlike , a cărăr distribuție a fost
corelată cu sorsa de izolare a tulpinilor analizate. Majoritatea tulpinilor de P. aeruginosa
prezintă genele qnrA și qnrB , responsabile pentru r ezistența la quinolone.
Cele două tipuri de sisteme de eliberare control ată a le capsaicinei pe bază de α –
ciclodextrine au evidențiat o eficiență antimicrobiană similară, inferioară comparativ cu
capsaicina standard , față de tulpinile în fază de creștere planctonică, dar superioară față de
biofilmele microbiene .
Cele două sist eme de încorporare a le gentamicinei în PLGA au avut eficiență
superioară gentamicinei standard față de tulpinile de P. aeruginosa și S. aureus în fază de
creștere planctonică .
În concluzie, complexele de încapsulare ale gentamicinei în PLGA sunt utile pentru
prevenirea și tratamentul infecțiilor cu bacterii planctonice, în timp ce complex ele de
incluziune a le capsaicinei îmbunătăț esc semnificativ activitatea anti -biofilm a acestui
compus natural , fiind recomandat e pentru dezvoltarea unor strategii preventiv e sau
terapeutice de gestionare adecvată a infecțiilor asociate biofilmelor.

124

BIBLIOGRAFIE

1. Abbas, A., Srivastava, P., Nirwan, P. S. (2015). Prevalence of MLSB Resistance and Observation of erm
A &amp; erm C Genes At A Tertiary Care Hospital. Journal of C linical and Diagnostic Research :
JCDR , 9(6), DC08 -10.
2. Adem, P. V., Montgomery, C. P., Husain, A. N., Koogler, T. K., Arangelovich, V., Humilier, M., Boyle –
Vavra, S., & Daum, R. S. (2005). Staphylococcus aureus sepsis and the Waterhouse -Friderichsen
syndr ome in children. The New England journal of medicine, 353(12), 1245 –1251.
https://doi.org/10.1056/NEJMoa044194
3. Aggarwal, S., Jena, S., Panda, S., Sharma, S., Dhawan, B., Nath, G., Singh, N. P., Nayak, K. C., &
Singh, D. V. (2019). Antibiotic Susceptibility , Virulence Pattern, and Typing of Staphylococcus aureus
Strains Isolated From Variety of Infections in India. Frontiers in microbiology, 10, 2763.
https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02763
4. Alizadeh -Osgouei, M., Li, Y., & Wen, C. (2018). A comprehensive rev iew of biodegradable synthetic
polymer -ceramic composites and their manufacture for biomedical applications. Bioactive materials,
4(1), 22 –36. https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2018.11.003
5. Alizon, S., & Méthot, P. O. (2018). Reconciling Pasteur and Darwi n to control infectious diseases. PLoS
biology, 16(1), e2003815. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2003815
6. Alonzo, F., 3rd, & Torres, V. J. (2014). The bicomponent pore -forming leucocidins of Staphylococcus
aureus. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR, 78(2), 199 –230.
https://doi.org/10.1128/MMBR.00055 -13
7. Alva -Murillo, N., López -Meza, J. E., & Ochoa -Zarzosa, A. (2014). Nonprofessional phagocytic cell
receptors involved in Staphyloco ccus aureus internalization. BioMed research international, 2014,
538546. https://doi.org/10.1155/2014/538546
8. Amar, M. J., Kaler, M., Courville, A. B., Shamburek, R., Sampson, M., & Remaley, A. T. (2016).
Randomized double blind clinical trial on the effec t of oral α -cyclodextrin on serum lipids. Lipids in
health and disease, 15(1), 115. https://doi.org/10.1186/s12944 -016-0284 -6
9. Anand, P., & Bley, K. (2011). Topical capsaicin for pain management: therapeutic potential and
mechanisms of action of the new hig h-concentration capsaicin 8% patch. British journal of anaesthesia,
107(4), 490 –502. https://doi.org/10.1093/bja/aer260
10. Anderson M., Clift C., Schulze K., Sagan A., Nahrgang S., Ouakrim D., Mossialos E., 2019, Averting
the AMR crisis: What are the avenues for policy action for countries in Europe? Policy brief 32.
https://www.oecd.org/health/health -systems/Averting -the-AMR -crisis -Policy -Brief -32-March -2019.PDF
11. Andersson, D. I., & Hughes, D. (2014). Microbiological effects of sublethal levels of antibiotics. Nature
reviews. Microbiology, 12(7), 465 –478. https://doi.org/10.1038/nrmicro3270
12. Andrejko, M., & Mizerska -Dudka, M. (2012). Effect of Pseudomonas aeruginosa elastase B on level and
activity of immune proteins/peptides of Galleria mellonella hemolymph. Jo urnal of insect science
(Online), 12, 88. https://doi.org/10.1673/031.012.8801
13. Anes, J., McCusker, M. P., Fanning, S., & Martins, M. (2015). The ins and outs of RND efflux pumps in
Escherichia coli. Fron tiers in microbiology, 6, 587. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00587
14. Antibacterial agents in preclinical development: an open access database. Geneva: World Health
Organization; 2019 (WHO/EMP/IAU/2019.12). Licence: CC BY -NC-SA 3.0 IGO.
15. Aqil F, Munagala R, Jeyabalan J, Vadhanam MV. (2013) Bioavailability of phytochemicals and its
enhancement by drug delivery systems. Cancer Lett. 334(1): 133 –141.
16. Aschbacher, R., Doumith, M., Livermore, D. M., Larcher, C., & Woodford, N. (2008). Linkage of
acquired quinolo ne resistance (qnrS1) and metallo -beta-lactamase (blaVIM -1) genes in multiple species
of Enterobacteriaceae from Bolzano, Italy. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 61(3), 515 –523.
https://doi.org/10.1093/jac/dkm508

125
17. Atridox, 2015., http://www.denmat .com/Atridox.
18. Atshan, S. S., Nor Shamsudin, M., Sekawi, Z., Lung, L. T., Hamat, R. A., Karunanidhi, A., Mateg Ali,
A., Ghaznavi -Rad, E., Ghasemzadeh -Moghaddam, H., Chong Seng, J. S., Nathan, J. J., & Pei, C. P.
(2012). Prevalence of adhesion and regulation of biofilm -related genes in different clones of
Staphylococcus aureus. Journal of biomedicine & biotechnology, 2012, 976972.
https://doi.org/10.1155/2012/976972
19. Beaufort, N., Seweryn, P., de Bentzmann, S., Tang, A., Kellermann, J., Grebenchtchikov, N., Sc hmitt,
M., Sommerhoff, C. P., Pidard, D., & Magdolen, V. (2010). Activation of human pro -urokinase by
unrelated proteases secreted by Pseudomonas aeruginosa. The Biochemical journal, 428(3), 473 –482.
https: //doi.org/10.1042/BJ20091806
20. Beceiro, A., Tomás, M., & Bou, G. (2013). Antimicrobial resistance and virulence: a successful or
deleterious association in the bacterial world?. Clinical microbiology reviews, 26(2), 185 –230.
https://doi.org/10.1128/CMR.0005 9-12
21. Berube, B. J., & Bubeck Wardenburg, J. (2013). Staphylococcus aureus α -toxin: nearly a century of
intrigue. Toxins, 5(6), 1140 –1166. https://doi.org/10.3390/toxins5061140
22. bioMérieux SA (2016). Bacteria and the environment –the spread of antibiotic res istance. bioMérieux: A
global approach to health (https://www.antimicrobialresistance.biomerieux.com/popup/bacteria -and-the-
environment).
23. Biwer, A., Antranikian, G., & Heinzle, E. (2002). Enzymatic production of cyclodextrins. Applied
microbiology and biot echnology, 59(6), 609 –617. https://doi.org/10.1007/s00253 -002-1057 -x
24. Bleves, S., Viarre, V., Salacha, R., Michel, G. P., Filloux, A., & Voulhoux, R. (2010). Protein secretion
systems in Pseudomonas aeruginosa: A wealth of pathogenic weapons. International journal of medical
microbiology : IJMM, 300(8), 534 –543. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2010.08.005
25. Bonelli, P., Tuccillo, F. M., Federico, A., Napolitano, M., Borrelli, A., Melisi, D., Rimoli, M. G., Palaia,
R., Arra, C., & Carinci, F. (2012). Ibuprofen delivered by poly(lactic -co-glycolic acid) (PLGA)
nanoparticles to human gastric cancer cells exerts antiproliferative activity at very low concentrations.
International journal of nanomedicine, 7, 5683 –5691. https://doi.org/10.2147/IJN.S34723
26. Bonnin, R. A., Jousset, A. B., Urvoy, N., Gauthier, L., Tlili, L., Creton, E., Cotellon, G., Arthur, F.,
Dortet, L., & Naas, T. (2017). Detection of GES -5 Carbapenemase in Klebsiella pneumoniae, a
Newcomer in F rance. Antimicrobial agents and chemotherapy, 61(3), e02263 -16.
https://doi.org/10.1128/AAC.02263 -16
27. Booth, M. C., Pence, L. M., Mahasreshti, P., Callegan, M. C., & Gilmore, M. S. (2001). Clonal
associat ions among Staphylococcus aureus isolates from various sites of infection. Infection and
immunity, 69(1), 345 –352. https://doi.org/10.1128/IAI.69.1.345 -352.2001
28. Borgianni, L., Vandenameele, J., Matagne, A., Bini, L., Bonomo, R. A., Frère, J. M., Rossolini, G. M., &
Docquier, J. D. (2010). Mutational analysis of VIM -2 reveals an essential determinant for metallo -beta-
lactamase stability and folding. Antimicrobial agents and chemotherapy, 54(8), 3197 –3204.
https://doi.org/10.1128/AAC.01336 -09
29. Bradshaw, J. L., Caballero, A. R., Bierdeman, M. A., Adams, K. V., Pipkins, H. R., Tang, A.,
O'Callaghan, R. J., & McDaniel, L. S. (2018). Pseudomonas aeruginosa Protease IV Exacerbates
Pneumococcal Pneumonia and Systemic Disease. mSphere, 3(3), e00212 -18.
https://doi.org /10.1128/mSphere.00212 -18
30. Brewster, M. E., & Loftsson, T. (2007). Cyclodextrins as pharmaceutical solubilizers. Advanced drug
delivery reviews, 59(7), 645 –666. https://doi.org/10.1016/j.addr.2007.05.012
31. Brzezinski, M.; Socka, M.; Kost, B. (2018) Microfluid ics for producing polylactide nanoparticles and
microparticles and their drug delivery application. Polym. Int. 68, 6, 997 -1014.
32. Bucior, I., Pielage, J. F., & Engel, J. N. (2012). Pseudomonas aeruginosa pili and flagella mediate
distinct binding and signal ing events at the apical and basolateral surface of airway epithelium. PLoS
pathogens, 8(4), e1002616. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002616
33. Buiuc D., Negut M., (2009). Tratat de microbiol ogie clinica. Editia a III a. Editura Medicala. 388 -390.

126
34. Bukowski, M., Wladyka, B., & Dubin, G. (2010). Exfoliative toxins of Staphylococcus aureus. Toxins,
2(5), 1148 –1165. https://doi.org/10.3390/toxin s2051148
35. Calzoni, E., Cesaretti, A., Polchi, A., Di Michele, A., Tancini, B., & Emiliani, C. (2019). Biocompatible
Polymer Nanoparticles for Drug Delivery Applications in Cancer and Neurodegenerative Disorder
Therapies. Journal of functional biomaterials, 10(1), 4. https://doi.org/10.3390/jfb10010004
36. Carlotti ME, Sapino S, Ugazio E, Caron G. (2010) On the complexation of quercetin with methyl
cyclodextrin: Photostability and antioxidant studies. J Incl Phenom Macrocycl Chem. 70(1):81 –90.
37. Chifiriuc Carmen , M., Mihai Grumezescu, A., Grumezescu, V., Bezirtzoglou, E., Lazar, V., & Bolocan,
A. (2014). Biomedical applications of natural polymers for drug delivery. Current Organic Chemistry,
18(2), 152 -164.
38. Carneiro, S. B., Costa Duarte, F. Í., Heimfarth, L., Siqu eira Quintans, J. S., Quintans -Júnior, L. J., Veiga
Júnior, V., & Neves de Lima, Á. A. (2019). Cyclodextrin⁻Drug Inclusion Complexes: In Vivo and In
Vitro Approaches. International journal of molecular sciences, 20(3), 642.
https://doi.org/10.3390/ijms2003 0642
39. Casalini, T., Rossi, F., Castrovinci, A., & Perale, G. (2019). A Perspective on Polylactic Acid -Based
Polymers Use for Nanoparticles Synthesis and Applications. Frontiers in bioengineering and
biotechnology, 7, 259. https://doi.org/10.3389/fbioe.2019. 00259
40. Cassini A, Högberg LD, Plachouras D, Quattrocchi A, Hoxha A, Simonsen GS, et al. Attributable deaths
and disability -adjusted lifeyears caused by infections with antibiotic -resistant bacteria in the EU and the
European Economic Area in 2015: a populat ion-level modelling analysis. Lancet Infect Dis. 2019
Jan;19(1):56 -66.
41. Castanheira, M., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., & Jones, R. N. (2008). Rapid emergence of blaCTX –
M among Enterobacteriaceae in U.S. Medical Centers: molecular evaluation from the MYSTI C Program
(2007). Microbial drug resistance (Larchmont, N.Y.), 14(3), 211 –216.
https://doi.org/10.1089/mdr.2008.0827
42. Cattoir, V., Poirel, L., Rotimi, V., Soussy, C. J., & Nordmann, P. (2007). Multiplex PCR for detection of
plasmid -mediated quinolone resist ance qnr genes in ESBL -producing enterobacterial isolates. The
Journal of antimicrobial chemotherapy, 60(2), 394 –397. https://doi.org/10.1093/jac/dkm204
43. Chancey, S. T., Zähner, D., & Stephens, D. S. (2012). Acquired inducible antimicrobial resistance in
Gram-pozitive bacteria. Future microbiology, 7(8), 959 –978. https://doi.org/10.2217/fmb.12.63
44. Chatterjee, S., Asakura, M., Chowdhury, N., Neogi, S. B., Sugimoto, N., Haldar, S., Awasthi, S. P.,
Hinenoya, A., Aoki, S., & Yamasaki, S. (2010). Capsaicin, a pote ntial inhibitor of cholera toxin
production in Vibrio cholerae. FEMS microbiology letters, 306(1), 54 –60.
https://doi.org/10.1111/j.1574 -6968.2010.01931.x
45. Chen, Q., Xie, S., Lou, X., Cheng, S., Liu, X., Zheng, W., Zheng, Z., & Wang, H. (2020). Biofilm
form ation and prevalence of adhesion genes among Staphylococcus aureus isolates from different food
sources. MicrobiologyOpen, 9(1), e00946. https://doi.org/10.1002/mbo3.946
46. Chen, X., Sun, X., Ren, K., Zhang, X., Zhang, Z., & Gong, T. (2010). Enhanced aqueous solubility and
bioavailability of capsaicin by the preparation of an inclusion complex. Arzneimittel -Forschung, 60(9),
571–574. https://doi.org/10.1055/s -0031 -1296327
47. Cheng, Z., Thomas, P. W., Ju, L., Bergstrom, A., Mason, K., Clayton, D., Miller, C., Beth el, C. R.,
VanPelt, J., Tierney, D. L., Page, R. C., Bonomo, R. A., Fast, W., & Crowder, M. W. (2018). Evolution
of New Delhi metallo -β-lactamase (NDM) in the clinic: Effects of NDM mutations on stability, zinc
affinity, and mono -zinc activity. The Journal of biological chemistry, 293(32), 12606 –12618.
https://doi.org/10.1074/jbc.RA118.003835
48. Chifiriuc M. C., Dițu L. M., Mihăescu G., (2007). Microbiologie generală. Editura Universității din
București.
49. Chifiriuc M. C., Lazăr V., Mihăescu G., (2011). Microbiologie și virologie medicală . Editura
Universității din București.
50. Chmelnitsky, I., Navon -Venezia, S., Strahilevitz, J., & Carmeli, Y. (2008). Plasmid -mediated qnrB2 and
carbapenemase gene bla(KPC -2) carried on the same plasmid in carbapenem -resistant ciprofloxacin –

127
susceptible Enterobacter cloacae isolates. Antimicrobial agents and chemotherapy, 52(8), 2962 –2965.
https://doi.org/10.1128/AAC.01341 -07
51. Chouhan, S., Sharma, K., & Guleria, S. (2017). Antim icrobial Activity of Some Essential Oils -Present
Status and Future Perspectives. Medicines (Basel, Switzerland), 4(3), 58.
https://doi.org/10.3390/medicines4030058
52. Claro, T., Widaa, A., O'Seaghdha, M., Miajlovic, H., Foster, T. J., O'Brien, F. J., & Kerrig an, S. W.
(2011). Staphylococcus aureus protein A binds to osteoblasts and triggers signals that weaken bone in
osteomyelitis. PloS one, 6(4), e18748. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0018748
53. CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 27th ed. CLSI supplement M100.
Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2017.
54. Cong, W.W., Yu L.M., (2011). Synthesis and bacteriostatic activity and antifouling capability of
benzamide derivatives containing capsaicin, Chem. Res. C hinese U. 27, 803 -807.
55. Correia, S., Poeta, P., Hébraud, M., Capelo, J. L., & Igrejas, G. (2017). Mechanisms of quinolone action
and resistance: where do we stand?. Journal of medical microbiology, 66(5), 551 –559.
https://doi.org/10.1099/jmm.0.000475
56. Costa, S. S., Viveiros, M., Amaral, L., & Couto, I. (2013). Multidrug Efflux Pumps in Staphylococcus
aureus: an Update. The open microbiology journal, 7, 59 –71.
https://doi.org/10.2174/187428580130701005 9
57. Cotar A.I., Chifiriuc M.C., Dinu S., Bucur M., Iordache C., Banu O., Drăcea O., Larion C., Lazăr V.
2010. Screening of Molecular Virulence Markers in Staphylococcus aureus and Pseudomonas
aeruginosa Strains Isolated from Clinical Infections. Int. J. Mol . Sci., 11(12), 5273 -5291
58. Cotar AI, Chifiriuc MC, Banu O, Lazar V. 2013, Molecular characterization of virulence patterns in
Pseudomonas aeruginosa strains isolated from respiratory and wound samples. Biointerface Res Appl
Chem.;2:551 –8.
59. Cotar, A. I., Chif iriuc, M. C., Dinu, S., Bucur, M., Iordache, C., Banu, O., Dracea, O., Larion, C., &
Lazar, V. (2010). Screening of molecular virulence markers in Staphylococcus aureus and Pseudomonas
aeruginosa strains isolated from clinical infections. International jou rnal of molecular sciences, 11(12),
5273 –5291. https://doi.org/10.3390/ijms11125273
60. Cressler, C. E., McLEOD, D. V., Rozins, C., VAN DEN Hoogen, J., & Day, T. (2016). The adaptive
evolution of virulence: a review of theoretical predictions and empirical tes ts. Parasitology, 143(7), 915 –
930. https://doi.org/10.1017/S003118201500092X
61. Crini G. (2014). Review: a history of cyclodextrins. Chemical reviews, 114(21), 10940 –10975.
https://doi.org/10.1021/cr50 0081p
62. Crosby, H. A., Kwiecinski, J., & Horswill, A. R. (2016). Staphylococcus aureus Aggregation and
Coagulation Mechanisms, and Their Function in Host -Pathogen Interactions. Advances in applied
microbiology, 96, 1 –41. https://doi.org/10.1016/bs.aambs.2016 .07.018
63. Crosby, H. A., Schlievert, P. M., Merriman, J. A., King, J. M., Salgado -Pabón, W., & Horswill, A. R.
(2016). The Staphylococcus aureus Global Regulator MgrA Modulates Clumping and Virulence by
Controlling Surface Protein Expression. PLoS pathogens, 12(5), e1005604.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005604
64. Cury, J., Oliveira, P. H., de la Cruz, F., & Rocha, E. (2018). Host Range and Genetic Plasticity Explain
the Coexistence of Integrative and Extrachromosomal Mobile Genetic Elements. Molecular b iology and
evolution, 35(9), 2230 –2239. https://doi.org/10.1093/molbev/msy123
65. Cyclodextrins used as excipients (2017), Committee for Human Medicinal Products (CHMP),
EMA/CHMP/333892/2013
66. Dang, B., Mao, D., & Luo, Y. (2016). Complete Nucleotide Sequence of IncP-1β Plasmid pDTC28
Reveals a Non -Functional Variant of the blaGES -Type Gene. PloS one, 11(5), e0154975.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0154975
67. Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., & Chen, J. (2008). Structure, function, and evolution of bacterial
ATP -binding cassette systems. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR, 72(2), 317 –364.
https://doi.org/10.1128/MMBR.00031 -07

128
68. Davies, J., & Davies, D. (2010). Origins and evolution o f antibiotic resistance. Microbiology and
molecular biology reviews: MMBR, 74(3), 417 –433. https://doi.org/10.1128/MMBR.00016 -10
69. Davies, J., & Davies, D. (2010). Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiology and
molecular biology reviews : M MBR, 74(3), 417 –433. https://doi.org/10.1128/MMBR.00016 -10
70. Del Valle E. M.M. (2004) Cyclodextrins and their uses: a review. Process Biochemistry, 39, 9, 1033 –
1046. https://doi.org/10.1016/S0032 -9592(03)00258 -9
71. Deppermann, C., & Kubes, P. (2018). Start a fi re, kill the bug: The role of platelets in inflammation and
infection. Innate immunity, 24(6), 335 –348. https://doi.org/10.1177/1753425918789255
72. Deshpande, L. M., Flonta, M., Jones, R. N., & Castanheira, M. (2014). Detection of NDM -1-producing
Enterobacter iaceae in Romania: report of the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program. Journal of
medical microbiology, 63(Pt 3), 483 –484. https://doi.org/10.1099/jmm.0.070334 -0
73. Dhara, L., Tripathi, A., & Pal, A. (2013). Molecular characterization and in silico analysis of naturally
occurring TEM beta -lactamase variants among pathogenic Enterobacteriaceae infecting Indian patients.
BioMed research international, 2013, 783540. https://doi.org/10.1155/2013/783540
74. di Cagno M. P. (2016). The Potential of Cyclodextrins as Novel Active Pharmaceutical Ingredients: A
Short Overview. Molecules (Basel, Switzerland), 22(1), 1. https://doi.org/10.3390/molecules22010001
75. Diab, R., Jaafar -Maalej, C., Fessi, H., & Maincent, P. (20 12). Engineered nanoparticulate drug delivery
systems: the next frontier for oral administration?. The AAPS journal, 14(4), 688 –702.
https://doi.org/10.1208/s12248 -012-9377 -y
76. Díaz, A., Katsarava, R., & Puiggalí, J. (2014). Synthesis, properties and applica tions of biodegradable
polymers derived from diols and dicarboxylic acids: from polyesters to poly(ester amide)s. International
journal of molecular sciences, 15(5), 7064 –7123. https://doi.org/10.3390/ijms15057064
77. Dillen, K., Vandervoort, J., Van den Moote r, G., Verheyden, L., & Ludwig, A. (2004). Factorial design,
physicochemical characterisation and activity of ciprofloxacin -PLGA nanoparticles. International journal
of pharmaceutics, 275(1 -2), 171 –187. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2004.01.033
78. Docquie r, J. D., Lamotte -Brasseur, J., Galleni, M., Amicosante, G., Frère, J. M., & Rossolini, G. M.
(2003). On functional and structural heterogeneity of VIM -type metallo -beta-lactamases. The Journal of
antimicrobial chemotherapy, 51(2), 257 –266. https://doi.org/10.1093/jac/dkg067
79. Domingues, S., da Silva, G. J., & Nielsen, K. M. (2012). Integrons: Vehicles and pathways for horizontal
dissemination in bacteria. Mobile genetic elements, 2(5), 211 –223. https://doi.o rg/10.4161/mge.22967
80. Donlan R. M. (2002). Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging infectious diseases, 8(9), 881 –890.
https://doi.org/10.3201/eid0809.020063
81. Dormanesh, B., Siroosbakhat, S., Khod averdi Darian, E., & Afsharkhas, L. (2015). Methicillin -Resistant
Staphylococcus aureus Isolated From Various Types of Hospital Infections in Pediatrics: Panton –
Valentine Leukocidin, Staphylococcal Chromosomal Cassette mec SCCmec Phenotypes and Antibiotic
Resistance Properties. Jundishapur journal of microbiology, 8(11), e11341.
https://doi.org/10.5812/jjm.11341
82. Doron, S., & Gorbach, S. L. (2008). Bacterial Infections: Overview. International Encyclopedia of
Public Health, 273 –282. https://doi.org/10.1016/B 978-012373960 -5.00596 -7
83. Dortet, L., Flonta, M., Boudehen, Y. M., Creton, E., Bernabeu, S., Vogel, A., & Naas, T. (2015).
Dissemination of carbapenemase -producing Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa in
Romania. Antimicrobial agents and chemotherap y, 59(11), 7100 –7103.
https://doi.org/10.1128/AAC.01512 -15
84. Downer, R., Roche, F., Park, P. W., Mecham, R. P., & Foster, T. J. (2002). The elastin -binding protein
of Staphylococcus aureus (EbpS) is expressed at the cell surface as an integral membrane prote in and not
as a cell wall -associated protein. The Journal of biological chemistry, 277(1), 243 –250.
85. Dreier, J., & Ruggerone, P. (2015). Interaction of antibacterial compounds with RND efflux pumps in
Pseudomonas aeruginosa. Frontiers in microbiology, 6, 660. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00660
86. DrugBank, 2015, http://www.drugbank.ca/drugs/DB00254.
87. Dubern, J. F., Cigana, C., De Simone, M., Lazenby, J., Juhas, M., Schwager, S., Bianconi, I., Döring, G.,
Eberl, L., Williams, P., Bragonzi, A., & Cámara, M. (2 015). Integrated whole -genome screening for

129
Pseudomonas aeruginosa virulence genes using multiple disease models reveals that pathogenicity is
host specific. Environmental microbiology, 17(11), 4379 –4393. https://doi.org/10.1111/1462 –
2920.12863
88. Duran, N., Ozer, B., Duran, G. G., Onlen, Y., & Demir, C. (2012). Antibiotic resistance genes &
susceptibility patterns in staphylococci. The Indian journal of medical research, 135(3), 389 –396.
89. Edwards, A. M., Bowden, M. G., Brown, E. L., Laabei, M., & Massey, R. C. (2012). Staphylococcus
aureus extracellular adherence protein triggers TNFα release, promoting attachment to endothelial cells
via protein A. PloS one, 7(8), e43046. https://doi.org/10.1371/journal.p one.0043046
90. EFSA (European Food Safety Authority) and ECDC (European Centre for Disease Prevention and
Control), 2020. The European Union Summary Report on Antimicrobial Resistance in zoonotic and
indicator bacteria from humans, animals and food in 2017/20 18. EFSA Journal 2020;18(3):6007, 166 pp.
https://doi.org/10.2903/j.efsa.2020.6007
91. Egorov, A. M., Ulyashova, M. M., & Rubtsova, M. Y. (2018). Bacterial Enzymes and Antibiotic
Resistance. Acta naturae, 10(4), 33 –48.
92. El Hafi, B., Rasheed, S. S., Abou Fayad, A. G., Araj, G. F., & Matar, G. M. (2019). Evaluating the
Efficacies of Carbapenem/β -Lactamase Inhibitors Against Carbapenem -Resistant Gram -Negative
Bacteria in vitro and in vivo. Frontiers in microbiology, 10, 933.
https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00933
93. Espedido, B. A., Partridge, S. R., & Iredell, J. R. (2008). bla(IMP -4) in different genetic contexts in
Enterobacteriaceae isolates from Australia. Antimicrobial agents and chemotherapy, 52(8), 2984 –2987.
https://doi.org/10.1128/AAC.01634 -07
94. European Cent re for Disease Prevention and Control. Antimicrobial consumption in the EU/EEA, annual
epidemiological report for 2018. Stockholm: ECDC; 2019
95. European Centre for Disease Prevention and Control. ECDC country visit to Romania to discuss
antimicrobial resista nce issues. Stockholm: ECDC; 2018
96. European Centre for Disease Prevention and Control. Surveillance of antimicrobial resistance in Europe
2018. Stockholm: ECDC; 2019.
97. European Centre for Disease Prevention and Control. Surveillance of antimicrobial resista nce in Europe
2016. Annual Report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS -Net).
Stockholm: ECDC; 2017.
98. European Centre for Disease Prevention and Control; 2019. Regional outbreak of New Delhi
metallobeta -lactamase -producing carb apenem -resistant Enterobacteriaceae, Italy, 2018 –2019.
Stockholm: ECDC; 2019.
99. Fair, R. J., & Tor, Y. (2014). Antibiotics and bacterial resistance in the 21st century. Perspectives in
medicinal chemistry, 6, 25 –64. https://doi.org/10.4137/PMC.S14459
100. Farkas, A., Tarco, E., & Butiuc -Keul, A. (2019). Antibiotic resistance profiling of pathogenic
Enterobacteriaceae from Cluj -Napoca, Romania. Germs, 9(1), 17 –27.
https://doi.org/10.18683/germs.2019.1153
101. Fernández, L., & Hancock, R. E. (2012). Adaptive and mutation al resistance: role of porins and efflux
pumps in drug resistance. Clinical microbiology reviews, 25(4), 661 –681.
https://doi.org/10.1128/CMR.00043 -12
102. Fernández -Villa, D., Aguilar, M. R., & Rojo, L. (2019). Folic Acid Antagonists: Antimicrobial and
Immunom odulating Mechanisms and Applications. International journal of molecular sciences, 20(20),
4996. https://doi.org/10.3390/ijms20204996
103. Fishman J. A. (2013). Opportunistic infections –coming to the limits of immunosuppression?. Cold
Spring Harbor perspectiv es in medicine, 3(10), a015669. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a015669
104. Fishovitz, J., Hermoso, J. A., Chang, M., & Mobashery, S. (2014). Penicillin -binding protein 2a of
methicillin -resistant Staphylococcus aureus. IUBMB life, 66(8), 572 –577.
https://doi.org/10.1002/iub.1289
105. Fornaguera, C., & García -Celma, M. J. (2017). Personalized Nanomedicine: A Revolution at the
Nanoscale. Journal of personalized medicine, 7(4), 12. https://doi.org/10.3390 /jpm7040012

130
106. Foster T. J. (2019). The MSCRAMM Family of Cell -Wall -Anchored Surface Proteins of Gram -Positive
Cocci. Trends in microbiology, 27(11), 927 –941. https://doi.org/10.1016/j.tim.2019.06.007
107. Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., & Höök, M. (2014). Adhesion, invasion and evasion: the
many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus. Nature reviews. Microbiology, 12(1),
49–62. https://doi.org/10.1038/nrmicro3161
108. Foulkes , D. M., McLean, K., Haneef, A. S., Fernig, D. G., Winstanley, C., Berry, N., & Kaye, S. B.
(2019). Pseudomonas aeruginosa Toxin ExoU as a Therapeutic Target in the Treatment of Bacterial
Infections. Microorganisms, 7(12), 707. https://doi.org/10.3390/micr oorganisms7120707
109. Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., & Howell, P. L. (2011). Biosynthesis of the Pseudomonas
aeruginosa Extracellular Polysaccharides, Alginate, Pel, and Psl. Frontiers in microbiology, 2, 167.
https://doi.org/10.3389/fmicb.2011.00167
110. Frost, L. S., Leplae, R., Summers, A. O., & Toussaint, A. (2005). Mobile genetic elements: the agents of
open source evolution. Nature Reviews Microbiology, 3(9), 722 -732.
111. Fukutsuji, K., Yamad a, S., & Harada, T. (2013). Ultrastructural cell wall characteristics of clinical
gentamycin -resistant Staphylococcus aureus isolates. Medical molecular morphology, 46(2), 70 –76.
https://doi.org/10.1007/s00795 -013-0009 -0
112. Galán, J. C., González -Candelas, F. , Rolain, J. M., & Cantón, R. (2013). Antibiotics as selectors and
accelerators of diversity in the mechanisms of resistance: from the resistome to genetic plasticity in the
β-lactamases world. Frontiers in microbiology, 4, 9. https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00009
113. Galeska, I., Kim, T. K., Patil, S. D., Bhardwaj, U., Chatttopadhyay, D., Papadimitrakopoulos, F., &
Burgess, D. J. (2005). Controlled release of dexamethasone from PLGA microspheres embed ded within
polyacid -containing PVA hydrogels. The AAPS journal, 7(1), E231 –E240.
https://doi.org/10.1208/aapsj070122
114. Galle, M., Carpentier, I., & Beyaert, R. (2012). Structure and function of the Type III secretion system of
Pseudomonas aeruginosa. Current protein & peptide science, 13(8), 831 –842.
https://doi.org/10.2174/138920312804871210
115. Gaynes, R. (2017). The Discovery of Penicillin —New Insights After More Than 75 Years of Clinical
Use. Emerging Infectious Diseases, 23(5), 849 -853. https://dx.doi.org/10 .3201/eid2305.161556.
116. Gelperina, S., Kisich, K., Iseman, M. D., & Heifets, L. (2005). The potential advantages of nanoparticle
drug delivery systems in chemotherapy of tuberculosis. American journal of respiratory and critical care
medicine, 172(12), 1487 –1490. https://doi.org/10.1164/rccm.200504 -613PP
117. Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., & Hatton, P. V. (2014). An overview of poly(lactic -co-glycolic)
acid (PLGA) -based biomaterials for bone tissue engineering. International journal of molecular sciences ,
15(3), 3640 –3659. https://doi.org/10.3390/ijms15033640
118. Georgescu, M., Gheorghe, I., Curutiu, C., Lazar, V., Bleotu, C., & Chifiriuc, M. C. (2016). Virulence
and resistance features of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from chronic leg ulcers. BMC
infectious diseases, 16 Suppl 1(Suppl 1), 92. https://doi.org/10.1186/s12879 -016-1396 -3
119. Gheorghe, I., Novais, Â., Grosso, F., Rodrigues, C., Chifiriuc, M. C., Lazar, V., & Peixe, L. (2015).
Snapshot on carbapenemase -producing Pseudomonas aeruginosa and Acin etobacter baumannii in
Bucharest hospitals reveals unusual clones and novel genetic surroundings for blaOXA -23. The Journal
of antimicrobial chemotherapy, 70(4), 1016 –1020. https://doi.org/10.1093/jac/dku527
120. Ghitman, J., Biru, E. I., Stan, R., & Iovu, H. ( 2020). Review of hybrid PLGA nanoparticles: Future of
smart drug delivery and theranostics medicine. Materials & Design, 108805.
121. Gidwani, B., & Vyas, A. (2015). A Comprehensive Review on Cyclodextrin -Based Carriers for Delivery
of Chemotherapeutic Cytotoxi c Anticancer Drugs. BioMed research international, 2015, 198268.
https://doi.org/10.1155/2015/198268
122. Gillings M. R. (2014). Integrons: past, present, and future. Microbiology and molecular biology
reviews:MMBR, 78(2), 257 –277. https://doi.org/10.1128/MMBR. 00056 -13
123. Giri, T. K., Choudhary, C., Ajazuddin, Alexander, A., Badwaik, H., & Tripathi, D. K. (2013). Prospects
of pharmaceuticals and biopharmaceuticals loaded microparticles prepared by double emulsion

131
technique for controlled delivery. Saudi pharmaceuti cal journal : SPJ : the official publication of the
Saudi Pharmaceutical Society, 21(2), 125 –141. https://doi.org/10.1016/j.jsps.2012.05.009
124. Golkar, T., Zieliński, M., & Berghuis, A. M. (2018). Look and Outlook on Enzyme -Mediated Macrolide
Resistance. Fron tiers in microbiology, 9, 1942. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.01942
125. Gordon, R. J., & Lowy, F. D. (2008). Pathogenesis of methicillin -resistant Staphylococcus aureus
infection. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Di seases Society of
America, 46 Suppl 5(Suppl 5), S350 –S359. https://doi.org/10.1086/533591
126. Goudarzi, M., Kobayashi, N., Dadashi, M., Pantůček, R., Nasiri, M. J., Fazeli, M., Pouriran, R.,
Goudarzi, H., Miri, M. , Amirpour, A., & Seyedjavadi, S. S. (2020). Prevalence, Genetic Diversity, and
Temporary Shifts of Inducible Clindamycin Resistance Staphylococcus aureus Clones in Tehran, Iran: A
Molecular –Epidemiological Analysis From 2013 to 2018. Frontiers in Microbio logy, 11, 663.
https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00663
127. Greene, N. P., Kaplan, E., Crow, A., & Koronakis, V. (2018). Corrigendum: Antibiotic Resistance
Mediated by the MacB ABC Transporter Family: A Structural and Functional Perspective. Frontiers in
microbiology, 9, 2318. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02318
128. Grumezescu, V., Holban, A. M., Grumezescu, A. M., Socol, G., Ficai, A., Vasile, B. S., … & Mogosanu,
G. D. (2014). Usnic acid -loaded bioco mpatible magnetic PLGA -PVA microsphere thin films fabricated
by MAPLE with increased resistance to staphylococcal colonization. Biofabrication, 6(3), 035002.
129. Gu, B., & Burgess, D. J. (2015). Prediction of dexamethasone release from PLGA microspheres
prepar ed with polymer blends using a design of experiment approach. International journal of
pharmaceutics, 495(1), 393 –403. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2015.08.089
130. Guillon, A., Brea, D., Morello, E., Tang, A., Jouan, Y., Ramphal, R., Korkmaz, B., Perez -Cruz, M.,
Trottein, F., O'Callaghan, R. J., Gosset, P., & Si -Tahar, M. (2017). Pseudomonas aeruginosa
proteolytically alters the interleukin 22 -dependent lung mucosal defense. Virulence, 8(6), 810 –820.
https://doi.org/10.1080/21505594.2016.1253658
131. Han, F.Y.; Thurecht, K.J.; Whittaker, A.K.; Smith, M.T. (2016) Bioerodable PLGA -Based
Microparticles for Producing Sustained -Release Drug Formulations and Strategies for Improving Drug
Loading. Front. Pharmacol., 7, 185.
132. Haque, Abdul et al. ―Rapid screening of pyog enic Staphylococcus aureus for confirmation of genus and
species, methicillin resistance and virulence factors by using two novel multiplex PCR.‖ Pakistan journal
of medical sciences vol. 33,5 (2017): 1095 -1100. doi:10.12669/pjms.335.13487
133. Hart, M. E., Tsa ng, L. H., Deck, J., Daily, S. T., Jones, R. C., Liu, H., Hu, H., Hart, M. J., & Smeltzer,
M. S. (2013). Hyaluronidase expression and biofilm involvement in Staphylococcus aureus UAMS -1
and its sarA, agr and sarA agr regulatory mutants. Microbiology (Readi ng, England), 159(Pt 4), 782 –
791. https://doi.org/10.1099/mic.0.065367 -0
134. Hashemian, S., Farhadi, T., & Ganjparvar, M. (2018). Linezolid: a review of its properties, function, and
use in critical care. Drug design, development and therapy, 12, 1759 –1767.
https://doi.org/10.2147/DDDT.S164515
135. Hassuna, N. A., Mandour, S. A., & Mohamed, E. S. (2020). Virulence Constitution of Multi -Drug –
Resistant Pseudomonas aeruginosa in Upper Egypt. Infection and drug resi stance, 13, 587 –595.
https://doi.org/10.2147/IDR.S233694
136. Helena M., Marques C. 2019. A review on cyclodextrin encapsulation of essential oils and volatiles.
Flavour Fragr. J.:313 –326. doi: 10.1002/ffj.2019.
137. Heller, A. A., & Spence, D. M. (2019). A rapid me thod for post -antibiotic bacterial susceptibility testing.
PloS one, 14(1), e0210534. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210534
138. Henrich, F., Magerl, W., Klein, T., Greffrath, W., & Treede, R. D. (2015). Capsaicin -sensitive C – and A –
fibre nociceptors con trol long -term potentiation -like pain amplification in humans. Brain : a journal of
neurology, 138(Pt 9), 2505 –2520. https://doi.org/10.1093/brain/awv108
139. Hill, M., Cunningham, R. N., Hathout, R. M., Johnston, C., Hardy, J. G., & Migaud, M. E. (2019).
Formu lation of Antimicrobial Tobramycin Loaded PLGA Nanoparticles via Complexation with AOT.
Journal of functional biomaterials, 10(2), 26. https://doi.org/10.3390/jfb10020026

132
140. Hines, D. J., & Kaplan, D. L. (2013). Poly(lactic -co-glycolic) acid -controlled -releas e systems:
experimental and modeling insights. Critical reviews in therapeutic drug carrier systems, 30(3), 257 –
276. https://doi.org/10.1615/critrevtherdrugcarriersyst.2013006475
141. Ho, M. J., Jeong, H. T., Im, S. H., Kim, H. T., Lee, J. E., Park, J. S., Cho, H. R., Kim, D. Y., Choi, Y.
W., Lee, J. W., Choi, Y. S., & Kang, M. J. (2019). Design and In Vivo Pharmacokinetic Evaluation of
Triamcinolone Acetonide Microcrystals -Loaded PLGA Microsphere for Increased Drug Retention in
Knees after Intra -Articular Injec tion. Pharmaceutics, 11(8), 419.
https://doi.org/10.3390/pharmaceutics11080419
142. Hogan, D. A., & Kolter, R. (2002). Pseudomonas -Candida interactions: an ecological role for virulence
factors. Science (New York, N.Y.), 296(5576), 2229 –2232. https://doi.org/10.1126/science.1070784
143. Holban AM, Chifiriuc MC, Cotar AI, Bleotu C, Grumezescu AM, Banu O, et al. 2013, Virulence
markers in Pseudomonas aeruginosa isolates from hospital acquired infections occurred i n patients with
underlying cardiovascular disease. Rom Biotechnol Letters.;18:8843 –54.
144. Hong, D. J., Bae, I. K., Jang, I. -H., Jeong, S. H., Kang, H. -K., & Lee, K. (2015). Epidemiology and
Characteristics of Metallo -β-Lactamase -Producing Pseudomonas aerugino sa. Infection &
Chemotherapy , 47(2), 81.
145. Hong, X.; Wei, L.; Ma, L.; Chen, Y.; Liu, Z.; Yuan, W. (2013) Novel preparation method for sustained –
release PLGA microspheres using water -in-oil-in-hydrophilic -oil-in-water emulsion. Int. J. Nanomed., 8,
2433 –2441.
146. Hooper, D. C., & Jacoby, G. A. (2015). Mechanisms of drug resistance: quinolone resistance. Annals of
the New York Academy of Sciences, 1354(1), 12 –31. https://doi.org/10.1111/nyas.12830
147. Horsley, H., Malone -Lee, J., Holland, D., Tuz, M., Hibbert, A., Kels ey, M., Kupelian, A., & Rohn, J. L.
(2013). Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary
tract infection. PloS one, 8(12), e83637. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083637
148. Hrv, R., Devaki, R., Kandi, V . (2016). Evaluation of Different Phenotypic Techniques for the Detection
of Slime Produced by Bacteria Isolated from Clinical Specimens. ur us , 8(2), e505.
149. https://www.who.int/research -observatory/monitoring/processes/antibacterial_products/en/ .
150. Imbuluzqueta, E., Elizondo, E., Gamazo, C., Moreno -Calvo, E., Veciana, J., Ventosa, N., & Blanco –
Prieto, M. J. (2011). Novel bioactive hydrophobic gentamicin carriers for the treatment of intracellular
bacterial infections. Acta biomaterialia, 7(4), 1599 –1608. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2010.11.031
151. Ionescu, B., Ionescu, D., Gheorghe, I., Curuțiu, C., Banu, O., Bleotu, C., Mihaescu, G., Lazar, V.,
Grigore , R., Bezirtzoglou, E., & Berteșteanu, Șerban. (2015). Virulence patterns of Staphylococcus
aureus hospital strains isolated in Bucharest, Romania. In Romanian Biotechnological Letters 20, 3,
10536 -10546.
152. Israil Anca, Mariana -Carmen Balotescu, Maria Damia n, Cristina Dinu, Nadia Bucurenci (2004)
Comparative Studies of Different Methods for Detection of Toxic and other enzymatic Factors in Vibrio
cholerae strains. Romanian Arch. Microbiol.Immunol.,.T.63,nos.1 -2,63-67.
153. Israil Anca, Mariana -Carmen Balotescu,Na dia Bucurenci, Nadia Năcescu, Claudia Cedru, Cornelia
Popa, C.Ciufecu (2003) Factors associated with virulence and survival in environmental and clinical
isolates of Vibrio cholerae O1 and non O1 in Romania. Romanian Arch. Microbiol. Immunol.,62,3 –
4,155 -177.
154. Jackson, R. W., Vinatzer, B., Arnold, D. L., Dorus, S., & Murillo, J. (2011). The influence of the
accessory genome on bacterial pathogen evolution. Mobile genetic elements, 1(1), 55 –65.
https://doi.o rg/10.4161/mge.1.1.16432
155. Jacoby, G. A., Strahilevitz, J., & Hooper, D. C. (2014). Plasmid -mediated quinolone resistance.
Microbiology spectrum, 2(5), 10.1128/microbiolspec.PLAS -0006 -2013.
https://doi.org/10.1128/microbiolspec.PLAS -0006 -2013
156. Jahangirian, H ., Lemraski, E. G., Webster, T. J., Rafiee -Moghaddam, R., & Abdollahi, Y. (2017). A
review of drug delivery systems based on nanotechnology and green chemistry: green nanomedicine.
International journal of nanomedicine, 12, 2957 –2978. https://doi.org/10.21 47/IJN.S127683

133
157. Jarlier V, Diaz Högberg L, Heuer OE, Campos J, Eckmanns T, Giske CG. et al. Strong correlation
between the rates of intrinsically antibiotic -resistant species and the rates of acquired resistance in
Gramnegative species causing bacteraemia, EU/EEA, 2016. Euro Surveill. 2019 Aug;24(33).
158. Jeevanandam, J., Barhoum, A., Chan, Y. S., Dufresne, A., & Danquah, M. K. (2018). Review on
nanoparticles and nanostructured materials: history, sources, toxicity and regulations. Beilstein journal of
nanotechn ology, 9, 1050 –1074. https://doi.org/10.3762/bjnano.9.98
159. Jhunjhunwala, S., Raimondi, G., Thomson, A. W., & Little, S. R. (2009). Delivery of rapamycin to
dendritic cells using degradable microparticles. Journal of controlled release : official journal of t he
Controlled Release Society, 133(3), 191 –197. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2008.10.011
160. Jiang, H., Fang, D., Hsiao, B., Chu, B., & Chen, W. (2004). Preparation and characterization of
ibuprofen -loaded poly(lactide -co-glycolide)/poly(ethylene glycol) -g-chitosan electrospun membranes.
Journal of biomaterials science. Polymer edition, 15(3), 279 –296.
https://doi.org/10.1163/156856204322977184
161. Jiang, X., Ni, Y., Jiang, Y., Yuan, F., Han, L., Li , M., Liu, H., Yang, L., & Lu, Y. (2005). Outbreak of
infection caused by Enterobacter cloacae producing the novel VEB -3 beta -lactamase in China. Journal of
clinical microbiology, 43(2), 826 –831. https://doi.org/10.1128/JCM.43.2.826 -831.2005
162. Johnson, A. P. , & Woodford, N. (2013). Global spread of antibiotic resistance: the example of New
Delhi metallo -β-lactamase (NDM) -mediated carbapenem resistance. Journal of medical microbiology,
62(Pt 4), 499 –513. https://doi.org/10.1099/jmm.0.052555 -0
163. Johnson, W. M., Tyler, S. D., Ewan, E. P., Ashton, F. E., Pollard, D. R., & Rozee, K. R. (1991).
Detection of genes for enterotoxins, exfoliative toxins, and toxic shock syndrome toxin 1 in
Staphylococcus aureus by the polymerase chain reaction. Journal of clinical microbiology, 29(3), 426 –
430.
164. Josse, J., Laurent, F., & Diot, A. (2017). Staphylococcal Adhesion and Host Cell Invasion: Fibronectin –
Binding and Other Mechanisms. Frontiers in microbiology, 8, 2433.
https://d oi.org/10.3389/fmicb.2017.02433
165. Jovcic, B., Lepsanovic, Z., Suljagic, V., Rackov, G., Begovic, J., Topisirovic, L., & Kojic, M. (2011).
Emergence of NDM -1 metallo -β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Serbia.
Antimicrobial agents and chemotherapy, 55(8), 3929 –3931. https://doi.org/10.1128/AAC.00226 -11
166. Kalia, N. P., Mahajan, P., Mehra, R., Nargotra, A., Sharma, J. P., Koul, S., & Khan, I. A. (2012).
Capsaicin, a novel inhibitor of the NorA efflux pump, reduces the intracellular invasi on of
Staphylococcus aureus. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 67(10), 2401 –2408.
https://doi.org/10.1093/jac/dks232
167. Kamaly, N., Yameen, B., Wu, J., & Farokhzad, O. C. (2016). Degradable Controlled -Release Polymers
and Polymeric Nanoparticles: Mec hanisms of Controlling Drug Release. Chemical reviews, 116(4),
2602 –2663. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.5b00346
168. Kang, H., Mintri, S., Menon, A. V., Lee, H. Y., Choi, H. S., & Kim, J. (2015). Pharmacokinetics,
pharmacodynamics and toxicology of theran ostic nanoparticles. Nanoscale, 7(45), 18848 –18862.
https://doi.org/10.1039/c5nr05264e
169. Kaplan J. B. (2011). Antibiotic -induced biofilm formation. The International journal of artificial organs,
34(9), 737 –751. https://doi.org/10.5301/ijao.5000027
170. Karimi, M ., Ghasemi, A., Sahandi Zangabad, P., Rahighi, R., Moosavi Basri, S. M., Mirshekari, H.,
Amiri, M., Shafaei Pishabad, Z., Aslani, A., Bozorgomid, M., Ghosh, D., Beyzavi, A., Vaseghi, A., Aref,
A. R., Haghani, L., Bahrami, S., & Hamblin, M. R. (2016). Smart micro/nanoparticles in stimulus –
responsive drug/gene delivery systems. Chemical Society reviews, 45(5), 1457 –1501.
https://doi.org/10.1039/c5cs00798d
171. Karolewicz B. (2016). A review of polymers as multifunctional excipients in drug dosage form
technology. Saudi pharmaceutical journal : SPJ : the official publication of the Saudi Pharmaceutical
Society, 24(5), 525 –536. https://doi.org/10.1016/j.jsps.2015.02.025

134
172. Kehrenberg, C., & Schwarz, S. (2006). Distribution of florfenicol resistance genes fexA and cfr am ong
chloramphenicol -resistant Staphylococcus isolates. Antimicrobial agents and chemotherapy, 50(4),
1156 –1163. https://doi.org/10.1128/AAC.50.4.1156 -1163.2006
173. Kessin R., Mekalanos J., Pukatzki S., (2001). The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes
conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. PNAS. 99 (5),
3159 -3164.
174. Khadka, P., Ro, J., Kim, H., Kim, I., Kim, J.T., Kim, H., et al., (2014). Pharmaceutical particle
technologies: an approach to improve drug solubil ity, dissolution and bioavailability. Asian J. Pharm.
Sci. 9, 304 -316.
175. Khan, A. U., Maryam, L., & Zarrilli, R. (2017). Structure, Genetics and Worldwide Spread of New Delhi
Metallo -β-lactamase (NDM): a threat to public health. BMC microbiology, 17(1), 101.
https://doi.org/10.1186/s12866 -017-1012 -8
176. Khoramian, B., Jabalameli, F., Niasari -Naslaji, A., Taherikalani, M., & Emaneini, M. (2015).
Comparison of virulence factors and biofilm formation among Staphylococcus aureus strains isolated
from human and bovine infections. Microbial pathogenesis, 88, 73 –77.
https://doi.org/10.1016/j.micpath.2015.08.007
177. Khoramrooz, S. S., Dolatabad, S. A., Dolatabad, F. M., Marashifard, M., Mirzaii, M., Dabiri, H.,
Haddadi, A., Rabani, S. M., Shirazi, H., & Darban -Sarokhalil, D. (2017). Detection of tetracycline
resistance genes, aminoglycoside modifying enzymes, and coagulase gene typing of clinical isolates of
Staphylococcus aureus in the Southwest of Iran. Iranian journal of basic medical sciences, 20(8), 912 –
919. https://doi.o rg/10.22038/IJBMS.2017.9114
178. Kim, K.S., Duncan, B., Creran, B., Rotello, V.M., (2013). Triggered nanoparticles as therapeutics.
NanoToday 8, 439 -447.
179. Klockgether, J., & Tümmler, B. (2017). Recent advances in understanding Pseudomonas aeruginosa as a
pathoge n. F1000Research, 6, 1261. https://doi.org/10.12688/f1000research.10506.1
180. Ko, Y. P., & Flick, M. J. (2016). Fibrinogen Is at the Interface of Host Defense and Pathogen Virulence
in Staphylococcus aureus Infection. Seminars in thrombosis and hemostasis, 42( 4), 408 –421.
https://doi.org/10.1055/s -0036 -1579635
181. Kobayashi, S. D., & DeLeo, F. R. (2013). Staphylococcus aureus protein A promotes immune
suppression. mBio, 4(5), e00764 -13. https://doi.org/10.1128/mBio.00764 -13
182. Kolar, S. L., Ibarra, J. A., Rivera, F. E ., Mootz, J. M., Davenport, J. E., Stevens, S. M., Horswill, A. R.,
& Shaw, L. N. (2013). Extracellular proteases are key mediators of Staphylococcus aureus virulence via
the global modulation of virulence -determinant stability. MicrobiologyOpen, 2(1), 18 –34.
https://doi.org/10.1002/mbo3.55
183. Krasowska, A., & Sigler, K. (2014). How microorganisms use hydrophobicity and what does this mean
for human needs? Frontiers in Cellular and Infection Microbiology , 4, 112.
184. Kung, V. L., Ozer, E. A., & Hauser, A. R. (2010 ). The accessory genome of Pseudomonas aeruginosa.
Microbiology and molecular biology reviews : MMBR, 74(4), 621 –641.
https://doi.org/10.1128/MMBR.00027 -10
185. Kuroda, T., & Tsuchiya, T. (2009). Multidrug e fflux transporters in the MATE family. Biochimica et
biophysica acta, 1794(5), 763 –768. https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2008.11.012
186. Lakhundi, S., & Zhang, K. (2018). Methicillin -Resistant Staphylococcus aureus: Molecular
Characterization, Evolution, and E pidemiology. Clinical microbiology reviews, 31(4), e00020 -18.
https://doi.org/10.1128/CMR.00020 -18
187. Lazăr V., 2007. Microbiologie medicală. Editura Universității din București.
188. Lecaroz, C., Gamazo, C., Re nedo, M. J., & Blanco -Prieto, M. J. (2006). Biodegradable micro – and
nanoparticles as long -term delivery vehicles for gentamicin. Journal of microencapsulation, 23(7), 782 –
792. https://doi.org/10.1080/02652040600946886
189. Leclercq L. (2016). Interactions betw een cyclodextrins and cellular components: Towards greener
medical applications?. Beilstein journal of organic chemistry, 12, 2644 –2662.
https://doi.org/10.3762/bjoc.12.261

135
190. Leemhuis, H., Kelly, R. M., & Dijkhuizen, L. (2010). Engineering of cyclodextrin gl ucanotransferases
and the impact for biotechnological applications. Applied microbiology and biotechnology, 85(4), 823 –
835. https://doi.org/10.1007/s00253 -009-2221 -3
191. Leid, J. G., Willson, C. J., Shirtliff, M. E., Hassett, D. J., Parsek, M. R., & Jeffers, A . K. (2005). The
exopolysaccharide alginate protects Pseudomonas aeruginosa biofilm bacteria from IFN -gamma –
mediated macrophage killing. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950), 175(11), 7512 –7518.
https://doi.org/10.4049/jimmunol.175.11.7512
192. Lekshmi, M., Ammini, P., Adjei, J., Sanford, L. M., Shrestha, U., Kumar, S., & Varela, M. F. (2018).
Modulation of antimicrobial efflux pumps of the major facilitator superfamily in Staphylococcus aureu s.
AIMS microbiology, 4(1), 1 –18. https://doi.org/10.3934/microbiol.2018.1.1
193. Li, R., Wong, M. H., Zhou, Y., Chan, E. W., & Chen, S. (2015). Complete nucleotide sequence of a
conjugative plasmid carrying bla(PER -1). Antimicrobial agents and chemotherapy, 59 (6), 3582 –3584.
https://doi.org/10.1128/AAC.00518 -15
194. Li, X. Z., & Nikaido, H. (2009). Efflux -mediated drug resistance in bacteria: an update. Drugs, 69(12),
1555 –1623. https://doi.org/10.2165/ 11317030 -000000000 -00000
195. Lian, X., Liu, H., Wang, X., Xu, S., Cui, F., & Bai, X. (2013). Antibacterial and biocompatible
properties of vancomycin -loaded nano -hydroxyapatite/collagen/poly (lactic acid) bone substitute.
Progress in Natural Science: Material s International, 23(6), 549 -556.
196. Liechty, W. B., Kryscio, D. R., Slaughter, B. V., & Peppas, N. A. (2010). Polymers for drug delivery
systems. Annual review of chemical and biomolecular engineering, 1, 149 –173.
https://doi.org/10.1146/annurev -chembioeng -073009 -100847
197. Lin, Y. C., & Peterson, M. L. (2010). New insights into the prevention of staphylococcal infections and
toxic shock syndrome. Expert review of clinical pharmacology, 3(6), 753 –767.
https://doi.o rg/10.1586/ecp.10.121
198. Lister, P. D., Wolter, D. J., & Hanson, N. D. (2009). Antibacterial -resistant Pseudomonas aeruginosa:
clinical impact and complex regulation of chromosomally encoded resistance mechanisms. Clinical
microbiology reviews, 22(4), 582 –610. https://doi.org/10.1128/CMR.00040 -09
199. Liu, B., & Pop, M. (2009). ARDB –Antibiotic Resistance Genes Database. Nucleic acids research,
37(Database issue), D443 –D447. https://doi.org/10.1093/nar/gkn656
200. Liu, B., Ramirez, C. M., Miller, A. M., Repa, J. J., Tu rley, S. D., & Dietschy, J. M. (2010). Cyclodextrin
overcomes the transport defect in nearly every organ of NPC1 mice leading to excretion of sequestered
cholesterol as bile acid. Journal of lipid research, 51(5), 933 –944. https://doi.org/10.1194/jlr.M0002 57
201. Liu, Q., Han, L., Li, B., Sun, J., & Ni, Y. (2012). Virulence characteristic and MLST -agr genetic
background of high -level mupirocin -resistant, MRSA isolates from Shanghai and Wenzhou, China. PloS
one, 7(5), e37005. https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0037005
202. Loca, D., Sokolova, M., Locs, J., Smirnova, A., & Irbe, Z. (2015). Calcium phosphate bone cements for
local vancomycin delivery. Materials science & engineering. C, Materials for biological applications, 49,
106–113. https://doi.org/10.1016/j.msec. 2014.12.075
203. López, C., Ayala, J. A., Bonomo, R. A., González, L. J., & Vila, A. J. (2019). Protein determinants of
dissemination and host specificity of metallo -β-lactamases. Nature communications, 10(1), 3617.
https://doi.org/10.1038/s41467 -019-11615 -w
204. López-López, M., Fernández -Delgado, A., Moyá, M. L., Blanco -Arévalo, D., Carrera, C., de la Haba, R.
R., Ventosa, A., Bernal, E., & López -Cornejo, P. (2019). Optimized Preparation of Levofloxacin Loaded
Polymeric Nanoparticles. Pharmaceutics, 11(2), 57. http s://doi.org/10.3390/pharmaceutics11020057
205. Lu, J. M., Wang, X., Marin -Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., & Chen, C. (2009). Current
advances in research and clinical applications of PLGA -based nanotechnology. Expert review of
molecular diagnostics, 9(4), 325 –341. https://doi.org/10.1586/erm.09.15
206. Luberto, C., Stonehouse, M. J., Collins, E. A., Marchesini, N., El -Bawab, S., Vasil, A. I., Vasil, M. L., &
Hannun, Y. A. (2003). Purification, characterization, and identification of a sphingomyelin synthas e
from Pseudomonas aeruginosa. PlcH is a multifunctional enzyme. The Journal of biological chemistry,
278(35), 32733 –32743. https://doi.org/10.1074/jbc.M300932200

136
207. Lytle, K. A., Harteneck, D. A., Noble, A. M., & Jensen, M. D. (2018). The Soluble Fiber α -Cyclodextrin
Does Not Increase the Fecal Losses of Dietary Fat in Adults -A Double -Blind, Randomized, Placebo –
Controlled, Crossover Trial. The Journal of nutrition, 148(9), 1421 –1425.
https://doi.org/10.1093/jn/nxy135
208. Macha, I. J., Cazalbou, S., Ben -Nissan, B. , Harvey, K. L., & Milthorpe, B. (2015). Marine structure
derived calcium phosphate -polymer biocomposites for local antibiotic delivery. Marine drugs, 13(1),
666–680. https://doi.org/10.3390/md13010666
209. Mahdiyoun, S. M., Kazemian, H., Ahanjan, M., Houri, H. , & Goudarzi, M. (2016). Frequency of
Aminoglycoside -Resistance Genes in Methicillin -Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Isolates
from Hospitalized Patients. Jundishapur journal of microbiology, 9(8), e35052.
https://doi.org/10.5812/jjm.35052
210. Makadia, H . K., & Siegel, S. J. (2011). Poly Lactic -co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable
Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers, 3(3), 1377 –1397. https://doi.org/10.3390/polym3031377
211. Makena, A., Düzgün, A. Ö., Brem, J., McDonough, M. A., Rydzik, A. M., Abbou d, M. I., Saral, A.,
Çiçek, A. Ç., Sandalli, C., & Schofield, C. J. (2015). Comparison of Verona Integron -Borne Metallo -β-
Lactamase (VIM) Variants Reveals Differences in Stability and Inhibition Profiles. Antimicrobial agents
and chemotherapy, 60(3), 1377 –1384. https://doi.org/10.1128/AAC.01768 -15
212. Malathi, S., & Balasubramanian, S. (2011). Synthesis of biodegradable polymeric nanoparticles and their
controlled drug delivery for tuberculosis. Journal of biomedical nanotechnology, 7(1), 150 –151.
https://doi.o rg/10.1166/jbn.2011.1244
213. Manavitehrani, I., Fathi, A., Badr, H., Daly, S., Negahi Shirazi, A., & Dehghani, F. (2016). Biomedical
Applications of Biodegradable Polyesters. Polymers, 8(1), 20. https://doi.org/10.3390/polym8010020
214. Mansour, A. S., Wagih, G. E. , Morgan, S. D., Elhariri, M., El -Shabrawy, M. A., Abuelnaga, A., &
Elgabry, E. A. (2017). Detection of Staphylococcus aureus enterotoxigenic strains in bovine raw milk by
reversed passive latex agglutination and multiplex polymerase chain reaction. Veteri nary world, 10(8),
843–847. https://doi.org/10.14202/vetworld.2017.843 -847
215. Marini, E., Magi, G., Mingoia, M., Pugnaloni, A., & Facinelli, B. (2015). Antimicrobial and Anti –
Virulence Activity of Capsaicin Against Erythromycin -Resistant, Cell -Invasive Group A Streptococci.
Frontiers in microbiology, 6, 1281. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.01281
216. Marques HMC. A review on cyclodextrin encapsulation of essential oils and volatiles. Flavour Fragr J.
2010; 25(5):313 –326.
217. Matros L., Krausz T. L., Pandrea S. L., Ciontea M. I., Chiorean E., Pepelea L. S., Berar A. M., Junie L.
M. (2016). Phenotypic and genotypic study of carbapenem -resistant Pseudomonas aeruginosa strains
isolated from hospitalized patients. Revista Romana de Medicina de Laborator, 24(2), 201 -211.
218. Matz, C., Moreno, A. M., Alhede, M., Manefield, M., Hauser, A. R., Givskov, M., & Kjelleberg, S.
(2008). Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm -associated amoebae. The
ISME journal, 2(8), 843 –852. https://doi.org/10.1038/ismej.2008.47
219. McAdow, M., Missiakas, D. M., & Schneewind, O. (2012). Staphylococcus aureus secretes coagulase
and von Willebrand factor binding protein to modify the coagulation cascade and establish host
infections. Journal of innate immunity, 4(2), 141 –148. https://doi.org/10.1159/000333447
220. McEwan, D. L., Kirienko, N. V., & Ausubel, F. M. (2012). Host translational inhibition by
Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditi s elegans. Cell host
& microbe, 11(4), 364 –374. https://doi.org/10.1016/j.chom.2012.02.007
221. McLean, K., Holmes, E. A., Penewit, K., Lee, D. K., Hardy, S. R., Ren, M., Krist, M. P., Huang, K.,
Waalkes, A., & Salipante, S. J. (2019). Artificial Selection for Pathogenicity Mutations in
Staphylococcus aureus Identifies Novel Factors Relevant to Chronic Infection. Infection and immunity,
87(4), e00884 -18. https://doi.org/10.1128/IAI.00884 -18
222. Melter, O., Aires de Sousa, M., Urbásková, P., Jakubů, V., Zemlicková, H ., & de Lencastre, H. (2003).
Update on the major clonal types of methicillin -resistant Staphylococcus aureus in the Czech Republic.
Journal of clinical microbiology, 41(11), 4998 –5005. https://doi.org/10.1128/jcm.41.11.4998 -5005.2003

137
223. Mereuță, A., Bădescu, A., Dorneanu, O., Iancu, L., & Tuchiluș, C. (2013). Spread of VIM -2 metallo –
beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iași,
Romania, Revista Romana de Medicina de Laborator, 21(4), 423 -430. doi: https://doi.org/10.2478/rrlm –
2013 -0035
224. Mihaescu G., Chifiriuc M. C., Ditu L. M., (2007), Antibiotice si substante chimioterapeutice
antimicrobiene. Editura Academiei Romane, 160 -266.
225. Minami, K., Hirayama, F., & Uekama, K. (1998). Colon -specific drug delivery based on a cyclodextrin
prodrug: release behavior of biphenylylacetic acid from its cyclodextrin conjugates in rat intestinal tracts
after oral administration. Journal of pharmaceutical sciences, 87(6), 715 –720.
https://doi.org/10.1021/js9704339
226. Mittal, R., Sharma, S., Chhibber, S., & Harjai, K. (2008). Iron dictates the virulence of Pseudomonas
aeruginosa in urinary tract infections. Journal of biomedical science, 15(6), 731 –741.
https://doi.org/10.1007/s11373 -008-9274 -7
227. Modarressi A, Magri P, Stachowicz -Kuśnierz A, Korchowiec J, Rogalski M. Formation of β –
cyclodextrin complexes in an anhydrous environment. J Mol Model. 2016; 22(9): 207.
228. Moghaddam, M. N ., Beidokhti, M. H., Jamehdar, S. A., & Ghahraman, M. (2014). Genetic properties of
blaCTX -M and blaPER β -lactamase genes in clinical isolates of Enterobacteriaceae by polymerase chain
reaction. Iranian journal of basic medical sciences, 17(5), 378 –383.
229. Mohammadi, G., Valizadeh, H., Barzegar -Jalali, M., Lotfipour, F., Adibkia, K., Milani, M., … &
Nokhodchi, A. (2010). Development of azithromycin –PLGA nanoparticles: Physicochemical
characterization and antibacterial effect against Salmonella typhi. Colloid s and Surfaces B:
Biointerfaces, 80(1), 34 -39.
230. Moiseev, R. V., Morrison, P., Steele, F., & Khutoryanskiy, V. V. (2019). Penetration Enhancers in
Ocular Drug Delivery. Pharmaceutics, 11(7), 321. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics11070321
231. Moldovan, A., & Fraunholz, M. J. (2019). In or out: Phagosomal escape of Staphylococcus aureus.
Cellular microbiology, 21(3), e12997. https://doi.org/10.1111/cmi.12997
232. Mongodin, E., Bajolet, O., Cutrona, J., Bonnet, N., Dupuit, F., Puchelle, E., & de Bentzmann, S. (2002).
Fibronectin -binding proteins of Staphylococcus aureus are involved in adherence to human airway
epithelium. Infection and immunity, 70(2), 620 –630.
233. Monteiro, AS, Pinto, B., Monteiro, JM, Ferreira, RM, Ribeiro, P., Bando, SY, Marques, SG, Silva, L.,
Neto, W., Ferreira, GF, Bomfim, M., & Abreu, AG (2019). Profil filogenetic și molecular al
Staphylococcus aureus izolat de infecțiile fluxului sanguin din nord -estul Braziliei. Microorganisme, 7
(7), 210. https://doi.org/10.3390/microorganisme7070210
234. Morita, Y., Tomida, J., & Kawamura, Y. (2014). Responses of Pseudomonas aeruginosa to
antimicrobials. Frontiers in microbiology, 4, 422. https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00422
235. Moussatova, A., Kandt, C., O'Mar a, M. L., & Tieleman, D. P. (2008). ATP -binding cassette transporters
in Escherichia coli. Biochimica et biophysica acta, 1778(9), 1757 –1771.
https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2008.06.009
236. Mudshing e, S. R., Deore, A. B., Patil, S., & Bhalgat, C. M. (2011). Nanoparticles: Emerging carriers for
drug delivery. Saudi pharmaceutical journal : SPJ : the official publication of the Saudi Pharmaceutical
Society, 19(3), 129 –141. https://doi.org/10.1016/j.jsp s.2011.04.001
237. Munita, J. M., & Arias, C. A. (2016). Mechanisms of Antibiotic Resistance. Microbiology spectrum,
4(2), 10.1128/microbiolspec.VMBF -0016 -2015. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.VMBF -0016 –
2015
238. Naas, T., Nordmann, P., Vedel, G., & Poyart, C. (2005). Plasmid -mediated carbapenem -hydrolyzing
beta-lactamase KPC in a Klebsiella pneumoniae isolate from France. Antimicrobial agents and
chemotherapy, 49(10), 4423 –4424. https://doi.org/10 .1128/AAC.49.10.4423 -4424.2005
239. Nakakido, M., Aikawa, C., Nakagawa, I., & Tsumoto, K. (2014). The staphylococcal elastin -binding
protein regulates zinc -dependent growth/biofilm formation. Journal of biochemistry, 156(3), 155 –162.
https://doi.org/10.1093/jb /mvu027

138
240. Narayanan, G., Vernekar, V. N., Kuyinu, E. L., & Laurencin, C. T. (2016). Poly (lactic acid) -based
biomaterials for orthopaedic regenerative engineering. Advanced drug delivery reviews, 107, 247 –276.
https://doi.org/10.1016/j.addr.2016.04.015
241. Nasci mento, P. L., Nascimento, T. C., Ramos, N. S., Silva, G. R., Gomes, J. E., Falcão, R. E., Moreira,
K. A., Porto, A. L., & Silva, T. M. (2014). Quantification, antioxidant and antimicrobial activity of
phenolics isolated from different extracts of Capsicum frutescens (Pimenta Malagueta). Molecules
(Basel, Switzerland), 19(4), 5434 –5447. https://doi.org/10.3390/molecules19045434
242. Nehme, D., & Poole, K. (2005). Interaction of the MexA and MexB components of the MexAB -OprM
multidrug efflux system of Pseudomonas aeruginosa: identification of MexA extragenic suppressors of a
T578I mutation in MexB. Antimicrobial agents and chemotherapy, 49(10), 4375 –4378.
https://doi.org/10.1128/AAC.49.10.4375 -4378.200 5
243. Newman, J. W., Floyd, R. V., & Fothergill, J. L. (2017). The contribution of Pseudomonas aeruginosa
virulence factors and host factors in the establishment of urinary tract infections. FEMS microbiology
letters, 364(15), 10.1093/femsle/fnx124. https://d oi.org/10.1093/femsle/fnx124
244. Nordmann, P., Naas, T., & Poirel, L. (2011). Global spread of Carbapenemase -producing
Enterobacteriaceae. Emerging infectious diseases, 17(10), 1791 –1798.
https://doi.org/10.3201/eid1710.110655
245. Norman, A., Hansen, L. H., & Søre nsen, S. J. (2009). Conjugative plasmids: vessels of the communal
gene pool. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences,
364(1527), 2275 –2289. https://doi.o rg/10.1098/rstb.2009.0037
246. Nulens E, Stobberingh EE, van Dessel H, et al. Molecular characterization of Staphylococcus aureus
bloodstream isolates collected in a Dutch University Hospital between 1999 and 2006. J Clin Microbiol.
2008;46(7):2438‐2441. doi:1 0.1128/JCM.00808 -08
247. O'Callaghan, R., Caballero, A., Tang, A., & Bierdeman, M. (2019). Pseudomonas aeruginosa Keratitis:
Protease IV and PASP as Corneal Virulence Mediators. Microorganisms, 7(9), 281.
https://doi.org/10.3390/microorganisms7090281
248. O'Neill, J ., Brock, C., Olesen, A. E., Andresen, T., Nilsson, M., & Dickenson, A. H. (2012). Unravelling
the mystery of capsaicin: a tool to understand and treat pain. Pharmacological reviews, 64(4), 939 –971.
https://doi.org/10.1124/pr.112.006163
249. Onoue, S., Yamada, S., & Chan, H. K. (2014). Nanodrugs: pharmacokinetics and safety. International
journal of nanomedicine, 9, 1025 –1037. https://doi.org/10.2147/IJN.S38378
250. Öztürk, A. A., Yenilmez, E., & Özarda, M. G. (2019). Clarithromycin -Loaded Poly (Lactic -co-glycolic
Acid) (PLGA) Nanoparticles for Oral Administration: Effect of Polymer Molecular Weight and Surface
Modification with Chitosan on Formulation, Nanoparticle Characterization and Antibacterial Effects.
Polymers, 11(10), 1632. https://doi.org/10.3390/polym111016 32
251. Pai, H., Seo, M. R., & Choi, T. Y. (2007). Association of QnrB determinants and production of
extended -spectrum beta -lactamases or plasmid -mediated AmpC beta -lactamases in clinical isolates of
Klebsiella pneumoniae. Antimicrobial agents and chemotherapy , 51(1), 366 –368.
https://doi.org/10.1128/AAC.00841 -06
252. Pandey, R., Zahoor, A., Sharma, S., & Khuller, G. K. (2003). Nanoparticle encapsulated antitubercular
drugs as a potential oral drug delivery system against murine tuberculosis. Tuberculosis (Edinburgh ,
Scotland), 83(6), 373 –378. https://doi.org/10.1016/j.tube.2003.07.001
253. Pang, J., Luan, Y., Li, F., Cai, X., Du, J., & Li, Z. (2011). Ibuprofen -loaded poly(lactic -co-glycolic acid)
films for controlled drug release. International journal of nanomedicine, 6 , 659 –665.
https://doi.org/10.2147/IJN.S17011
254. Papp -Wallace KM, Bonomo RA. 2016. New β -lactamase inhibitors in the clinic. Infect Dis Clin North
Am;30:441 –64.
255. Park, M. H., Kim, S. Y., Roh, E. Y., & Lee, H. S. (2017). Difference of Type 3 secretion system (T 3SS)
effector gene genotypes (exoU and exoS) and its implication to antibiotics resistances in isolates of
Pseudomonas aeruginosa from chronic otitis media. Auris, nasus, larynx, 44(3), 258 –265.
https://doi.org/10.1016/j.anl.2016.07.005

139
256. Parker, D., & Princ e, A. (2012). Immunopathogenesis of Staphylococcus aureus pulmonary infection.
Seminars in immunopathology, 34(2), 281 –297. https://doi.org/10.1007/s00281 -011-0291 -7
257. Parsonnet, J., Goering, R. V., H ansmann, M. A., Jones, M. B., Ohtagaki, K., Davis, C. C., & Totsuka, K.
(2008). Prevalence of toxic shock syndrome toxin 1 (TSST -1)-producing strains of Staphylococcus
aureus and antibody to TSST -1 among healthy Japanese women. Journal of clinical microbio logy, 46(8),
2731 –2738. https://doi.org/10.1128/JCM.00228 -08
258. Partridge, S. R., Kwong, S. M., Firth, N., & Jensen, S. O. (2018). Mobile Genetic Elements Associated
with Antimicrobial Resistance. Clinical microbiology reviews, 31(4), e00088 -17.
https://doi.o rg/10.1128/CMR.00088 -17
259. Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., Campos, E., Rodriguez -Torres, M., Acosta -Torres, L. S., Diaz –
Torres, L. A., Grillo, R., Swamy, M. K., Sharma, S., Habtemariam, S., & Shin, H. S. (2018). Nano based
drug delivery systems: recent developments and future prospects. Journal of nanobiotechnology, 16(1),
71. https://doi.org/10.1186/s12951 -018-0392 -8
260. Peacock, S. J., Moore, C. E., Justice, A., Kantzanou, M., Story, L., Mackie, K., O'Neill, G., & Day, N. P.
(2002). Virulent combinations of adhesin and toxin genes in natural populations of Staphylococcus
aureus. Infection and immunity, 70(9), 4987 –4996. https://doi.org/10.1128/iai.70.9.4987 -4996.2002
261. Persson, L., Johansson, C., & Rydén, C. (2009). Antibodies to Staphylococcus aureus bone s ialoprotein –
binding protein indicate infectious osteomyelitis. Clinical and vaccine immunology: CVI, 16(6), 949 –
952. https://doi.org/10.1128/CVI.00442 -08
262. Peyrusson, F., Varet, H., Nguyen, T.K. R. Legendre, O. Sismeiro, J. -Y. Coppée, C. Wolz, T. Tenson, F.
Van Bambeke (2020). Intracellular Staphylococcus aureus persisters upon antibiotic exposure. Nat
Commun 11, 2200 https://doi.org/10.1038/s41467 -020-15966 -7
263. Pfaller, M. A., & Segreti, J. (2006). Overview of the epidemiological profile and laboratory detecti on of
extended -spectrum beta -lactamases. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious
Diseases Society of America, 42 Suppl 4, S153 –S163. https://doi.org/10.1086/500662
264. Pfaller, M. A., Mendes, R. E., Streit, J. M., Hogan, P. A., & Flamm, R. K. (2017). Five -Year Summary
of In Vitro Activity and Resistance Mechanisms of Linezolid against Clinically Important Gram -Pozitive
Cocci in the United States from the LEADER Surveillance Program (2011 to 2015). Antimicrobial
agents and chemoth erapy, 61(7), e00609 -17. https://doi.org/10.1128/AAC.00609 -17
265. Piddock L. J. (2006). Multidrug -resistance efflux pumps – not just for resistance. Nature reviews.
Microbiology, 4(8), 629 –636. https://doi.org /10.1038/nrmicro1464
266. Pietrocola, G., Nobile, G., Rindi, S., & Speziale, P. (2017). Staphylococcus aureus Manipulates Innate
Immunity through Own and Host -Expressed Proteases. Frontiers in cellular and infection microbiology,
7, 166. https://doi.org/10.338 9/fcimb.2017.00166
267. Pillai, S. K., Sakoulas, G., Wennersten, C., Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C., Jr, Ferraro, M. J., &
Gold, H. S. (2002). Linezolid resistance in Staphylococcus aureus: characterization and stability of
resistant phenotype. The Journa l of infectious diseases, 186(11), 1603 –1607.
https://doi.org/10.1086/345368
268. Poirel, L., Le Thomas, I., Naas, T., Karim, A., & Nordmann, P. (2000). Biochemical sequence analyses
of GES -1, a novel class A extended -spectrum beta -lactamase, and the class 1 in tegron In52 from
Klebsiella pneumoniae. Antimicrobial agents and chemotherapy, 44(3), 622 –632.
https://doi.org/10.1128/aac.44.3.622 -632.2000
269. Poirel, L., Villa, L., Bertini, A., Pitout, J. D., No rdmann, P., & Carattoli, A. (2007). Expanded -spectrum
beta-lactamase and plasmid -mediated quinolone resistance. Emerging infectious diseases, 13(5), 803 –
805. https://doi.org/10.3201/eid1305.061293
270. Poirel, L., Walsh, T. R., Cuvillier, V., & Nordmann, P. (20 11). Multiplex PCR for detection of acquired
carbapenemase genes. Diagnostic microbiology and infectious disease, 70(1), 119 –123.
https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2010.12.002
271. Poirel, L., Weldhagen, G. F., Naas, T., De Champs, C., Dove, M. G., & Nordm ann, P. (2001). GES -2, a
class A beta -lactamase from Pseudomonas aeruginosa with increased hydrolysis of imipenem.

140
Antimicrobial agents and chemotherapy, 45(9), 2598 –2603. https://doi.org/10.11 28/aac.45.9.2598 –
2603.2001
272. Potron, A., Poirel, L., & Nordmann, P. (2015). Emerging broad -spectrum resistance in Pseudomonas
aeruginosa and Acinetobacter baumannii: Mechanisms and epidemiology. International journal of
antimicrobial agents, 45(6), 568 –585. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2015.03.001
273. Pournaras, S., Köck, R., Mossialos, D., Mellmann, A., Sakellaris, V., Stathopoulos, C., Friedrich, A. W.,
& Tsakris, A. (2013). Detection of a phylogenetically distinct IMP -type metallo -β-lactamase, IMP -35, in
a CC235 Pseudomonas aeruginosa from the Dutch -German border region (Euregio). The Journal of
antimicrobial chemotherapy, 68(6), 1271 –1276. https://doi.org/10.1093/jac/dkt004
274. Pournaras, S., Tsakris, A., Maniati, M., Tzouvelekis, L. S., & Maniatis, A. N . (2002). Novel variant
(bla(VIM -4)) of the metallo -beta-lactamase gene bla(VIM -1) in a clinical strain of Pseudomonas
aeruginosa. Antimicrobial agents and chemotherapy, 46(12), 4026 –4028.
https://doi.org/10.1128/aac.46.12.4026 -4028.2002
275. Principato, M., & Qian, B. F. (2014). Staphylococcal enterotoxins in the etiopathogenesis of mucosal
autoimmunity within the gastrointestinal tract. Toxins, 6(5), 1471 –1489.
https://doi.org/10.3390/toxins6051471
276. Qin, Y., Ran, L., Wang, J., Yu, L., Lang, H. D., Wang, X. L., Mi, M. T., & Zhu, J. D. (2017). Capsaicin
Supplementation Improved Risk Factors of Coronary Heart Disease in Individuals with Low HDL -C
Levels. Nutrients, 9(9), 1037. https://doi.org/10.3390/nu9091037
277. Qiu, J., Niu, X., Wang, J., Xing, Y., Leng, B., Dong, J., Li, H., Luo, M., Zhang, Y., Dai, X., Luo, Y., &
Deng, X. (2012). Capsaicin protects mice from community -associated methicillin -resistant
Staphylococcus aureus pneumonia. PloS one, 7(3), e33032.
https ://doi.org/10.1371/journal.pone.0033032
278. Queenan, A. M., & Bush, K. (2007). Carbapenemases: the versatile beta -lactamases. Clinical
microbiology reviews, 20(3), 440 –458. https://doi.org/10.1128/CMR.00001 -07
279. Raffaini, G., & Ganazzoli, F. (2020). Understandin g Surface Interaction and Inclusion Complexes
between Piroxicam and Native or Crosslinked β -Cyclodextrins: The Role of Drug Concentration.
Molecules (Basel, Switzerland), 25(12), E2848. https://doi.org/10.3390/molecules25122848
280. Rahme, L. G., Ausubel, F. M. , Cao, H., Drenkard, E., Goumnerov, B. C., Lau, G. W., Mahajan -Miklos,
S., Plotnikova, J., Tan, M. W., Tsongalis, J., Walendziewicz, C. L., & Tompkins, R. G. (2000). Plants
and animals share functionally common bacterial virulence factors. Proceedings of t he National
Academy of Sciences of the United States of America, 97(16), 8815 –8821.
https://doi.org/10.1073/pnas.97.16.8815
281. Rajput, K. N., Patel, K. C., & Trivedi, U. B. (2016). β -Cyclodextrin Product ion by Cyclodextrin
Glucanotransferase from an Alkaliphile Microbacterium terrae KNR 9 Using Different Starch
Substrates. Biotechnology research international, 2016, 2034359. https://doi.org/10.1155/2016/2034359
282. Ramachandran, A., Shanthi, M., & Sekar, U. ( 2017). Detection of blaCTX -M Extended Spectrum Beta –
lactamase Producing Salmonella enterica Serotype Typhi in a Tertiary Care Centre. Journal of clinical
and diagnostic research: JCDR, 11(9), DC21 –DC24. https://doi.org/10.7860/JCDR/2017/30150.10637
283. Ramsayw ack, Bos S., A., Vogels C.M., C.A. Gray, S.A. Westcott, (2018). Preliminary investigations
into the synthesis and antimicrobial activities of boron -containing capsaicinoids, Can. J. Chem. 96,
1065 -1070.
284. Rangel, S. M., Diaz, M. H., Knoten, C. A., Zhang, A., & Hauser, A. R. (2015). The Role of ExoS in
Dissemination of Pseudomonas aeruginosa during Pneumonia. PLoS pathogens, 11(6), e1004945.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004945
285. Rezvantalab, S., Drude, N. I., Moraveji, M. K., Güvener, N., Koons, E. K., Shi, Y., Lammers, T., &
Kiessling, F. (2018). PLGA -Based Nanoparticles in Cancer Treatment. Frontiers in pharmacology, 9,
1260. https://doi.org/10.3389/fphar.2018.01260
286. Rijnders, M. I., Deurenberg, R. H., Boumans, M. L., Hoogkamp -Korstanje, J. A., Beisser, P. S.,
Antibiotic Resistance Surveillance Group, & Stobberingh, E. E. (2009). Population structure of
Staphylococcus aureus strains isolated from intensive care unit patients in the netherlands over an 11 –

141
year period (1996 to 2006). Journal of clinical mi crobiology, 47(12), 4090 –4095.
https://doi.org/10.1128/JCM.00820 -09
287. Riquelme, S. A., Wong Fok Lung, T., & Prince, A. (2020). Pulmonary Pathogens Adapt to Immune
Signaling Metabolites in the Airway. Frontiers in immunology, 11, 385.
https://doi.org/10.3389/ fimmu.2020.00385
288. Robicsek, A., Jacoby, G. A., & Hooper, D. C. (2006). The worldwide emergence of plasmid -mediated
quinolone resistance. The Lancet. Infectious diseases, 6(10), 629 –640. https://doi.org/10.1016/S1473 –
3099(06)70599 -0
289. Rodulfo, H., Arcia, A., H ernández, A., Michelli, E., Martinez, D., Guzman, M., Sharma, A., & Donato,
M. (2019). Virulence factors and integrons are associated with MDR and XDR phenotypes in
nosocomial strains of Pseudomonas aeruginosa in a Venezuelan university hospital. Revista d o Instituto
de Medicina Tropical de Sao Paulo, 61, e20. https://doi.org/10.1590/S1678 -9946201961020
290. Ruiz -Roldán, L., Bellés, A., Bueno, J., Azcona -Gutiérrez, J. M., Rojo -Bezares, B., Torres, C., Castillo,
F. J., Sáenz, Y., & Seral, C. (2018). Pseudomonas a eruginosa Isolates from Spanish Children:
Occurrence in Faecal Samples, Antimicrobial Resistance, Virulence, and Molecular Typing. BioMed
research international, 2018, 8060178. https://doi.org/10.1155/2018/8060178
291. Safo, M. K., Zhao, Q., Ko, T. P., Musayev, F. N., Robinson, H., Scarsdale, N., Wang, A. H., & Archer,
G. L. (2005). Crystal structures of the BlaI repressor from Staphylococcus aureus and its complex with
DNA: insights into transcriptional regulation of the bla and mec operons. Journal of bacterio logy,
187(5), 1833 –1844. https://doi.org/10.1128/JB.187.5.1833 -1844.2005
292. Sahuquillo -Arce J. M., Hernández -Cabezas A., Yarad -Auad F., Ibáñez -Martínez E., Falomir -Salcedo P.,
Ruiz -Gaitán A. (2015). Carbapenemases: a worldwide threat to antimicrobial therapy. World J.
Pharmacol. 4 75 –95.
293. Salabi, A. E., Toleman, M. A., Weeks, J., Bruderer, T., Frei, R., & Walsh, T. R. (2010). First report of
the metallo -beta-lactamase SPM -1 in Europe. Antimicrobial agents and chemotherapy, 54(1), 582.
https://doi.org/10.1128/AA C.00719 -09
294. Salustio, P. J., Pontes, P., Conduto, C., Sanches, I., Carvalho, C., Arrais, J., & Marques, H. M. (2011).
Advanced technologies for oral controlled release: cyclodextrins for oral controlled release. AAPS
PharmSciTech, 12(4), 1276 –1292. https:// doi.org/10.1208/s12249 -011-9690 -2
295. Samuelsen, O., Toleman, M. A., Sundsfjord, A., Rydberg, J., Leegaard, T. M., Walder, M., Lia, A.,
Ranheim, T. E., Rajendra, Y., Hermansen, N. O., Walsh, T. R., & Giske, C. G. (2010). Molecular
epidemiology of metallo -beta-lactamase -producing Pseudomonas aeruginosa isolates from Norway and
Sweden shows import of international clones and local clonal expansion. Antimicrobial agents and
chemotherapy, 54(1), 346 –352. https://doi.org/10.1128/AAC.00824 -09
296. Sanchez, G., Cuellar, D. , Zulantay, I., Gajardo, M., & González -Martin, G. (2002). Cytotoxicity and
trypanocidal activity of nifurtimox encapsulated in ethylcyanoacrylate nanoparticles. Biological
research, 35(1), 39 –45. https://doi.org/10.4067/s0716 -97602002000100007
297. Santos, C., Ribeiro, A., & Esteso, M. A. (2019). Drug Delivery Systems: Study of Inclusion Complex
Formation between Methylxanthines and Cyclodextrins and Their Thermodynamic and Transport
Properties. Biomolecules, 9(5), 196. https://doi.org/10.3390/biom9050196
298. Santo s, M. M., Vieira -da-Motta, O., Vieira, I. J., Braz -Filho, R., Gonçalves, P. S., Maria, E. J., Terra, W.
S., Rodrigues, R., & Souza, C. L. (2012). Antibacterial activity of Capsicum annuum extract and
synthetic capsaicinoid derivatives against Streptococcus mutans. Journal of natural medicines, 66(2),
354–356. https://doi.org/10.1007/s11418 -011-0579 -x
299. Saokham, P., Muankaew, C., Jansook, P., & Loftsson, T. (2018). Solubility of Cyclodextrins and
Drug/Cyclodextrin Complexes. Molecules (Basel, Switzerland), 23( 5), 1161.
https://doi.org/10.3390/molecules23051161
300. Sareen, S., Mathew, G., & Joseph, L. (2012). Improvement in solubility of poor water -soluble drugs by
solid dispersion. International journal of pharmaceutical investigation, 2(1), 12 –17.
https://doi.org/ 10.4103/2230 -973X.96921

142
301. Saviuc C, Grumezescu AM, Holban A, Chifiriuc C, Mihaescu D, Lazar V.(2011) Hybrid
nanostructurated material for biomedical applications. Biointerface Res App Chem. 2011;1:64 –71.
302. Sawa, T., Shimizu, M., Moriyama, K., & Wiener -Kronish, J. P. (2014). Association between
Pseudomonas aeruginosa type III secretion, antibiotic resistance, and clinical outcome: a review. Critical
care (London, England), 18(6), 668. https://doi.org/10.1186/s13054 -014-0668 -9
303. Schäuble, N., Cavalié, A., Zimmerman n, R., & Jung, M. (2014). Interaction of Pseudomonas aeruginosa
Exotoxin A with the human Sec61 complex suppresses passive calcium efflux from the endoplasmic
reticulum. Channels (Austin, Tex.), 8(1), 76 –83. https://doi.org/10.4161/chan.26526
304. Schaumburg, F., Ngoa, U. A., Kösters, K., Köck, R., Adegnika, A. A., Kremsner, P. G., Lell, B., Peters,
G., Mellmann, A., & Becker, K. (2011). Virulence factors and genotypes of Staphylococcus aureus from
infection and carriage in Gabon. Clinical microbiology and infection: the official publication of the
European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 17(10), 1507 –1513.
https://doi.org/10.1111/j.1469 -0691.2011.03534.x
305. Schmitz, F. J., Krey, A., Sadurs ki, R., Verhoef, J., Milatovic, D., Fluit, A. C., & European SENTRY
Participants (2001). Resistance to tetracycline and distribution of tetracycline resistance genes in
European Staphylococcus aureus isolates. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 47( 2), 239 –240.
https://doi.org/10.1093/jac/47.2.239
306. Sedaghat, H., Esfahani, B. N., Halaji, M., Jazi, A. S., Mobasherizadeh, S., Havaei, S. R., Emaneini, M.,
& Havaei, S. A. (2018). Genetic diversity of Sta phylococcus aureus strains from a teaching hospital in
Isfahan, Iran: The emergence of MRSA ST639 – SCCmec III and ST343 – SCCmec III. Iranian journal of
microbiology, 10(2), 82 –89.
307. Shallcross, L. J., Fragaszy, E., Johnson, A. M., and Hayward, A. C. (2013). The role of the Panton –
Valentine leucocidin toxin in staphylococcal disease: a systematic review and meta -analysis. Lancet
Infect. Dis. 13, 43 –54. doi: 10.1016/S1473 -3099(12)70238 -4
308. Shapira, A., & Benhar, I. (2010). Toxin -based therapeutic approaches. Toxi ns, 2(11), 2519 –2583.
https://doi.org/10.3390/toxins2112519
309. Shariati, A., Azimi, T., Ardebili, A., Chirani, A. S., Bahramian, A., Pormohammad, A., Sadredinamin,
M., Erfanimanesh, S., Bostanghadiri, N., Shams, S., & Hashemi, A. (2017). Insertional inactivat ion of
oprD in carbapenem -resistant Pseudomonas aeruginosa strains isolated from burn patients in Tehran,
Iran. New microbes and new infections, 21, 75 –80. https://doi.org/10.1016/j.nmni.2017.10.013
310. Shaver, C. M., & Hauser, A. R. (2004). Relative contribut ions of Pseudomonas aeruginosa ExoU, ExoS,
and ExoT to virulence in the lung. Infection and immunity, 72(12), 6969 –6977.
https://doi.org/10.1128/IAI.72.12.6969 -6977.2004
311. Shen, S., Wu, Y., Liu, Y., & Wu, D. (2017). High drug -loading nanomedicines: progress, current status,
and prospects. International journal of nanomedicine, 12, 4085 –4109.
https://doi.org/10.2147/IJN.S132780
312. Shi, K., Caldwell, S. J., Fong, D. H., & Berghuis, A. M. (2013). Prospects for circumventing
aminoglycoside kinase mediated antibiotic resistance. Frontiers in cellular and infection microbiology, 3,
22. https://doi.org/10.3389/fcimb.2013.00022
313. Shittu, A. O., Okon, K., Adesida, S., Oyedara, O., Witte, W., Strommenger, B., Layer, F. , & Nübel, U.
(2011). Antibiotic resistance and molecular epidemiology of Staphylococcus aureus in Nigeria. BMC
microbiology, 11, 92. https://doi.org/10.1186/1471 -2180 -11-92
314. Shue, L., Yufeng, Z., & Mony, U. (2012). Biomaterials for periodontal regeneration : a review of
ceramics and polymers. Biomatter, 2(4), 271 –277. https://doi.org/10.4161/biom.22948
315. Simon, N. C., Aktories, K., & Barbieri, J. T. (2014). Novel bacterial ADP -ribosylating toxins: structure
and function. Nature reviews. Microbiology, 12(9), 59 9–611. https://doi.org/10.1038/nrmicro3310
316. Simonsen, G. S., Tapsall, J. W., Allegranzi, B., Talbot, E. A., & Lazzari, S. (2004). The antimicrobial
resistance containment and surveillance approach –a public health tool. Bulletin of the World Health
Organiza tion, 82(12), 928 –934.

143
317. Simpkin, V., Renwick, M., Kelly, R., Mossialos E. (2017). Incentivising innovation in antibiotic drug
discovery and development: progress, challenges and next steps. J Antibiot 70, 1087 –1096
https://doi.org/10.1038/ja.2017.124
318. Singh, A. P., Biswas, A., Shukla, A., & Maiti, P. (2019). Targeted therapy in chronic diseases using
nanomaterial -based drug delivery vehicles. Signal transduction and targeted therapy, 4, 33.
https://doi.org/10.1038/s41392 -019-0068 -3
319. Son, M. S., Matthews, W. J. , Jr, Kang, Y., Nguyen, D. T., & Hoang, T. T. (2007). In vivo evidence of
Pseudomonas aeruginosa nutrient acquisition and pathogenesis in the lungs of cystic fibrosis patients.
Infection and immunity , 75(11), 5313 –5324. https://doi.org/10.1128/IAI.01807 -06
320. Song, L., Hobaugh, M. R., Shustak, C., Cheley, S., Bayley, H., & Gouaux, J. E. (1996). Structure of
staphylococcal alpha -hemolysin, a heptameric transmembrane pore. Science (New York, N.Y.),
274(5294), 1859 –1866. https://doi.org/10.1126/science.274.5294.1 859
321. Song, R., Murphy, M., Li, C., Ting, K., Soo, C., & Zheng, Z. (2018). Current development of
biodegradable polymeric materials for biomedical applications. Drug design, development and therapy,
12, 3117 –3145. https://doi.org/10.2147/DDDT.S165440
322. Spauldi ng, A. R., Salgado -Pabón, W., Kohler, P. L., Horswill, A. R., Leung, D. Y., & Schlievert, P. M.
(2013). Staphylococcal and streptococcal superantigen exotoxins. Clinical microbiology reviews, 26(3),
422–447. https://doi.org/10.1128/CMR.00104 -12
323. Spellberg, B., Guidos, R., Gilbert, D., Bradley, J., Boucher, H. W., Scheld, W. M., Bartlett, J. G.,
Edwards, J., Jr, & Infectious Diseases Society of America (2008). The epidemic of antibiotic -resistant
infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America.
Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America, 46(2),
155–164. https://doi.org/10.1086/524891
324. Stein, C., Clark, J . D., Oh, U., Vasko, M. R., Wilcox, G. L., Overland, A. C., Vanderah, T. W., &
Spencer, R. H. (2009). Peripheral mechanisms of pain and analgesia. Brain research reviews, 60(1), 90 –
113. https://doi.org/10.1016/j.brainresrev.2008.12.017
325. Stella, V. J., & He, Q. (2008). Cyclodextrins. Toxicologic pathology, 36(1), 30 –42.
https://doi.org/10.1177/0192623307310945
326. Stewart, R. M., Wiehlmann, L., Ashelford, K. E., Preston, S. J., Frimmersdorf, E., Campbell, B. J., Neal,
T. J., Hall, N., Tuft, S., Kaye, S. B., & Win stanley, C. (2011). Genetic characterization indicates that a
specific subpopulation of Pseudomonas aeruginosa is associated with keratitis infections. Journal of
clinical microbiology, 49(3), 993 –1003. https://doi.org/10.1128/JCM.02036 -10
327. Stewart, S. A., Domínguez -Robles, J., Donnelly, R. F., & Larrañeta, E. (2018). Implantable Polymeric
Drug Delivery Devices: Classification, Manufacture, Materials, and Clinical Applications. Polymers,
10(12), 1379. https://doi.org/10.3390/polym10121379
328. Stonehouse, M. J., Cota -Gomez, A., Parker, S. K., Martin, W. E., Hankin, J. A., Murphy, R. C., Chen,
W., Lim, K. B., Hackett, M., Vasil, A. I., & Vasil, M. L. (2002). A novel class of microbial
phosphocholine -specific phospholipases C. Molecular microbiology , 46(3), 661 –676.
https://doi.org/10.1046/j.1365 -2958.2002.03194.x
329. Strommenger, B., Kettlitz, C., Werner, G., & Witte, W. (2003). Multiplex PCR assay for simultaneous
detection of nine clinically relevant ant ibiotic resistance genes in Staphylococcus aureus. Journal of
clinical microbiology, 41(9), 4089 –4094. https://doi.org/10.1128/jcm.41.9.4089 -4094.2003
330. Su, S., Kopitzky, R., Tolga, S., & Kabasc i, S. (2019). Polylactide (PLA) and Its Blends with
Poly(butylene succinate) (PBS): A Brief Review. Polymers, 11(7), 1193.
https://doi.org/10.3390/polym11071193
331. Subedi, D., Vijay, A. K., Kohli, G. S., Rice, S. A., & Willcox, M. (2018). Comparative genomics of
clinical strains of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from different geographic sites. Scientific
reports, 8(1), 15668. https://doi.org/10.1038/s41598 -018-34020 -7
332. Sultan, I., Rahman, S., Jan, A. T., Siddiqui, M. T., Mondal, A. H., & Haq, Q. (2018 ). Antibiotics,
Resistome and Resistance Mechanisms: A Bacterial Perspective. Frontiers in microbiology, 9, 2066.
https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02066

144
333. Sun, F., Zhou, D., Wang, Q., Feng, J., Feng, W., Luo, W., Zhang, D., Liu, Y., Qiu, X., Yin, Z., Chen,
W., & Xia, P. (2016). The first report of detecting the blaSIM -2 gene and determining the complete
sequence of the SIM -encoding plasmid. Clinical microbiology and infection: the official publication of
the European Society of Clinical Microbiology and Inf ectious Diseases, 22(4), 347 –351.
https://doi.org/10.1016/j.cmi.2015.12.001
334. Sun, J., Deng, Z., & Yan, A. (2014). Bacterial multidrug efflux pumps: mechanisms, physiology and
pharmacological exploitations. Biochemical and biophysical research communications , 453(2), 254 –267.
https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2014.05.090
335. Szuplewska, M., Ludwiczak, M., Lyzwa, K., Czarnecki, J., & Bartosik, D. (2014). Mobility and
generation of mosaic non -autonomous transposons by Tn3 -derived inverted -repeat miniature elements
(TIMEs). PloS one, 9(8), e105010. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0105010
336. Tada, T., Shrestha, S., Shimada, K., Ohara, H., Sherchand, J. B., Pokhrel, B. M., & Kirikae, T. (2017).
PER-8, a Novel Extended -Spectrum β -Lactamase PER Variant, from an Acinetobac ter baumannii
Clinical Isolate in Nepal. Antimicrobial agents and chemotherapy, 61(3), e02300 -16.
https://doi.org/10.1128/AAC.02300 -16
337. Tam, K., & Torres, V. J. (2019). Staphylococcus aureus Secreted Toxins and Extracellular Enzymes.
Microbiology spectrum, 7(2), 10.1128/microbiolspec.GPP3 -0039 -2018.
https://doi.org/10.1128/microbiolspec.GPP3 -0039 -2018
338. Tew, L. S., She, L. Y., & Chew, C. H. (2016). Isolation, Antimicrobial Susceptibility Profile and
Detection of Sul1, blaTEM, and blaSHV in Amoxicillin -Clavulan ate-Resistant Bacteria Isolated From
Retail Sausages in Kampar, Malaysia. Jundishapur journal of microbiology, 9(10), e37897.
https://doi.org/10.5812/jjm.37897
339. Tielen, P., Narten, M., Rosin, N., Biegler, I., Haddad, I., Hogardt, M., Neubauer, R., Schobert, M.,
Wiehlmann, L., & Jahn, D. (2011). Genotypic and phenotypic characterization of Pseudomonas
aeruginosa isolates from urinary tract infections. International journal of medical microbiology : IJMM,
301(4), 282 –292. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2010.10.005
340. Tiwari, G., Tiwari, R., & Rai, A. K. (2010). Cyclodextrins in delivery systems: Applications. Journal of
pharmacy & bioallied sciences, 2(2), 72 –79. https://doi.org/10.4103/0975 -7406.67003
341. Toleman, M. A., Simm, A. M., Murphy, T. A., Gales, A. C., Biedenbach, D. J., Jones, R. N., & Walsh,
T. R. (2002). Molecular characterization of SPM -1, a novel metallo -beta-lactamase isolated in Latin
America: report from the SENTRY antimicrobial surveillance programme. The Journal of antimicrobial
chemotherapy, 50(5), 673 –679. https://doi.org/10.1093/jac/dkf210
342. Tong, S. Y., Chen, L. F., & Fowler, V. G., Jr (2012). Colonization, pathogenicity, host susceptibility,
and therapeutics for Staphylococcus aureus: wha t is the clinical relevance?. Seminars in
immunopathology, 34(2), 185 –200. https://doi.org/10.1007/s00281 -011-0300 -x
343. Tong, S. Y., Davis, J. S., Eichenberger, E., Holland, T. L., & Fowler, V. G., Jr (2015). Staphylococcus
aureus infections: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management. Clinical
microbiology reviews, 28(3), 603 –661. https://doi.org/10.1128/CMR.00134 -14
344. Truan, D., Vasil, A., Stonehouse, M., Vasil, M. L., & Pohl , E. (2013). High -level over -expression,
purification, and crystallization of a novel phospholipase C/sphingomyelinase from Pseudomonas
aeruginosa. Protein expression and purification, 90(1), 40 –46. https://doi.org/10.1016/j.pep.2012.11.005
345. Tsuji, H., Noda , S., Kimura, T., Sobue, T., & Arakawa, Y. (2017). Configurational Molecular Glue: One
Optically Active Polymer Attracts Two Oppositely Configured Optically Active Polymers. Scientific
reports, 7, 45170. https://doi.org/10.1038/srep45170
346. Tzouvelekis, L. S. , Tzelepi, E., Tassios, P. T., & Legakis, N. J. (2000). CTX -M-type beta -lactamases: an
emerging group of extended -spectrum enzymes. International journal of antimicrobial agents, 14(2),
137–142. https://doi.org/10.1016/s0924 -8579(99)00165 -x
347. Upadhyay, S. K. , & Ali, S. M. (2018). Molecular recognition of flunarizine dihydrochloride and β –
cyclodextrin inclusion complex by NMR and computational approaches. Chemistry Central journal,
12(1), 33. https://doi.org/10.1186/s13065 -018-0395 -4

145
348. Van Boeckel, T. P., Brower , C., Gilbert, M., Grenfell, B. T., Levin, S. A., Robinson, T. P., Teillant, A.,
& Laxminarayan, R. (2015). Global trends in antimicrobial use in food animals. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 112(18), 5649 –5654.
https://doi.org/10.1073/pnas.1503141112
349. Van Boeckel, T. P., Glennon, E. E., Chen, D., Gilbert, M., Robinson, T. P., Grenfell, B. T., Levin, S. A.,
Bonhoeffer, S., & Laxminarayan, R. (2017). Reducing antimicrobial use in food animals. Science (New
York , N.Y.), 357(6358), 1350 –1352. https://doi.org/10.1126/science.aao1495
350. van Hoek, A. H., Mevius, D., Guerra, B., Mullany, P., Roberts, A. P., & Aarts, H. J. (2011). Acquired
antibiotic resistance genes: an overview. Frontiers in microbiology, 2, 203.
https://doi.org/10.3389/fmicb.2011.00203
351. Vanden Bossche, H., Engelen, M., & Rochette, F. (2003). Antifungal agents of use in animal health –
chemical, biochemical and pharmacological aspects. Journal of vet erinary pharmacology and
therapeutics, 26(1), 5 –29. https://doi.org/10.1046/j.1365 -2885.2003.00456.x
352. Vandenesch, F., Lina, G., & Henry, T. (2012). Staphylococcus aureus hemolysins, bi -component
leukocidins, and cytolytic peptides: a redundant arsenal of me mbrane -damaging virulence factors?.
Frontiers in cellular and infection microbiology, 2, 12. https://doi.org/10.3389/fcimb.2012.00012
353. Vasconcelos, A., Vega, E., Pérez, Y., Gómara, M. J., García, M. L., & Haro, I. (2015). Conjugation of
cell-penetrating pep tides with poly(lactic -co-glycolic acid) -polyethylene glycol nanoparticles improves
ocular drug delivery. International journal of nanomedicine, 10, 609 –631.
https://doi.org/10.2147/IJN.S71198
354. Vasile, C., Pamfil, D., Stoleru, E., & Baican, M. (2020). New D evelopments in Medical Applications of
Hybrid Hydrogels Containing Natural Polymers. Molecules (Basel, Switzerland), 25(7), 1539.
https://doi.org/10.3390/molecules25071539
355. Vassu T., Csutak O., Stoica I., Mușat F. 2001. Genetica microorganismelor și inginer ie genetică
microbiană. Editura Petrion. București.
356. Vega, E., Gamisans, F., García, M. L., Chauvet, A., Lacoulonche, F., & Egea, M. A. (2008). PLGA
nanospheres for the ocular delivery of flurbiprofen: drug release and interactions. Journal of
pharmaceutica l sciences, 97(12), 5306 –5317. https://doi.org/10.1002/jps.21383
357. Verdon, J., Girardin, N., Lacombe, C., Berjeaud, J. M., & Héchard, Y. (2009). delta -hemolysin, an
update on a membrane -interacting peptide. Peptides, 30(4), 817 –823.
https://doi.org/10.1016/j.peptides.2008.12.017
358. Verdú -Expósito C, Romanyk J, Cuadros -González J, TesfaMariam A, Copa -Patiño JL, Pérez -Serrano J,
et al. (2020) Study of susceptibility to antibiotics and molecular charact erization of high virulence
Staphylococcus aureus strains isolated from a rural hospital in Ethiopia. PLoS ONE 15(3): e0230031.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0230031
359. Villegas, M. V., Lolan s, K., Correa, A., Kattan, J. N., Lopez, J. A., Quinn, J. P., & Colombian
Nosocomial Resistance Study Group (2007). First identification of Pseudomonas aeruginosa isolates
producing a KPC -type carbapenem -hydrolyzing beta -lactamase. Antimicrobial agents and
chemotherapy, 51(4), 1553 –1555. https://doi.org/10.1128/AAC.01405 -06
360. Voulhoux, R., Ball, G., Ize, B., Vasil, M. L., Lazdunski, A., Wu, L. F., & Filloux, A. (2001).
Involvement of the twin -arginine trans location system in protein secretion via the type II pathway. The
EMBO journal, 20(23), 6735 –6741. https://doi.org/10.1093/emboj/20.23.6735
361. Walther -Rasmussen, J., & Høiby, N. (2004). Cefotaximases (CTX -M-ases), an expanding family of
extended -spectrum beta -lactamases. Canadian journal of microbiology, 50(3), 137 –165.
https://doi.org/10.1139/w03 -111
362. Wang W, Shi A, Agyei D, Wang Q. (2017) Formulation of water -in-oil-in-water (W/O/W) emulsions
containing trans -resveratrol. RSC Adv.; 7: 35917 -35927.
363. Wang, H., Yu, J., Lu, X., & He, X. (2016). Nanoparticle systems reduce systemic toxicity in cancer
treatment. Nanomedicine (London, England), 11(2), 103 –106. https://doi.org/10.2217/nnm.15.166
364. Wang, L., Jiang, X., Xu, W., & Li, C. (2007). Complexation of tanshinone IIA with 2 -hydroxypropyl –
beta-cyclodextrin: effect on aqueous solubility, dissolution rate, and intestinal absorption behavior in

146
rats. International journal of pharmaceutics, 341(1 -2), 58 –67.
https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2007.03.046
365. Wargo, M. J., Ho , T. C., Gross, M. J., Whittaker, L. A., & Hogan, D. A. (2009). GbdR regulates
Pseudomonas aeruginosa plcH and pchP transcription in response to choline catabolites. Infection and
immunity , 77(3), 1103 –1111. https://doi.org/10.1128/IAI.01008 -08
366. Wargo, M. J., Szwergold, B. S., & Hogan, D. A. (2008). Identification of two gene clusters and a
transcriptional regulator required for Pseudomonas aeruginosa glycine betaine catabolism. Journal of
bacteriology, 190(8), 2690 –2699. https://doi.org/10.1128/JB.01393 -07
367. Watford S, Warrington SJ. (2020) Bacterial DNA Mutations.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK459274/
368. Wen, H., Jung, H., & Li, X. (2015). Drug Delivery Approaches in Addressing Clinical Pharmacology –
Related Issues: Opportunities and Challenges. The AAPS journal, 17(6), 1327 –1340.
https://doi.org/10.1208/s12248 -015-9814 -9
369. WHO, 2019 Antibacterial agents in clinical development: an analysis of the antibacterial clinical
development pipeline. Geneva: World Health Organization; 2019. Licence: CC BY -NC-SA 3.0 IGO.
370. Wijesekara, P., Kumbukgolla, W. W., Jayaweera, J., & Rawat, D. (2017). Review on Usage of
Vancomycin in Livestock and Humans: Maintaining Its Efficacy, Prevention of Resistance and
Alternative The rapy. Veterinary sciences, 4(1), 6. https://doi.org/10.3390/vetsci4010006
371. Wilke, M. S., Hills, T. L., Zhang, H. Z., Chambers, H. F., & Strynadka, N. C. (2004). Crystal structures
of the Apo and penicillin -acylated forms of the BlaR1 beta -lactam sensor of S taphylococcus aureus. The
Journal of biological chemistry, 279(45), 47278 –47287. https://doi.org/10.1074/jbc.M407054200
372. Wilkens S. (2015). Structure and mechanism of ABC transporters. F1000prime report s, 7, 14.
https://doi.org/10.12703/P7 -14
373. World Health Organization. Prioritization of pathogens to guide discovery, research and development of
new antibiotics for drug -resistant bacterial infections, including tuberculosis. Geneva: World Health
Organizati on; 2017 (WHO/EMP/IAU/2017.12).
374. Xu, Q., Barrios, C. A., Cutright, T., & Zhang Newby, B. M. (2005). Evaluation of toxicity of capsaicin
and zosteric acid and their potential application as antifoulants. Environmental toxicology, 20(5), 467 –
474. https://doi. org/10.1002/tox.20134
375. Xu, Q., Crossley, A., & Czernuszka, J. (2009). Preparation and characterization of negatively charged
poly(lactic -co-glycolic acid) microspheres. Journal of pharmaceutical sciences, 98(7), 2377 –2389.
https://doi.org/10.1002/jps.21612
376. Yang, C., Plackett, D., Needham, D., & Burt, H. M. (2009). PLGA and PHBV microsphere formulations
and solid -state characterization: possible implications for local delivery of fusidic acid for the treatment
and prevention of orthopaedic infections. Pharmac eutical research, 26(7), 1644 –1656.
https://doi.org/10.1007/s11095 -009-9875 -5
377. Yang, H. F., Cheng, J., Hu, L. F., Ye, Y., & Li, J. B. (2012). Plasmid -mediated quinolone resistance in
extended -spectrum -β-lactamase – and AmpC β -lactamase -producing Serratia mar cescens in China.
Antimicrobial agents and chemotherapy, 56(8), 4529 –4531. https://doi.org/10.1128/AAC.00493 -12
378. Zautner, A. E., Krause, M., Stropahl, G., Holtfreter, S., Frickmann, H., Maletzki, C., Kreikemeyer, B.,
Pau, H. W., & Podbielski, A. (2010). Int racellular persisting Staphylococcus aureus is the major
pathogen in recurrent tonsillitis. PloS one, 5(3), e9452. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0009452
379. Zehavi -Willner T.,1988. Induction of murine cytolytic T Lymphocytes by Pseudomonas aeruginosa
Exotoxin A. Infect. Immun. 56 (1), 213 -218.
380. Zeyrek F.Y., Oguz E., (2005). In vitro activity of capsaicin against Helicobacter pylori, Ann. Microbiol.
55 125 -127.
381. Zhang, X., Gu, P., & Liu, Y. (2019). Decontamination of radioactive wastewater: State of the art and
challenges forward. Chemosphere, 215, 543 –553. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2018.10.029
382. Zhang, X., Wu, M., Zhuo, W., Gu, J., Zhang, S., Ge, J., & Yang, M. (2015). Crystal struc tures of Bbp
from Staphylococcus aureus reveal the ligand binding mechanism with Fibrinogen α. Protein & cell,
6(10), 757 –766. https://doi.org/10.1007/s13238 -015-0205 -x

147
383. Zhang, X., Xing, H., Zhao, Y., & Ma, Z. (2018). Pharmaceutical Dispersion Techniques fo r Dissolution
and Bioavailability Enhancement of Poorly Water -Soluble Drugs. Pharmaceutics, 10(3), 74.
https://doi.org/10.3390/pharmaceutics10030074
384. Zhao, F., Yao, D., Guo, R., Deng, L., Dong, A., & Zhang, J. (2015). Composites of Polymer Hydrogels
and Nan oparticulate Systems for Biomedical and Pharmaceutical Applications. Nanomaterials (Basel,
Switzerland), 5(4), 2054 –2130. https://doi.org/10.3390/nano5042054
385. Zhou, Y. F., Li, L., Tao, M. T., Sun, J., Liao, X. P., Liu, Y. H., & Xiong, Y. Q. (2020). Linezoli d and
Rifampicin Combination to Combat cfr -Pozitive Multidrug -Resistant MRSA in Murine Models of
Bacteremia and Skin and Skin Structure Infection. Frontiers in microbiology, 10, 3080.
https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.03080
386. Zhou, Y. F., Xiong, Y. Q., Tao, M. T., Li, L., Bu, M. X., Sun, J., Liao, X. P., & Liu, Y. H. (2018).
Increased activity of linezolid in combination with rifampicin in a murine pneumonia model due to
MRSA. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 73(7), 1899 –1907.
https://doi.org/10.10 93/jac/dky129
387. Zhou, Y., Guan, X., Zhu, W., Liu, Z., Wang, X., Yu, H., & Wang, H. (2014). Capsaicin inhibits
Porphyromonas gingivalis growth, biofilm formation, gingivomucosal inflammatory cytokine secretion,
and in vitro osteoclastogenesis. European journa l of clinical microbiology & infectious diseases : official
publication of the European Society of Clinical Microbiology, 33(2), 211 –219.
https://doi.org/10.1007/s10096 -013-1947 -0
388. Zhu Y, Peng W, Zhang JJ. Enhanced oral bioavailability of capsaicin in mixed polymeric micelles:
Preparation, in vitro and in vivo evaluation. J Funct Foods.2014; 8: 358 –666.
389. Zi, P., Yang, X., Kuang, H., Yang, Y., & Yu, L. (2008). Effect of HPbetaCD on solubility and
transdermal delivery of capsaicin through rat skin. Internationa l journal of pharmaceutics, 358(1 -2),
151–158. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2008.03.001
390. Zodrow, K. R., Schiffman, J. D., & Elimelech, M. (2012). Biodegradable polymer (PLGA) coatings
featuring cinnamaldehyde and carvacrol mitigate biofilm formation. L angmuir : the ACS journal of
surfaces and colloids, 28(39), 13993 –13999. https://doi.org/10.1021/la303286v

148
LISTA DE PUBLICAȚII

ARTICOLE DIN CONȚINUTUL TEZEI DE DOCTORAT
Reviste cotate ISI
1. Ciulu -Costinescu F., Podgoreanu P ., Delcaru C. , Simionescu A., Georgescu E. F.,
Bostan M., Chifiriuc M. C., 2019. Antimicrobial assay of a capsaicin -α-cyclodextrin
inclusion complex against planktonic and adherent cells. FARMACIA , 67, 3 , 496 -503.
https://doi.org/10.31925/farmacia.2019.3.18 Autor cores pondent . IF 1. 607
2. Ciocîlteu M.V., Podgoreanu P ., Delcaru C., Chifiriuc M.C., Manda C. V., Biță A.,
Popescu M., Amzoiu E., Croitoru O., Bleotu C., Bostan M., Neamțu J., 2019. Plga –
gentamicin biocomposite materials with potential antimicrobial applications i n
orthopedics, FARMACIA , 67, 4, 580 -586. https://doi.org/10.31925/farmacia.2019.4.4
Autor corespondent . IF 1. 607
Reviste cotate BDI
1. Paulina Podgoreanu, Madalina Stefania Negrea, Ruxandra Buia, Cristina Delcaru,
Simona Bianca Trusca, Veronica Lazar, Carmen Mariana Chifiriuc, 2019, Alternative
strategies for fighting multidrug resistant bacterial infections, Biointerface Research
in Applied Chemistry , 9, 1, 3834 -3841 . https://doi.org/10.33263/BRIAC91.834 841.

LUC RĂRI ȘTIINȚIFICE COMUNICATE ȘI PUBLICATE ÎN REZUMAT
Manifestări științifice naționale
1. Paulina Podgoreanu , Ruxandra Buia, Carstei Ionut, Bianca Simona Trusca , Cristina
Delcaru, Coralia Bleotu, Lia -Mara Ditu , Mariana Carmen Chifiriuc , Diversity of
pathogenicity and v irulence mechanisms of multidrug -resistant strains of
Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus , Simpozionul ―Academician
Nicolae Cajal‖ , 22 – 24 martie 2018 , Bucuresti, poster .
2. Manda C.V., Ciocîlteu Maria -Viorica, Biță A., Pope scu M., Croitoru O., Neamțu J.,
Podgoreanu P. , Chifiriuc M.C., Plga-gentamicine biocomposite with possible
orthopedic applications, Zilele U.M.F. din Craiova, a XLIX -a Ediție, 7 -8 Iunie 2019,
Craiova, comunicare orală .
3. Paulina Podgoreanu , Felicia Ciulu -Costinescu, Ruxandra Buia, Stefania Madalina
Negrea, Mariana Carmen Chifiriuc, Antimicrobial and anti -biofilm activity of
capsaicina -alpha -cyclodextrin inclusion complexes, Simpozionul ―Academician
Nicolae Cajal‖, 17 – 19 octombrie 2019, Bucuresti, poster .

149
ARTICOLE din afara conținutul ui tezei de doctorat
Reviste cotate ISI
1. Cristina Delcaru , Ionela Alexandru , Paulina Podgoreanu , Mirela Grosu , Elisabeth
Stavropoulos , Mariana Carmen Chifiriuc , Veronica Lazar , 2016, Microbial Biofilms
in Urinary Tract Infections and Prostatitis: Etiology, Pathogenicity, and Combati ng
strategies, Pathogens , 5.4, 65. https://doi.org/10.3390/pathogens5040065 . Co-autor
IF 2.93
2. Cristina Delcaru, Paulina Podgoreanu , Ionela Alexandru, Nela Popescu, Luminița
Măruțescu, Coralia Bleotu, George Dan Mogoșanu, Mariana Carmen Chifiriuc,
Marinela Gluck, Veronica Lazăr, 2017, The study of antibioresistance and virulence
mechanisms of recent strains isolated from urinary tract infections in patients with
prostatic disease, Pathogens , 5.4, 65 . https://doi.org/10.3390/pathogens6020022 Co-
autor IF 3.52
LUCRĂRI ȘTIINȚIFICE COMUNICATE ȘI PUBLICATE ÎN REZUMAT
Manifestări științifice inter naționale
1. Paulina Podgoreanu , Carmen Curu tiu, Mihai Coman, Coralia Bleotu, Denisa Dragu,
Mihaela Chivu Economescu, Marcela Popa, Andreea Zarafu, Alina Maria Holban,
Lia Mara Ditu, Ionut Carstei, Irina Cucu, Iuliana Crisan, Carmen Violeta Popescu,
Candice Popescu, Mariana Carmen Chifiriuc, Veronic a Lazar, In vitro and in vivo
studies regarding the interaction of different plant and bee products with allochtonous
and autochtonous microbiota, 39th Congress of the Society for Microbial Ecology
and Disease, June 7 -10, 2017, Tokyo, Japan, poster .
Manife stări științifice naționale
1. Paulina Podgoreanu , Ionela Alexandru, Mariana Carmen Chifiriuc, Veronica Lazar,
Gluck Marinela, Coralia Bleotu, Elena Grosu, Lia -Mara Ditu, Cristina Delcaru,
Studiul activitatii antibiofilm a unor noi materiale polimerice bioact ive destinate
fabricarii dispozitivelor medicale tubulare, Simpozionul ―Academician Nicolae
Cajal‖ , 30 – 01 aprilie 2017 , Bucuresti, poster .