1. Introducere ……………………………………………………………………………………… 3 2. Aspecte teoretice ……………………………………………………………… ……………….. .4 2.1. Porfirii ………………………………………………… [616389]

1
CUPRINS
1. Introducere ……………………………………………………………………………………… 3
2. Aspecte teoretice ……………………………………………………………… ……………….. .4
2.1. Porfirii ……………………………………………… …………………………… …… 4
2.1.1. Calea de sinteză a hem -ului…………………………………………………. 4
2.1.2. Defecte genetice ce duc la acumularea de precursori porfirinici …………….6
2.1.3. Tipurile de porfirii acute ………………………………………………… …..7
2.1.3.1. Porfiria acută intermitentă (PAI) …………………………………. 8
2.1.3.2. Porfiria variegată …………………………………………… ……..8
2.1.3.3.Coproporfiria ereditară ……………………………………… ……..9
2.1.3.4. Porfiria acid δ aminolevulinic dehidratază deficientă ……………..9
2.1.4. Simptomatica atacurilor acute ………………………………………… …….9
2.1.5 Neuropatia ca rezultat al porfiriilor acute …………………………………. ..11
2.1.6. Factori declanșatori ai atacurilor de porfirie ……………………………… ..13
2.1.7. Diagnostic și control al bolii ………………………………………………. .15
2.1.7.1. Teste biochimice și modalități de diagnostic …………………… ..15
2.1.7.2. Controlul bolii …………………………………………………… 18
2.2. Implicarea canalelor TRP în percepția durerii ………………………… …………… ..20
2.2.1. Caracteristici generale ale canalelor TRP …………………………………. .20
2.2.2. Expresie și distribuție …………………………………………… …………21
2.2.3. Farmacologia și modularea …………………………………………………22
2.2.3.1. TRPV1 …………………………………………………………. ..22
2.2.3.2. TRPA1 …………………………………………………………. ..23
2.2.3.3. TRPM8 ………………………………………………… …………24
2.2.3.4. Interacții între diferite canale …………………………………… ..24
2.2.4. Implicarea în nocicepție și diferite tipuri de durere …………………… ……25
2.2.5. Durerea asociată neuropatiei …………………………………………… ….27
2.2.5.1. Rolul TRPV1 …………………………………………………… ..30
2.2.5.2. Rolul TRPA1 ……………………………………… ……………..32
2.2.5.3. Rolul TRPM8 …………………………………………… ……….33
2.3. Interferența ARN mediată de ARN mic de interferență …………………………… …35

2
2.3.1. Fenomenul de interfe rență ARN ……………………………………………35
2.3.2. Structură ARNsi …………………………………………… ………………37
2.3.3. ARNsi endogen ……………………………………………………… …….38
2.3.4. Proteinele de clivare ale ARNdc, RISC și proteina Ago2 ……………… ….39
2.3.5. Agenți de transfecție ……………………………………… ………………..42
2.3.6. Optimizarea eficienței silențierii și metode de măsurare a acesteia …………44
3. Materiale și metode …………………………………………………………………………….46
3.1. Reactivi și soluții utilizate ……………………………………………………………46
3.2. Mod de lucru ……………………………………………………………………… …47
3.2.1. Cultură primară de neuroni din ganglionii spinali de la șobolan ……………47
3.2.2. Silențierea genei pentru porfobilinogen deaminază (PBGD) ………………47
3.2.3. Imagistică de calciu pentru observarea activității canalelor TRPA1, TRPV1
și TRPM8 ……………………………………………………………………………………… …48
3.2.4. Western blot pentru evidențierea silențierii genei PBGD ………………….50
3.2.5. Imagistică ROS …………………………………………………………….52
4. Rezultate și discuții …………………………………………………………………………… .54
4.1. Rezultate …………………………………………………………………… ……… ..54
4.1.1. Silențierea genei HMBS în neuroni din DRG de șoboloan și determinarea
nivelului proteinei prin Western blot ………………………………………………………………54
4.1.2. Imagistică de calciu pentru evidențierea activității modificate a TRPA1,
TRPV1 și TR PM8 …………………………………………………………………………………55
4.1.3. Imagistica DRG a speciilor reactive de oxigen …………………………… ..60
4.2. Discuții ……………………………………………………………………………….61
5. Concluzii ……………………………………………………………………………… .62
6. Bibliografie …………………………………………………………………………… .63
7. Listă figuri ………………………………………………………………………………67

3
1. Introducere
Porfiriile acute sunt afec țiuni metabolice moștenite ce rezultă din incapacitatea celulelor de
a sinteza eficient hem. În acest context, apar diferite efecte negative rezultate atât din cauza
cantității insuficiente de hem cât și din cauza acumulării unor precursori toxici, ca acid ul d
aminolevulinic (ALA) sau porfobilinogenul (PBG) (Lin și colab, 2011).
Porfiria acută intermitentă este forma de porfirie acută cu cel mai mare impact la nivelul
populației, afectând aproximativ 1 din 75 de mii de persoane, existând însă în Suedia un efect de
fondator, fiind raportate cazuri la 1 din 1000 de persoane (Puy și colab, 2010). Maladia este marcată
de atacuri acute, caracterizate de simptomatică nespecifică ce include dureri abdominale, slăbiciuni
și dureri ale membrelor, greață, emeză, dar și manifestări psihiatrice ca anxietate depresie și
paranoia (Lin și colab, 2011).
O altă caracteristică a porfiriilor acute este instalarea neuropatiei periferice. Aceasta poate
rezulta ca o consecință a nivelului redus de hem, ce duce la o funcționare an ormală a catenei
transportoare de electroni mitocondrială și cantități reduse de ATP, dar și din cauza efectului
neurotoxic direct al intermediarilor din calea de sinteză. Deși în literatură este raportată în principal
neuropatia motorie, este cunoscut fap tul că există și neuropatie a neuronilor senzitivi (Lin și colab,
2011).
Canalele Transient Receptor Potential (TRP) , în special TRP melastatin 8 (TRPM8), TRP
vaniloid 1 (TRPV1) și TRP ankirin 1 (TRPA1) sunt implicate în transmiterea durerii, fiind
exprima te în nociceptori. Durerea neuropatică poate apărea din mai multe motive, printre acestea
numărându -se și lezarea nervilor (Basso și Altier, 2017), afecțiune ce apare și în porfiriile acute. În
aceste condiții, TRPV1, TRPA1 și TRPM8 au funcțiile și nivelul de expresie alterate, conducând
la o transmitere anormală a durerii, fiind semnalate hiperalgezie mecanică, termică, cât și alodinie
la frig (Jardin și colab, 2017).
În cadrul lucrării este investigată activitatea TRPA1, TRPV1 și TRPM8 în condiții ce
mime ază porfiria acută intermitentă, condiții obținute prin interferență ARN ce împiedică expresia
porfobilinogen deaminazei, enzima cel mai des afectată în aceste maladii. De asemenea, a fost
investigată și capacitatea precursorilor ALA și PBG acumulați intra celular de a produce specii
reactive de oxigen.

4
2. Aspecte teoretice
2.1. Porfirii
2.1.1. Calea de sintez ă a hem -ului
Hem -ul este o grupare prostetică alcăuită dintr -un complex al fierului cu protoporfirina IX,
necesară pentru funcționarea tuturor or ganismelor aerobe (Ponka, 1999). P rin intermediul
transportului de electroni facilitat de citocromi (în structura cărora se află), acesta este implicat în
desfășurarea reacțiilor din catena respiratorie mitocondrială (Ponka, 1999 ; Puy și colab, 2011).
Hemp roteinele cuprind catalazele, peroxidaze, hidroxilaze pentru sinteza hormonilor steroizi
(Ponka, 1999 ; Lin și colab, 2011) dar și proteine ce fixează oxigenul ca hemoglobiona și
mioglobina. S inteza hem -ului în celulele liniei eritrocitare reprezintă aproxi mativ 85% din sinteza
totală zilnică. Cealaltă fracție este realizată în principal în hepatocite, apro ape exclusiv pentru
formarea citocromului P450 și a diferite enzime din reticulul endoplasmic al hepatocitelor (Balwani
și Desnick, 2012).
Formarea hem -ului este realizată pe parcursul a opt etape enzimatice distincte, prima și
ultimele trei rea cții desfășurându -se în mitocondrie, celelalte în citosol (Balwani și Desnick, 2012).
Calea de sinteză a hem -ului debutează cu reacția catalizată de acid δ aminolevu linic (ALA) sintaza
(ALAS), prin care sunt condensate o molec ulă de glicină și o moleculă de succinil coenz ima A
pentru a forma o moleculă de ALA (Lin și colab, 2011, Ponka 1999). ALA sintaza se găsește sub
forma a două izoenzime codificate de gene diferite (Balwani și Desnick, 2012), ALAS 1 fiind
situată pe cromozomul 3, iar ALAS 2 pe cromozomul X (Bissell și Wang, 2015). ALAS 1 e ste o
genă exprimată bazal în to ate celulele organismului, în timp ce ALAS 2 este spec ifică liniei de
diferențiere a eritrocitelor. (Balwani și Desnick, 2012). ALAS 1 este inhibată de produsul final al
căii metabolice, și anume hem -ul (Herrick și McColl, 2005). ALAS 1 este controlată și de efectul
glucozic (nivele mari de glucoză sau carboh idrați), prin modularea factorilor de tr anscripție, printre
care Peroxizom proliferator -activat receptor gamma coactivator PGC -1. ALAS 2 se găsește sub
controlul factorilor de transcripție eritroizi, cum ar fi factor ul de legare GATA 1 și sitemul de
protei ne reglatoare de Fe (Wang și colab, 2018). Acidul δ aminolevulinic se întălnește în literatură
și ca acid 5 aminolevulinic sau acid d aminolevulinic.

5
ALA este apoi dimerizat pentru a se forma porfobilinogen (PBG) (Lin și colab, 2011),
reacție catalizată de ALA dehidrataza și realizată în citosol (Bissell și Wang, 2015). Ulteriror, patru
molecule de PBG sunt condensate rezultând hidroximetil bilan, prin acțiunea enzimei hidroximetil
bilan sintază (HMBS), care este numită și porfobilinogen deaminază (PBGD). H idroximetil bilanul
este convertit în uroporfirinogen (Harper și Sardh, 2014), de o enzimă numită uroporfirinogen III
sintază, reacție urmată de o decarboxilare catalitază de uroporfirinogen III decarboxilaza cu
formare de coproporfirin ogen. Calea metaboli că se continuă prin activitatea coproporfirinogen
oxidazei, enzimă ce duce la formarea de protoporfirinogen IX, ce este apoi convertit la
protoporfirina IX de către protoporfirino gen oxidaza. Î n final atașarea unui atom de Fe mediată de
ferochelatază duce la formarea de hem (Harper și Sardh, 2014 ; Kim și coalb, 2015). Ultimele trei
reacții se desfășoară în mitocondrie , (Fig 1) (Ponka, 1999).

6
Figură 1: Calea de sinteză a hem -ului. Prima etapă enzimatică presupune formarea ALA dintr -o moleculă de
succinil C oA și o moleculă de glicină , iar ultima este reprezentată de atașarea unei molecule de Fe la protoporfirina
IX. Prima și ultimele 3 etape se desfășoară în mitocondrie, restul în citosol. Grupările acetil au fost notate Ac, acid
propionic Pr, vinil Vi. Figură adaptată după Ponka, 1999.
Enzima ce controlează viteza căii metabolice în ficat este ALAS 1, activitatea, expresia și
transportul acesteia fiind contr olate de nivelul de hem liber din celule. Astfel, hem -ul blochează
translocarea în mitocondrie a e nzimei traduse în citosol, dar poate bloca și sinteza de ARNm pentru
aceasta (Balwani și Desnick, 2012 ; Besur și colab, 2015). De asemenea, în condiții normale, hem –
ul afectează stabilitatea ARNm al ALAS 1 și promo vează degradarea protein ei mediată de prot eaza
Lon din mitocondrie. Rata crescută a expresiei ALAS 1 poate fi un rezultat al utilizării
medicamentelor și compușilor chimici lipofilici ce i nteracționează cu receptori nuc leari ce se leagă
de regiunile enhancer ale genei (Besur și colab, 2015). O alt ă enzimă ce regleză viteza căii
metabolice este PBGD, proteină și genă asociată importante pentru afecțiunile acestei căi (Herrick
și McColl, 2005).
În celulele eritrop oietice din măduva osoasă se desfășoară majoritatea sintezei hem -ului din
organism, iar aceasta e controlată diferit față de cea din ficat. Reglajul se desfășoară în timpul
diferențierii celulelor sub acțiunea eritropoietinei, dependent de disponibilitatea ion ilor de Fe (Puy
și colab, 2010). Aceștia sunt esențiali întrucât reglează tr anslația ARNm pentru ALAS 2 și sunt
substrat pentru ferochelatază (Balwani și colab, 2012). ALAS 2 este specifică pentru celulele
eritroide, întrucât gena conține element e gentice reglatoare cis, la care se pot lega diferiți factori de
transcripție, printre care factorului nuclear eritroid 2. De asemenea, activitatea enzimei nu e
inhibată de hem, iar în linii celulare s -a arătat că acesta promovează translația ARNm al ALAS 2
(Ponka, 1999).
2.1.2. Defecte genetice ce duc la acumularea de precursori porfirinici
Porfiriile sunt boli moștenite, autozomal dominante, autozomal recesive, X -lincate, sau
dobândite (porfiria cutanea tarda), în care una din genele ce codifică pentru enzime le din calea de
sinteză a hem -ului este afectată (Balwani și colab, 2012). În mod o bșnuit sunt clasificate ca porfirii
acute, caracterizate de simptome neuropsihiatrice , sau cut anate, marcate de hipersensibilitatea la
lumina soarelui. Pot fi clasificate și ca porfirii eritropoietice sau hepatice, în funcție de țesutul
afectat de defectel e genetice (Harper și Sardh, 2014). Porfiria acută intermitentă (PAI) , cea mai

7
răspândită formă de porfi rie acută, rezultă din urma unor mutații la nivelul genei ce codifică enzima
PBGD (Siegesmund și colab, 2010), coproporfiria ereditară (CPE) rezultă din mutații în gena
pentru coproforfirinogen oxidază (CPOX), iar porfiria variegată (PV) rezultă din cauza mutațiilor
din gena protoporfirinogen oxidazei (PPOX). Cea mai rară dintre porfiriile acute este porifiria ALA
dehidratază deficientă, numită și porfiri a Doss (Poblete -Gutierrez și colab, 2006), fiind semnalate
mai puțin de 20 de cazuri la nivel mondial (Balwani și colab, 2012). Au fost raportate câteva cazuri
de PAI în care ambele gene erau defecte, pacienții homozigoți suferind manifestări neurologice
severe în copilărie (Harper și Sardh, 2014).
Mutațiile ce induc pierderea funcției genei ALAS 2 conduc la instalarea anemiei
sideroblastice X lincate, în timp ce mutațiile ce determină câștig de funcție (de obicei afectează
ultimul exon al genei), sunt cau za protoporfiriei eritropoietice X lincate (Balwani și colab, 2012).
2.1.3. Tipurile de porfirii acute
Termenul de porfirie derivă din grecul ”porph yra” (un pigment violet) și a fost folosit pentru
prima oară de chimistul german Hoppe -Seyler în 1871 când a remarcat moleculele porfirinice. El
a folosit termenul ”hematoporfirin” pentru a descrie pigmentul violet -roșiatic izolat din hematină
(compus format prin oxdiarea hem -ului). Porfiria acută intermitentă a fost prima oară descrisă
formal în 1937, însă din date istorice se poate determina că au mai existat figuri importante ce e ste
posibil să fi suferit această afecțiune. Regele George al III -lea și Vincent van Gogh se numără
printre personalitățile a căror simptom atică ar fi putut indica un diagnostic cu p orfirie, întrucât
prezentau dureri abdominale, tulburări gastrointestinale, slăbiciune musculară și diferite afecțiuni
psihice (L in și colab, 2011).
Tipurile principale de porfirie acută (autozomal dominante) sunt porfiria acută intermitentă
(PAI), porfir ira variegată (PV) și coproforfiria ereditară (CPE), pe lângă care s -a raportat și porfiria
ALA dehidratază deficientă, autozomal recesivă (Balwani și colab, 2012). Aceste tipuri de porfirii
au fost considerate acute întrucât atacurile presupun aceleași ti puri de simptome nespecifice
(Siegesmund și colab, 2010), printre care dureri abdominale de lungă durată, greață, tahicardie,
hipertensiune arterială, diferite afecțiuni neurologice și psihiatrice, convulsii (Poblete -Gutierrez și
colab, 2006).

8
Este impor ant de notat că în PAI, PV si CPE mutațiile determină o reducere cu aproximativ
50% a activității enzimatice obișnuite, nu o pierdere totală a funcției (Wang și colab, 2018)

2.1.3.1. Porfiria acută intermitentă (PAI)
PAI este cea mai prevalentă formă de porfirie acută, este o afecțiune gene tică autozomal
dominantă caracterizată de dureri abdominale rezultate în urma crizelor neuroviscerale (Herrick și
McColl, 2005). Boala este cea mai severă din clasa sa din punct de vedere clinic și apare la 5 -10
persoane din 100 de mii (Wang și colab, 2018) . Permeanța bolii este însă mică, deoarece mutațiile
la nivelul genei HMBS apar la aproximativ 1 din 100 după unele aprecieri, (Herrick și McColl,
2005) sa u 1 din 500 conform altora (Lin și colab, 2011). S -a remarca t însă un efect de fondator în
nordul Suediei, unde afecțiunea apare la 1 din 1000 de persoane, incidență mult mai mare față de
media europeană de 1 din 75 de mii (Puy și colab, 2010). Gravitatea afecțiunii ar putea fi
determinată de activi tatea bazală red usă a HMBS hepatic , fiind doar puțin mai activă decât prima
enzimă din calea metabolică, ALAS 1 (Wang și colab, 2018).
În PAI, PBGD are o funcție alterată, astfel nu se poate forma destul uroporfirinogen pentru
a se continua calea metabolică de sinteză a h em-ului, în consecință acumulându -se în celule
precursorii ALA și PBG. Gena pentru PBGD are 15 exoni, se găsește pe brațul lung al
cromozomului 11 la oameni și conține în structura sa doi promotori. Unul determină transcrierea
unui ARNm constitutiv în toat e celulele, iar celălalt este specific eritroid, diferențierea rezultând
prin procese de splicing alternativ (Herrick și McColl, 2005), forma eritrocitară neprezentând
exonul 2 (Bissell și Wang, 2015). Mutații pot apărea în ambele izoforme ale enzimei (Her rick și
McColl, 2005). Majoritatea mutațiilor sunt mis -sens și determină introducerea unui codon stop
fiind tradusă o enzimă incompletă și nefuncțională. Până la 90% din pacienții heterozigoți cu PAI
sunt asimpt omatici de -a lungul vieții (Lin și colab, 201 1).
2.1.3.2. Porfiria variegată
Porfiria variegată nu este la fel de prevalentă în Europa ca PAI, însă este foarte comună în
Africa de Sud și Chile, din cauza unui e fect de fondator, incidența fiind de 1 din 30 de mii în
populația albă (Puy și colab, 2010 ; Siegesmund și colab, 2010). Efectul de fondator din Africa de
Sud poate fi asociat direct cu un colonist olandez din 1688. În prezent, aproximativ 20000 de

9
oameni suferă de această boală, 90% dintre ei prezentând aceeași mutație (Bissell și Wang, 2015).
Mutația determinantă a bolii este în cadrul genei PPOX, codificatoare pentru protoporfirinogen
oxidaza. Împreună cu coproporfiria ereditară sunt singurele forme de porfirii acute în care
simptomele includ afecțiuni ale pielii asemănătoare cu cele observate în porfiria cutanea tarda, de
aceea au fost numite și porfirii neurocutanate (Siegesmund și colab, 2010).
2.1.3.3. Coproporfiria ereditară
Coproporfiria ereditară este o afecțiune rară cu simptomatică asemănătoare porfiriei
variegate. Defectul genetic este remarcat în gena CPOX, codificatoare pentru coproporfirinogen
oxidază, a șasea enzimă din calea de sinteză a hem -ului. Asemănător cu PV, s unt semnalate leziuni
cutanate în zonele expuse la soare (Poblete -Gutierrez și colab, 2006; Siegesmund și colab, 2010).
2.1.3.4. Porfiria acid δ aminolevulinic dehidratază deficientă
Porfiria Doss este singura formă de porfirie acută atutozomal recesivă, defectele sunt
prezente pe ambii cromozomi, în cadrul genei ce codifică pentru ALA dehidratază. Sunt foarte
puține cazuri semnalate la nivel mondial , iar manifestările bolii sunt asemănătoare cu cele ale PAI
(Poblete -Gutierrez și colab, 2006; Balwani și De snick, 2012).
2.1.4. Simptomatica atacurilor acute
Atacurile acute sunt caracterizate de simptome nespecifice (Siegesmund și colab, 2010).
De asemenea, nu prezintă o componentă inflamatorie și nu sunt niciodată semnalate febră sau
leucocitoză (Balwani și Desnick, 2012). Crizele sunt marc ate de dureri abdominale, dureri și
slăbiciuni ale membrelor, dureri în piept, gât sau în zona capului (Fig 2) (Cardenas și Guerrero,
2018), dar și greață, vomă, constipație sau diaree. Hipertensiune, tahicardie și aritmii cardiace sunt
prezente în aproape toate cazurile, consecință a ac tivității anormale a sistemului nervos autonom
(Lin și colab, 2011) . S-a demonstrat că nivele ridicate de ALA, caracteristice atacurilor acute au
un efect direct asupra sistemului digestiv, promovând spasmele intestinale (Cardenas și Guerrero,
2018).

10

Figură 2: Cele mai frecvente manifestări ale durerii în crizele acute de porfirie , figură adaptată după Cardenas
și Guerrero, 2018 .
Neuropatia motorie poate duce la pareză și paralizie, iar implicarea sistemului respirator
poate rezulta în stop cardio -respirator și moarte ( Gorchein, 1997; Harper și Sardh, 2014).
Implicarea s istemului nervos central a fost dedusă din manifestări le psihiatrice ce includ anxietate,
depresie, insomnie, agitație, confuzie și halucinații (Lin și colab, 2011; Harper și Sardh, 2014 ). Se
presupune că simptomele asociate sistemului nervos central sunt mediate în parte de nervul vag
(Siegesmund și colab, 2010 ). Pacienții cu PAI pot dezvolta în timpul unui atac convulsii și
encefalopatii, cele din urmă fiind observate prin anormalități la analiza cu rezonanță magnetică.
Persoanele pot prezenta leziuni corticale similare encefalopatiilor reversibile. Consulviile apar doar
la 5% din pacienții cu PAI și sunt un rezultat al h iponatremiei instalată ca urmare a pierderilor
gastrointestinale majore sau secreției anormale de vasop resină (Puy și colab, 2010; Lin și colab,
2011). Un alt motiv al apariției convulsiilor este hipomagnezia indusă de dehidratare și dezechilibru
electroli tic (Puy și colab, 2010).
De asemenea, s -au remarcat leziuni vasospastice și citotoxice în sistemul vascular renal,
din cauza excesului de metaboliți porfirinici ce traversează vasele de sânge (Cardenas și Guerrero,
2018). Insuficiența renală apare la pacienții cu porfirie atât acută cât și cronică (Siegesmund și
colab, 2010) . În timpul atacurilor acute s -au măsurat nivele de catecolamine de până la 10 ori mai
ridicate, fapt ce explică hiperten siunea arterială. Un efect secundar al hiperactivității sistemului
nervos simpatic este generarea de vasospasme, care după un timp suficient de lung pot induce
leziuni ischemice (Cardenas și Guerrero, 2018) .
În ceea ce privește porfiriile acute, doar pac ienții cu CPE și PV prezintă fotosensibilitate și
apariția iritațiilor cutanate la contactul cu lumina (Gorchein, 1997; Herrick și McColl, 2005). Dacă

11
nu sunt tratate, atacurile acute pot fi fatale (Herrick și McColl, 2005). Recuperarea după un atac
ușor p oate dura câteva zile, iar în cazul atacurilor severe poate dura de la câteva săptămâni la luni
(Siegesmund și colab, 2010).
Mai puțin de 10% din pacienți suferă atacuri recurente, femeile fiind mai predispuse decât
bărbații. De asemenea, s -a remarcat fap tul că atacurile sunt foarte rare înainte de pubertate și după
menopauză, manifestându -se cel mai adesea în al treilea deceniu de viață, indiciu al implicării
hormonilor în declanșare (Puy și colab, 2010). Atacurile se manifestă cel mai des în faza luteală a
ciclului menstrual, când nivelul de progesteron este cel mai ridicat (Wang și colab, 2018). CPE este
de asemenea mai des întâlnită la femei decât la bărbați (Siegesmund și colab, 2010).
Toate porfiriile acute autozomal dominante au fost introduse ca fa ctori de risc pentru
dezvoltarea carcinoamelor hepatocelulare, mai multe studii găsind o asociere între cancerul hepatic
și porfiriile acute hepatice (Siegesmund și colab, 2010). Rezultatele unui studiu realizat în Suedia
au raportat o creștere a riscului de cancer hepatic cu 80% și 150% pentru bărbați, respectiv femei
ce suferă de porfirii hepatice, după vârsta de 50 de ani (Bissell și colab, 2017).
Afecțiuni ce prezintă simptomatică asemănătoare porfiriilor acute sunt tirozinemia ereditară
și intoxicarea cu plumb. Aceste două afecțiuni interferă cu sinteza h em-ului, inactivând parțial
ALA dehidrataza , determinând astfel acumularea unei concentrații excesive de ALA, dar nu și de
PBG (Bissell și Wang, 2015).
2.1.5 Neuropatia ca rezultat al porfiriilor acut e
Neuropatia porfirinică se manifestă de obicei în porfiriile acute, în special în PAI și este
caracterizată de lezarea sistemului nervos central, autonom, visceral sau periferic. Dacă stresorii
inițiali nu sunt îndepărtați, simptome ca depresia, starea d elirică și cuadriplegia se pot agrava
(Siegesmund și colab, 2010).
Există posibilitatea apariției neuropatiei în cazurile în care se administrează medicamente
porfirinogene în timpul unui atac. Neuropatia este în mare parte motorie, fiind afectați mai des
mușchii brațelor decât cei ai picioarelor, iar pacienții semnalează durere musculară și slăbiciune
(Puy și colab, 2010). Totuși, întrucât nu este specifică, neuropatia porfirinică și efectele sale în
sistemul nervos central nu pot fi folosite pentru diagn ostic (Siegesmund și colab, 2010).

12
Pareza poate apărea doar localizat, însă slăbiciunea poate evolua până la paralizie bulbară,
stop respirator și moarte. Printre efectele pe termen lung se numără paralizia membrelor, sindromul
cerebelar, orbire și afecțiu ni ale stării de cunoștință, ce pot evolua până la comă (Puy și colab,
2010).
Principala caracteristică ce se remarcă în PAI este disfuncția autonomă și a nervilor . Există
mai multe ipoteze ce încearcă să explice acest fapt. În primul rând e luată în con siderare
neurotoxicitatea dată de acumularea de ALA și PBG în celule, ce determină formarea de specii
reactive de oxigen și demielinizarea neuronilor (Lin și colab, 2011; Cardenas și Guerrero, 2018) .
Concentrații mari de ALA în cr eier ar putea afecta endot eliul și bariera hemato -encefalică , dar și
activitatea acidului gama amino butiric (GABA), prin interacțiunea cu receptorii pentru GABA și
pentru glutamat din sistemul limbic. Acest lucru este posibil întrucât ALA și PBG au structuri
similare cu GABA. Defi ciența de hem este posibil să inducă degenerarea sistemului nervos central
și disfuncția neuronală prin alterarea vitezei de propagare a potențialelor de acțiune, activității
acetil -colinei și funcției ATP -azei de sodiu și potasiu. O altă enzimă afectată d e insuficiența de hem
este triptofan pirolaza hepatică, lipsa grupării prostetice ducând la inactivarea sa. Consecințe ale
acestui fapt ar putea fi nivele crescute de triptofan în creier, scăderea nivelului de melatonină și o
rată de sinteză și degradare m ai mare a 5 -hidroxitriptaminei (serotonină) . Instabilitatea
conc entrației de serotonină duce la o transmisie alterată a nocicepției la nivel central și periferic,
iar ca un efect secundar destabilizează motilitatea intestinală. ALA este un agent ce peroxid ează
lipidele, iar deficiența de melatonină induce o vulnerabilitate accentuată la acest tip de peroxidare
(Cardenas și Guerrero, 2018).
O altă ipoteză ce încearcă să explice neurotoxicitatea în porfirii este bazată pe reducerea
concentrației de hem și ma i ales implicarea acestuia ca grupare prostetică în funcționarea eficientă
a catenei respiratorii mitocondriale. Nivele scăzute de hem pot duce la disfuncții energetice (nu
mai funcționează catena transportatoare de electroni din mitocondrie) și astfel la o funcționare
anormală a ATP -azei de sodiu și potasiu. Pe lângă concentrația mică de ATP, se observă și o
funcționare defectuoasă a hemproteinelor și enzimelor de detoxifiere, cum ar fi citocromul P450
(Lin și colab, 2011).
Neurotoxicitatea contribuie la degenerarea și instalarea disfuncției nervilor. În urma
autopsiilor s -a raportat cromatoliza extinsă a celulelor coarnelor anterioare ale măduvei spinării,

13
cel mai probabil din cauza leziunilor axonale. Biopsii musculare au arătat modificări neurogenice,
printre care și o pierdere substanțială de fibre nervoase, denervarea completă fiind prezentă doar în
puțini mușchi (Lin și colab, 2011).
Administrarea de ALA în modele animale induce afecțiuni la nivelul ADN, mitocondriilor
și formarea de specii reactive de oxigen. Având în vedere concentrațiile crescute ale acestui
precursor în atacurile acute, aceste acțiuni ar putea explica efectele asupra neuronilor. ALA nu este
însă singurul factor ce le determină, întrucât administrarea acestui metabolit unor subiecț i sănătoși
nu induce simptome specifice porfiriilor (Lin și colab, 2011).
Efcetele de lungă durată ale porfiriilor includ demielinizarea nervului vag și cromatoliza
celulelor din sistemul simpatic în special a ganglionilor celiaci (Cardena și Guerrero, 2018).
2.1.6. Factori declanșatori ai atacurilor de porfirie
Există mai mulți factori ce pot duce la instalarea unui atac acut în PAI (Herrick și McColl,
2005). Declanșatorii din mediu sunt stresul, înfometarea și emeza, elemente ce induc sinteza de
hem (Lin și colab, 2011). Citocro mul P450 este principala proteină implicată în atacurile acute de
porfirie și orice fenomen din organism ce ne cesită o cantitate mărită a acestei proteine va induce
sinteza de hem. Printre aceste fenomen e se numără acțiunea progesteronilor, metabolizarea
barbituricelor , fumatul și consumul de alcool (Herrick și McColl, 2005). Acești facori induc și
expresia mai accentuată la nivel de proteină a ALAS, enzimă a cărei activitate promovează atacurile
(Balwani și Desnick, 2012). De asmenea, febra și postul induc activarea hem oxigenazei, fapt ce
rezultă în scăderea cantității disponibile de hem. Toate acestea duc la necesitatea sintezei grupării
prostetice în cantități mai mari comparativ cu condiții le normale, astfel fiind crescută activitatea
ALAS 1 și formarea de ALA în exces, factor declanșator al atacului acut (Herric k și McColl, 2005).
Majoritatea substanțelor ce induc un atac porfirinic acut activează căile metabolice în care
e implicat citocromul P450, dar această enzimă poate fi afectată și indirect prin acțiuni chirurgicale
sau infecții ce activează hem oxigenaza, enzima ce catabolizează hem -ul, Fig (3) (Cardenas și
Guerrero, 2018) .

14

Figură 3: Inducerea unui atac acut, determinată de scăderea concentrației de hem. Hem are un efect inhibitor
direct asupra ALAS 1. Nivelul de hem poate scădea ca urmare a conusmării citocromului P450, implicat în
metabolizarea medicamentelor și a unor hormoni, și prin catabolismul său catalizat de hem oxigenază, en zimă activată
în post, inflamații și infecții. Dacă nivelul de hem este scăzut, activitatea ALAS 1 este crescută, însă defectul în proteina
PBGD determină acumularea de ALA și PBG în celule, molecule ce produc efecte neurotoxice și pot fi observate în
urină. Figură adaptată după Harper și Sardh, 2014.
Un alt factor ce induce expresia crescută de ALAS și astfel formarea exagerată de ALA ce
nu poate fi convertit în PBG este deficiența de glucoză sau produși glicogenici ce în mod normal
sunt supresori ai expr esiei ALAS (Besur și colab, 2015).
S-a remarcat că unele din atacurile acute ale pacienților cu PAI sau PV ce au fost declanșate
în cadrul spitalelor și au fost trata te necorespunzător au prezentat simptome mai severe decât cele
ce nu au fost tratate. Din acest motiv s -au identificat medicamente ce accentuează intensitatea unui
atac acut, printre acestea numărându -se barbituricele și sulfonamidele. Porfirinogenitatea unui
compus poate fi demonstrată experimental prin determinarea creșterii activității ALAS , creșterii
ratei de sinteză a precursorilor porfirinici în celule, sau prin determinarea de cantități crescute de
ALA sau PBG în șobolani. Animalele experimentale sunt tratate cu compuși ce inhibă calea de
sinteză a hem -ului, astfel încât orice răspuns de terminat de acțiunea medicamentelor va fi

15
amplificat pentru a mima porfiriile hepatice latente de la oameni (Gorchein, 1997). Alte modele
animale în care PBGD prezintă activitate redusă cu 70% au fost dezvoltate pentru studiul bolii.
Aceste animale au o co ncentrație bazală de ALA și PBG crescută, iar atacurile acute pot fi
declanșate oricând prin administrarea de fenobarbital. Prin investigarea acestor modele animale,
poate fi observată evoluția neuropatiei motorii, degradarea axonilor și amplitudinile mai mici ale
potențialelor de acțiune motorii sumate (Lin și colab, 2011).
Unele medicamente pot avea efect direct asupra căii de sinteză a hem -ului, prin generarea
de inhibitori de ferochelatază. Poate exista și un efect indirect prin activarea exagerată a c ăii, ca
rezultat al distrugerii citocromului P450 sau inactivării acestuia prin N -alchilarea grupării
prostetice. Aceste efecte au fost studiate în modele animale administrându -se în asociere și compuși
ce acționează prin formarea de specii reactive de oxi gen, ce inhibă uroporfirinogen decarboxilaza,
dar și compuși ce inhibă PBGD direct, cum ar fi sulfonamidele. O dificultate în acestă strategie de
studiu este că modelele nu aduceau informații despre neuropatia rezultată în urma porfiriei. Pentru
studiul ne uropatiei se pot folosit șobolani a căror activitatea a PBGD a fost redusă cu 30%
(Gorchein, 1997).
Majoritatea datelor obținute au fost relevante și în cazuri clinice. Totuși, în urma acestor
experimente s -a observat că există medicamente ce au indus răspunsuri la animalele experimentale,
dar nu și la pacienți. Mai grav este că au fost semnalate medicamente ce nu induceau răspuns în
modelele animale folosite, dar au amplificat atacurile acute la pacienți (Gorchein, 1997).
Întrucât hormonii sunt un fac tor declanșator al atacurilor acute, s -a pus problema afectării
sarcinii de către PAI. Un studiu efectuat pe 27 de femei pe parcursul a 33 de sarcini a concluzionat
că nu există complicații determinate de porfirii, iar tratamentul obișnuit pentru crize nu afectează
fătul (Siegesmund și colab, 2010).
2.1.7. Diagnostic și control al bolii
2.1.7.1. Teste biochimice și modalități de diagnostic
ALA și PBG sunt solubili în soluții apoase, în timp ce următorii intermediari, de la
uroporfirină până la protoporfirina IX sunt din ce în ce mai lipofilici din cauza decarboxilărilor
succesive. Diferențele în solubilitate sunt evidente în căile de excreți e, întrucât intermediarii
solubili, inclusiv uroporfirina sunt eliminați exclusiv prin urină, coproporfirina este eliminată atât

16
renal cât și mediat de ficat, iar protoporfirina nu e detectabilă în urină, consecință a lipofilicității
crescute (Bissell și W ang, 2015).
PAI se caracterizează prin funcționarea deficitară a PBGD, ce duce la acumularea în celule
de ALA și PBG, precursori neurotoxici ai hem -ului. Un atac acut poate fi detectat prin determinarea
istoricului familial, dar este cel mai adesea determi nat biochimic prin dozarea ALA sau PBG din
urină (Herrick și McColl, 2005; Siegesmund și colab, 2010). Dozarea PBG si ALA din urină se
face cu ajutorul testului colorimetric ce folosește reactivul Ehrlich, și anume p -dimetil
aminobenzaldehidă (Gorchein, 19 97). Concentrația normală din urină este 0 -18μmol/dl , dar în
timpul unui atac acut poate depăși 880 μmol/dl (Lin și colab, 2011). Este posibilă excreția de urină
roșie sau închisă la culoare, simptom folosit în diagnostic (Puy și colab, 2010).
O altă metod ă ce poate fi folosită în diagnostic este măsurarea amplitudinii potențialului de
acțiune motor sumat, o reducere a acestuia fiind corelată cu neuropatia indusă de PAI. S -au raportat
și anormalități în conducția nervilor senzitivi, dar într -o proporție ma i mică decât în cei motori.
Studiul mușchilor la pacienții cu PAI indică schimbări neurogenice, printre care se numără o
pierdere severă de fibre nervoase, însă nu există efecte vizibile asupra mușchilor propriu ziși. Alte
studii au arătat degenerarea nerv ilor motori și senzitivi. Touși, aceste investigații electrofiziologice
sunt nespecifice, iar pentru un diagnostic eficient al porfiriilor sunt indispensabile investigațiile
biochimice, enzimatice și genetice (Lin și colab, 2011).
Pentru teste ulterioare p oate fi determinată și activitatea PBGD eritrocitară, problema
acestui test fiind că în aproximativ 5% din pacienți există o enzimă cu funcție alterată doar în ficat,
nu și în celulele sangvine (Herrick și McColl, 2005). Acest test este posibil întrucât en zima e
localizată în citosol și este astfel prezentă și în eritrocitele mature. Deși posibilele mutații în exonul
2 (eliminat prin splicing alternativ în forma eritrocitară a enzimei) induc rezultate fals negative și
degradarea proteinei până la efectuarea testului poate induce rezultate fals pozitive, atunci când
este folosită în corelație cu testele de urină, metoda poate identifica PAI în aproape 80% din cazuri
(Bissell și Wang, 2015).
Întrucât majoritatea purtătorilor de mutații nu prezintă simptome și efecte biochimice ale
acestora, analiza ADN este metoda cea mai sigură de diagnostic (Bissell și Wang, 2015).

17
Pentru testarea PV se recomandă înainte de analiza genică o analiză a plasmei, aceasta
prezentând un maxim de fluorescență la 626 -628 nm, ca urma re a nivelelor mari de porfirine
circulante (Lin și colab, 2011). Analiza urinei este ineficientă întrucât nivelele de ALA, PBG și
uroporfirină sunt doar puțin crescute față de normal (Siegesmund și colab, 2010).
CPE este asociată cu cantități mari de cop roporfirină în urină și fecale, dar în timpul
atacurilor și concentrațiile de ALA și PBG din urină sunt crescute (Siegesmund și colab, 2010).
Diagnosticul diferențial al tipurilor de porfirie acută (fără analiză genică) se realizează prin
dozarea nivelulu i de porfirine din scaun, plasmă și urină. În cazul PAI nu se observă intermediari
în materiile fecale, dar acestea sunt foarte prevalenți în PV și CPE. PAI prezintă însă nivele mari
de ALA și PBG în urină. Diferențierea dintre PV și CPE se face prin teste le din plasmă (Fig 4) (Lin
și colab, 2011).

Figură 4: Schemă de diagnostic diferențial pentru tipurile de porfirie acută, figură adaptată după Besur și
colab, 2015.

18
2.1.7.2. Controlul bolii
Cea mai eficientă metodă de control a porfiriilor acute este prevenirea atacurilor prin
evitarea agenților declanșatori, dar și menținerea unei diete bogate în calorii și carbohidrați, glucoza
funcționând ca un inhibitor al ALAS. Profilaxia împotriva atacu rilor este esențială, întrucât acestea
determină degradarea axonală a neuronilor, iar refacerea funcționalității acestora este lentă, chiar
și după încetarea atacului (Gorchein, 1997).
Pentru a ameliora atacurile acute se recomandă administrarea de carboh idrați, deși trebuie
luate considerare concentrația de sodiu din sânge și glicemia. Monitorizarea concentrației de sodiu
este importantă întrucât se poate instala hiponatremia dacă se diluează prea mult sângele (Harper
și Sardh, 2014). Hiponatremia poate c onduce la convulsii, astfel se recomandă evitarea
hiperhidratării. Un tratament eficient al atacurilor este hem -ul, acesta reducând nivelele de ALA și
PBG circulante și urinare prin refacerea rezervei ficatului. Împreună cu hem -ul, s-a demonstrat
eficiența administrării inhibitorilor de hem oxigenază (Gorchein, 1997; Lin și colab, 2011).
Administrarea de hem în timpul unui atac acut determină și creșterea nivelului de hem intracelular
în hepatocite, inhibând astfel sinteza și activitatea ALAS 1 (Bissell și Wang, 2015).
Doar un număr scăzut de pacienți au nevoie de administrări profilactice de hem, de obicei
o dată sau de două ori pe săptămână. Medicamenetele folosite cel mai uzual sunt Panhematic
(hidroxi -hem) și Normosang (arginat de hem), însă în cazul ut ilizărilor repetate poate apărea un
fenomen de rezistență în care efectele benefice scad și cele adverse cresc. Printre efectele adverse
se numără umflături, durere, sângerări ușoare ale gingiilor, creștere rapidă în greutate, urinare rară
sau absentă (Wan g și colab, 2018).
Pentru controlul PV se recomandă suplimentarea dietei cu vitaminele C și E, aportul crescut
fiind capabil să reducă din leziunile oxidative ce apar în plasmă și neutrofile (Wang și colab, 2018).
În urma transplantului de ficat s -a obse rvat o îmbunătățire a calității vieții la pacienții cu
forme severe de PAI, argument pentru neurotoxicitatea indusă la nivel hepatic de acumularea
precursorilor de hem (Puy și colab, 2010; Balwani și Desnick, 2012). Totuși, la pacienții cu
insuficiență hep atică severă în care a fost transplantat ficatul bolnavilor de porfirie s -a semnalat o
ameliorare a funcției ficatului, dar și o predispunere la atacuri acute de porfirie (Balwani și Desnick,
2012).

19
Se presupune că ar putea fi eficientă și terapia genică , ce presupune introducere de gene
funcționale pentru HMBS în hepatocite. Testele cu această abordare făcute pe șoareci au un efect
neuroprotector, prevenind distrugerea axonilor și anomaliile neurofiziologice (Lin și colab, 2011).
O altă posibilitate de tratare a PAI este utilizarea terapiei cu ARNsi specifici pentru ALAS
1. ARNsi este conjugat cu o grupare de N -acetil galactozamină pentru a fi specific pentru
hepatocite. Studii pe șoareci au arătat eficacitatea acestei abordări de tratament, iar studiile clinice
pe oameni sunt încă în faza 1. După o singură injecție subcutanată de ARNsi s -a reportat o scădere
a nivelului proteic de ALAS 1 după 24 de ore, scădere ce a persistat timp de o lună Fig (5) (Bissell
și colab, 2017).

Figură 5: Silențierea ARNm pentru ALAS 1 prin intermediul ARNsi. Molecule de ARNdc sintetic, specfice
pentru ARNm al ALAS 1 pot fi preluate de hepatocite prin intermediul unei grupări auxiliare care se va lega de
receptorii pentru galactoză. Complexul este endocitat, iar molecula de ARNsi este prelucrată de o proteină Dicer și
încorporată în RISC. RISC induce interferența ARN prin degradarea moleculei de ARNm a ALAS 1. Figură adaptată
după Bissell și colab, 2017.

20
2.2. Implicarea canalelor TRP în percepția durerii
2.2.1. Caracteristici generale ale canalelor TRP
Canalele Transient Receptor Potential (TRP) au fost observate pentru prima oară într -o
tulpină mutantă de Drosophila melanogaster . În acele organisme, un canal permeabil pentru ioni
de Na+ și Ca2+ nu funcționa cor espunzător, astfel inducând potențiale de receptor tranziente, nu
suținute, ale unor fotoreceptori. Proteinele superfamiliei TRP sunt canale ionice localizate în
membrana plasmatică sau în membranele unor organite celulare și sunt implicate într -o multitud ine
de funcții celulare, inclusiv homeostazia Ca2+ și Mg2+ (Jardin și colab, 2017). Proteinele funcționale
sunt exclusiv tetrameri, iar structurile pot fi homotetrameri sau heterotetrameri (Akopian, 2011).
Activitatea lor modulează activitatea celulară pri n influxul de cationi. Acest fapt duce la
depolarizarea membranei, deschiderea canalelor dependente de voltaj, contracția mușchilor netezi,
cât și control al modificărilor translaționale și post translaționale (Benemei și colab, 2015). Alte
efecte posibile ale influxului de Ca2+ sunt proliferarea celulară, apoptoza, transcrierea și eliberarea
de neurotransmițători, însă nu toate canalele TRP sunt permeabile pentru ionii de Ca2+ (Giorgi și
colab, 2019).
Superfamilia TRP include mai multe familii, acestea fi ind: TRPC (familia
clasică/canonică), TRPV (familia vaniloidă), TRPM (familia melastatinei), TRPP (familia
policistinei), TRPML (familia mucolipinei), TRPA (familia ankirinei) (Hung și Tan, 2018).
Superfamilia este conservată pe linie evolutivă, întrucât p roteinele sunt senzori importanți pentru
diferiți stimuli mecanici și chimici. Canalele sunt neselective, permit în principal trecerea ionilor
de Ca2+, dar este posibilă și trecrea Na+ sau K+ (Giorgi și colab, 2019). Canalele omoloage cu
TRPV1 sunt esenția le în activitatea nevertebratelor, întrucât mediază traducerea stimulilor
mecanici, osmotici și termici din mediu. Prima astfel de proteină, OSM -9, a fo st identificată în C.
elegans, este exprimată în neuronii ciliați și este necesară pentru traducerea ati ngerii nasului și
detectarea soluțiilor hiperosmotice. În D. melanogaster, proteina omoloagă este denumită
Nanchung (Nan) și este implicată în traducerea stimulilor mecanici (Kim și colab, 2003). În cazul
mamiferelor, TRPV1 este activat de căldură și prot oni, deschiderea acestuia ducând la formarea
unui potențial de acțiune în neuroni, consecință a influxului cationilor (Marwaha și colab, 2016).
Toate canalele TRP sunt alcătuite din 6 domenii transmembranare (S1 -S6) cu structuri
secundare de α helix. Bucl a P dintre segmentele S5 și S6 formează porul pe unde ionii pot traversa

21
membrana plasmatică. Domeniile amino și carboxil terminale sunt localizate în citosol și sunt
variabile în funcție de familie. În cazul TRPM și TRPV sunt importante pentru formarea
complexelor homomere sau heteromere, dar și pentru interacția cu senzorul de Ca2+, și anume
STIM1, din reticulul endoplasmic. A fost raportată existența unor domenii cu funcții specifice, atât
TRPM8 cât și TRPV1 având un domeniu sensibil la voltaj, TRPV1 prezentând și un domeniu de
legare la tubulină (Jardin și colab, 2017). TRPA1 prez intă o regiune amino terminală mai amplă
decât celelalte canale, conținând 16 repetări ankirinice (Marwaha și colab, 2016). Acestea conferă
proteinei o anumită elasticitate specifică și îi permite interacțiunea cu alte proteine, în special cele
asociate ci toscheletului (Jardin și colab, 2017).
2.2.2. Expresie și distribuție
Principalii nociceptori sunt fibrele C nemielinizate, ce transmit semnalele cu aproximativ
0.8m/s și fibrele Aδ, mielinizate, ce transmit impulsurile nervoase cu aproximativ 12m/s (Ka mbiz
și colab, 2014). Aproximativ 30, până la 50% din neuronii din ganglionii rădăcinilor dorsale ale
măduvei spinării (DRG) exprimă TRPV1, majoritatea fiind fibre C nemielinizate. A fost raportată
și expresia TRPV1 în fibrele Aδ, însă în mai mică masură. Coexpresia TRPA1 și TRPV1 este de
obicei întâlnită în nociceptorii de diametru mic (Dai, 2015). TRPV1 este exprimat în toți neuronii
în care este exprimat TRPA1, iar TRPA1 se găsește în aproximativ 30% din neuronii în care este
exprimat TRPV1 (Jardin și co lab, 2017). TRPV1 este prezent nu doar pe membrana plasmatică a
celulelor, cât și în membrana reticulului endoplasmic, sensibilitatea acestuia la agoniști fiind însă
mult mai mică (Jardin și colab, 2017).
TRPV1 este exprimat în neuroni cu soma în DRG care au terminații ce inervează colonul,
pancreasul, stomacul, duodenul și vezica urinară (Moore și colab, 2017). Pe lângă expresia din
DRG, TRPV1 se găsește și în cortexul cerebral, hipocamp, talamus, trunchiul cerebral, anumite
celule din sânge, fibroblaste ș i epiderma pielii (Akopian, 2011). A fost semnalată prezența TRPV1
și în neuronii măduvei spinării, în laminele I și II ale zonei superficiale ale coarnelor dorsale.
Acestea sunt activate de neuronii primari aferenți, fapt ce determină eliberarea de glutam at și
transmiterea sinaptică excitatorie către cornul dorsal (Marwaha și colab, 2016). TRPV1 exprimat
în keratinocite are rolul de activa prin influxul ionilor Ca2+ o cale de semnalizare ce se finalizează
prin eliberarea de adenozin trifosfat (ATP). ATP se leagă ulterior la receptorii P2X3 din fibrele Aδ
și C. Întrucât keratinocitele exprimă la rândul lor P2X3, transmiterea mediată de ATP poate fi

22
realizată paracrin și autocrin, amplificând astfel semnalul termic tradus inițial de TRPV1 (Kambiz
și colab, 20 14).
În afară de DRG și ganglionii trigeminali (TG), TRPA1 este exprimat în urechea internă și
piele (Akopian, 2011), dar și în ganglionii nodoși și jugulari ai nervului vag (Moore și colab, 2017).
În afara coexpresiei TRPV1 și TRPA1 în neuronii senzitivi, aceasta apare și în celelalte țesuturi
(Akopian, 2011). Deși prezența TRPA1 și TRPV1 a fost raportată în diverse țesuturi,
funcționalitatea acestora nu a fost demonstrată în toate cazurile (Fernandes și colab, 2012). În
celulele care exprimă TRPV1 se găse sc alți mediatori ai durerii, și anume substanța P și peptida
asociată genei calcitoninei ( Calcitonin gene -related peptide -CGRP), care pot fi eliberate în urma
activării TRPV1 (Giorgi și colab, 2019). Activarea mediată de acroleină și ozon a TRPA1 induce
aritmie în șobolani și șoareci, cel mai probabil prin intermediul controlului autonom al nervului
vag asupra funcției cardiace (Moore și colab, 2017).
TRPM8 este exprimat în DRG și ganglionii trigeminali, în neuronii cu diametru mic, dar
nu în cei care exp rimă și TRPV1 (Dai, 2015). De asemenea, s -a observat o preferință pentru nervii
senzitivi de diametru mic din DRG și TG (Moore și colab, 2017).
2.2.3. Farmacologia și modularea
2.2.3.1. TRPV1
TRPV1 este activat de temeperaturi mai mari de 43°C (Jardin și colab, 2017) și pH mai mic
de 5.9 (Marwaha și colab, 2016), canalul având și capacitatea de deschidere voltaj dependentă
(Basso și Altier, 2017). Printre agoniștii chimici se numără alicina, capsaicina și camforul, cât și
agoniști endogeni ca acidul 5 -hidroxiperoxid arahidonic. Activitatea TRPV1 poate fi și amplificată
de diferiți mediatori endogeni ai inflamației, cum ar fi bradikinina, ATP, factorul de creștere a
nervilor (NGF) (Hung și Tan, 2018). Activitatea TRPV1 este modulată de acești mediatori
inflamatori prin abilitatea acestora de a activa unele kinaze sau fosfataze. Calmodulina și AKAP
(A-kinase anchor proteins ) sunt de asemenea implicate în reglarea activității TRPV1 (Akopian,
2011). Senzitivitatea TRPV1 depinde de fosforilările mediate de protein kinaza A (PKA) și protein
kinaza C (PKC) (Marwaha și colab, 2016). Streptozotocina, un compus folosit pentru a crea modele
de studiu pentru diabetul de tip 1, are de asemenea capacitatea de a modula expresia și funcția

23
TRPV1 (Naziroglu și colab, 2012). TRPV1 poate fi activat de alcoolul etilic, un cunoscut agent
declanșator al migrenelor (Jardin și colab, 2017).
S-a observat că doze mari de capsaicină, agonist tipic al canalului, duc la distrugerea
selectivă a fibrelor C și Aδ, inhibând astfel complet activitatea nervilor respectivi (Fernandes și
colab, 2012). Deși TRPV1 este activat de o multitudine de stimuli fizici și chimici, este inhibat de
anumiți modulatori endogeni. Astfel s -a arătat că noradrenalina atenuează răspunsul la capsaicină
cu 60%. Mecanismul este mediat de receptorii adrenergici α2, ce inhibă stimulii nocivi ce ar fi
ajuns la coarnele dorsale ale mădu vei spinării (Jardin și colab, 2017).
Interesul pentru implicarea TRPV1 în diferite tipuri de durere este acela de a găsi
antagoniști, întrucât șoareci TRPV1 knock -out nu mai prezintă comportamente specifice la
aplicarea de stimulii termici acuți (Marwaha și colab, 2016).
2.2.3.2. TRPA1
TRPA1 este activat de compuși exogeni naturali, cum ar fi uleiul de muștar (alil
izotiocianat -AITC), wasabi, hreanul, cinamaldehida din scorțișoară, alicina din usturoi și dialil
disulfatul din ceapă. Diversitatea agoni știlor indică faptul că TRPA1 nu este un receptor
farmacologic tipic, ci un receptor ce detectează reactivitatea compușilor. Agoniștii pot fi electrofili
sau neelectrofili, iar cei electrofili funcționează prin modificarea unor resturi de cisteină din
dome niul amino terminal al proteinei. De curând s -au identificat și unele resturi de lizină ce ar
putea fi implicate în activarea canalului (Moore și colab, 2017). Mecanismul de activare determinat
de agoniștii neelectrofili nu a fost complet elucidat (Dai, 20 15). TRPA1 este implicat și in medierea
efectului toxic al unor metale, printre care se numără zincul, cadmiul și cuprul, acest fapt fiind încă
un argument pentru rolul său de detectarea a agenților nocivi din mediu (Moore și colab, 2017).
TRPA1 este act ivat de specii reactive de oxigen, acestea fiind un grup de agoniști electrofili
ce interacționează cu resturile de cisteină menționate anterior (Dai, 2015; Giorgi și colab, 2019).
Speciile reactive de oxigen rezultate din diferite cauze (leziunea țesuturi lor de exemplu) duc la
peroxidarea fosfolipidelor membranare și formarea de 4 -hidroxi -2-nonenal, agonist endogen al
TRPA1 (Hung și Tan, 2018). Canalul este de asemenea activat de temperaturi mai mici de 17°C
(Jardin și colab, 2017). S -a observat totuși că temperaturile scăzute promovează formarea speciilor
reactive de oxigen și eliberarea de calciu, activatori ai TRPA1. Curenții in vitro observați la

24
temperaturi scăzute sunt mai mici decât cei obținuți prin aplicarea agoniștilor, astfel s -a tras
concluzia c ă frigul doar amplifică funcția proteinei (Giorgi și colab, 2019).
În condiții obișnuite, TRPA1 uman poate fi hidroxilat la nivelul unui rest de prolină din
domeniul ankirinic din regiunea amino terminală. Dacă această hidroxilare este împiedicată de o
mutație sau de un inhibitor, sensibilitatea proteinei la peroxid de hidrogen în prezența frigului
crește. S -a demonstrat în cadrul aceluiași studiu că inhibarea directă a prolil hidroxilazei la șoareci
induce sensibilizarea TRPA1, acesta putând fi astfel ac tivat de speciile reactive de oxigen produse
de temperaturi scăzute (Moore și colab, 2017).
2.2.3.3. TRPM8
TRPM8 este activat de temperaturi mai mici de 25°C (Jardin și colab, 2017) și de agoniști
naturali ca eucaliptolul și mentolul. Activarea TRPM8 la frig și în prezența mentolului este realizată
doar în cazul asocierii cu PIP 2, compusul fiind și agonist al proteinei. Hipersensibilitatea canalului
poate fi mediată de nivelul de PIP 2, în funcție de activarea dependentă de calciu a fosfolipazei C,
ce hidrolizează moleculele de PIP 2 (Moore și colab, 2017). Metilglioxalul este un metabolit
intermediar ce apare în diabet și inhibă activitatea TRPM8, însă sunt necesare mai multe studii
pentru evaluarea exactă a mecanismului de inhibiție (Ciobanu și colab, 2016).
TRPM8 are activitatea modulată de fosfolipaza A2 independentă de calciu (iPLA2), enzimă
ce catalizează formarea de lizofosfolipide și acizi grași polinesaturați. Inhibarea iPLA2 reduce
curenții induși de TRPM8 în prezența temperaturilor scăzute, me ntolului și icilinei. Lizofosfatidil
colina, compus produs de activitatea iPLA2 poate activa TRPM8 și la temperaturi de 37°C. Acizii
grași polinesaturați (arahidonic, eicosapentanoic, docosahexanoic) sunt inhibitori ai TRPM8.
Coaplicarea lizofosfatidil col inei și a acizilor grași menționați anterior determină activarea TRPM8,
indicând impactul mai puternic al lizofosfolipidelor și implicarea produșilor iPLA2 în durerea
asociată frigului (Moore și colab, 2017).
2.2.3.4 . Interacții între diferite canale
Interacțiunea dintre TRPA1 și TRPV1 a fost observată prin mijloace farmacologice. Astfel,
aplicarea de AITC duce la desensibilizarea TRPV1 prin intermediul unei fosfataze dependente de
ioni de Ca2+, și anume calcineurina (Akopian, 2011). De altfel, TRPV1 s uferă desensibilizări după
expuneri prelungite sau repetate la capsaicină sau alți agoniști, dar induce și desensibilizarea

25
TRPA1. Mecanismele de desensibilizare omologă și heterologă sunt diferite, primul fiind
dependent de ionii de calciu, cel din urmă f iind independent de aceștia (Fernandes și colab, 2012).
Desensibilizarea TRPA1 poate fi determinată de aplicarea de capsaicină, întrucât influxul de calciu
determină activarea fosfolipazei C (PLC), ce scindează moleculele de PIP 2. Influxul de calciu ca
urmare a aplicării AITC induce activarea PLC doar în modelele de expresie heterologă, nu și în
neuroni senzitivi. Totuși, aplicări repetate de AITC duc la desensibilizarea TRPA1, fapt explicat
prin inducerea modificărilor determinate de interacția directă cu uleiul de muștar sau prin
determinarea internalizării canalului. S -a raportat că TRPV1 blochează internalizarea TRPA1
mediată de aplicarea de AITC (Akopian, 2011).
Nu există agoniști specifici pentru complexul heterotetramer TRPA1 -TRPV1, dar s -a
raportat că anumiți agoniști specifici pentru TRPA1, cum ar fi canabinoidul AM1241, induc o
activare la concentrații de 5 ori mai mici a TRPA1 când este coexprimat cu TRPV1 (Akopian,
2011).
2.2.4. Implicarea în nocicepție și diferite tipuri de durere
Durerea este răspunsul somatic sau visceral obținut în cazul contactului cu agenți nocivi
sau leziunii țesuturilor (Dai, 2015). Prin intermediul potențialelor de acțiune, stimulii din mediu
sunt traduși și transmiși măduvei spinării și ulterior ariilor superioare ale sistemului nervos central.
Nociceptorii au funcția de a transmite semnalele posibil dăunătoare prin fibrele nervoase primare.
În condiții normale, nociceptorii transmit potențiale de acțiune doar la contactul cu stimuli ce indică
posibile leziuni ale țesut urilor (Hung și Tan, 2018). Semnalele pot fi chimice, mecanice sau
termice, aceastea fiind detectate de canalele ionice din superfamilia TRP, în special TRPA1,
TRPV1 și TRPM8. Activarea canalelor duce la deschiderea acestora, influxul de Na+ și Ca2+,
depolarizarea membranei și inducerea de potențiale de acțiune mediate de alte canale dependente
de voltaj (Jardin și colab, 2017).
Nocicepția poate fi modulată prin nivelul de excitație al nociceptorilor sau prin propagarea
semnalului (Akopian, 2011). Noc iceptorii sunt clasificați pe baza tipului de axon pe care îl prezintă.
Astfel, există fibre, Aδ nemielinizate ce transmit senzațiile acute de durere și fibre C, activate de
stimuli mecanici, termici și chimici. Există de asemenea și fibre Aβ ce transmit s emnale inofensive
(nu indică o leziune sau un agent chimic dăunător) (Giorgi și colab, 2019).

26
Canalele TRPV1, TRPA1 și TRPM8 sunt implicate în semnalizarea durerii viscerale. S -a
arătat că silențierea TRPV1 prin mijloace de interferență ARN atenuează simp tomele acetui tip de
durere in vivo. Hipersensibilitatea viscerală ar putea fi mediată în cazul sindromului colonului
iritabil de exepresii scăzute ale moleculei de microARN miR -199, ceea ce induce supraexpresia
TRPV1 (Jardin și colab, 2017). TRPV1 este im plicat și în durerea rezultată din inflamarea cronică
gastrointestinală. În biopsii de la pacienți cu boli ce au în simptomatică inflamarea intestinului s -a
remarcat o expresie crescută a TRPV1, corelată cu severitatea hipersensibilității. Răspunsul la
capsaicină a TRPV1 a fost mult mai mare în animalele experimentale cărora le -a fost indusă colita.
Tratamentul cu antagoniști în modele pentru sindromul colonului iritabil au prevenit instalarea
hipersensibilității la șoareci adulți și au diminuat răspunsuril e dureroase la adulți deja sensibilizați.
S-a raportat că TRPV1 din nociceptorii aferenți primari are funcție și expresie crescute și în
pancreatita cronică, inducând hiperalgezie (Moore și colab, 2017).
În mod obișnuit, TRPV1 este implicat în transmiter ea durerii asociate proceselor
inflamatorii sau leziunilor țesuturilor (Akopian, 2011; Jardin și colab, 2017). S -a arătat că
antagoniștii pentru TRPV1 induc o atenuare a hiperalgeziei termice. TRPA1 mediază hiperalgezia
mecanică și termică (pentru temperat uri scăzute) în aceleași modele experimentale. S -a demonstrat
și faptul că TRPV1 este implicat și în durerea asociată cancerului osos, aceasta scăzând după
inactivarea farmacologică a canalului ionic sau silențierea genei asociate acestuia. Expresia
canalu lui și amplitudinea curenților mediați de TRPV1 din DRG sunt mult crescute în cazul acestei
maladii (Jardin și colab, 2017). S -a demonstrat că supraexpresia ARNm și a proteinei este
determinată de formaldehida endogenă, prin intermediul semnalizării protei n kinazei activate de
mitogen (MAPK) și fosfatidininozitol kinazei (Moore și colab, 2017). Într -un model experimental
pentru cancerul osos, administrarea intraperitoneală a unui antagonist al TRPV1 împreună cu
morfină a potențat efectul analgezic al morfin ei (Jardin și colab, 2017).
Blocarea activității TRPM8 in vivo prin ARNsi sau antagoniști, sau folosirea de animale
experimentale knock -out (TRPM8-/-) au demonstrat implicarea canalului în hiperalgezia la frig
(Basso și Altier, 2017).
Țintirea nocicepției la nivel periferic are ca avantaj faptul că sistemul nervos central nu va
fi afectat de posibilele analgezice utlizate (Akopian, 2011).

27
2.2.5 . Durerea asociată neuropatiei
Durerea neuropatică afectează aproximativ 10% din populație și scade semnificati v
calitatea vieții în pacienți. Aceasta este o condiție cronică ce poate apărea ca rezultat al terapiei
împortriva cancerului, leziunilor măduvei spinării sau ale nervilor, infecțiilor virale, sclerozei în
plăci și diabetului (Basso și Altier, 2017). Apare de obicei din cauza afectării sist emului nervos
somato -senzitiv, ce poate apărea și din cauza nevralgiei postherpetice și durerii asociate membrelor
amputate. Principalul fenomen ce induce durerea asociată neuropatiei este schimbarea
patofiziologică indusă neuronilor senzitivi primari și s emnalizarea defectuasă către sistemul nervos
central (Dai, 2015). Deși mecanismele durerii neuropatice încep să fie înțelese din ce în ce mai
bine, tratamentul este rezumat la analgezice clasice (Basso și Altier, 2017).
Durerea neuropatică poate apărea c a rezultat al creșterii concentrației locale de calciu la
locul leziunii sau în măduva spinării, creștere determinată de activitatea canalelor de calciu
dependente de voltaj sau a canalelor TRP, în special TRPA1 și TRPV1 (Fig 6). Când semnalul
asociat dure rii este transmis de la neuronii aferenți primari la sistemul nervos central, există
transmițători nociceptivi, cum ar fi substanța P, ce sunt exocitați din terminațiile centrale ale
neuronilor aferenți primari. Neurotransmițătorii modulează activitatea ca nalelor de calciu
dependente de voltaj. Hiperactivarea neuronilor aferenți primari poate duce la exocitoza mai
intensă a substanței P, astfel fiind creată o activare mai pronunțată a canalelor de calciu dependente
de voltaj din neuronii postsinaptici. Prin acest mecanism este indusă hiperexcitabilitatea
postsinaptică (Marwaha și colab, 2016).

28

Figură 6 : Reprezentare schematică a mecanismelor în care sunt implicate TRPA1 și TRPV1 pentru a induce
durerea neuropatică. În primul rând activarea canalelor duce l a creșterea concentrației ionilor de calciu, cât și eliberarea
acestora din reticulul endoplasmic (RE), fapt ce duce la eliberarea de neurotransmițători, producerea și eliberarea
substanței P și activarea PKA și PKC. Toate aceste efecte au ca și consecință instalarea durerii neuropatice. Activitatea
enzimatică a fosfolipazei A 2 (PLA 2) conduce la formarea de acid arahidonic (AA) ce poate fi transformat de
ciclooxigenază (COCS) în prostaglandine (PG) sau de lipooxigenază (LOX) în acid 5 -hidroperoxi arahidonic (5-
HPETE). Acesta din urmă poate activa direct TRPV1 sau poate fi convertit în leucotriene (LT). PG și LT contribuie la
intesitatea durerii neuropatice. Figură adaptată după Marwaha și colab, 2016
Există și o formă de neuropatie diabetică ce apare în caz ul paciențiilor afectați de diabet de
tip 1 sau 2. Aceasta este asociată cu reducerea conducției nervilor senzitivi și motori, dar și cu
schimbări structurale în nervii periferici, printre care degenerarea axonală, demielinizare și
microangiopatie. Neuropa tia implică hiperalgezie sau alodinie, observată în șobolani tratați cu
streptozotocină (compus ce induce modificări fiziologice asociate cu diabetul de tip 1) (Naziroglu
și colab, 2012). De asemenea, influxul de calciu prin canalele de tip TRP dependent d e stresul
oxidativ este important în instalarea durerii neuropatice diabetice (Marwaha și colab, 2016).
În urma leziunii nervilor intervin modificări în soma neuronilor din DRG. Factorul de
creștere a nervilor ( NGF ) secretat de celulele Schwann determină creșterea nivelului de ARNm

29
pentru diferite TRP. De asemenea, se observă și o creșterea a expresiei proteice a TRP în
terminațiile nervoase senzitive (Kambiz și colab, 2014). S -a observat că nivelul de expresie a
TRPV1, TRPA1 și TRPM8 scade în neuronul afe ctat (în urma leziunii axonului), însă TRPA1 și
TRPV1 au o expresie crescută în neuronii adiacenți. Mecanismul propus pentru acest efect este
eliberarea de factori de creștere și de neurotransmițători în zona din jurul neuronului distrus,
cauzând astfel și o creștere a excitabilității neuronilor din jur (Fig 7)(Dai, 2015).

Figură 7 : Implicarea canalelor TRP în durerea neuropatică și consecințele distrugerii neuronilor. În cazul în
care un nerv este lezat, acesta nu va mai funcționa corespunzător (vor apărea mai puține potențiale de acțiune).
Distrugerea neuronilor va determina eliber area de NGF și de alți factori neurotrofici ce conduc la supraexpresia
TRPA1, TRPV1 și TRPM8, dar și o frecvență mai mare a generării potențialelor de acțiune în neuroni apropiați. Acest
fenomen apare și în cazul neuropatiei induse de diabet sau chimiotera pie. Figură adaptată dupa Dai, 2015.
Durerea neuropatică poate apărea și în urma tratamentelor cu agenți chimioterapeutici, cum
ar fi oxaliplatina sau paclitaxelul. Șoareci tratați cu paclitaxel au fost studiați pentru a fi determinată
implicarea canalelo r TRP în hiperalgezia ter mică și alodinia mecanică (Fig 8 ) (Salat și Filipek,
2014). Paclitaxelul induce o activare a astrocitelor, ceea ce determină eliberarea citokinelor
inflamatorii precum factorul de necroză tumoral α (TNF -α), interleukina 1β și inter leukina 6.

30
Moleculele respective duc la sensibilizarea neuronilor nociceptivi și la inflamația neurogenică, ceea
ce conduce la durerea neuropatică periferică indusă (Ba și colab, 2018).

Figură 8 : Observarea dezvoltării hiperalgeziei la temperaturi scăzute în șoareci tratați cu paclitaxel,
comparativ cu animale control. Șoarecii au fost puși în apă la 4°C și s -a cronometrat perioada până a apărut un
comportament nocifensiv. A fost făcut un test îna inte de tratament și s -a observat același interval, însă timpul de reacție
a scăzut semnificativ după 2 ore, respectiv 7 zile în grupul tratat cu paclitaxel. Acest fapt demonstrează hiperalgezia
la frig indusă de tratamentul cu paclitaxel. Imagine adaptată după Salat și Filipek, 2014.
2.2.5 .1. Rolul TRPV1
Ligația de nerv spinal duce la o creștere a expresiei TRPV1 în DRG și crește rata de
activare a acestuia, ducând astfel la hiperalgezie termică (Fig 9). După lezarea nervului sciatic,
TRPV1 de la terminațiile centrale ale neuronilor aferenți primari este supraexprimat și promovează
eliberarea de CGRP și substanță P din terminațiile presinaptice centrale, rezultând în final la
durerea asociată neuropatiei. Administrarea de antagoniști induce amelior area durerii neuropatice
(Marwaha și colab, 2016). Inhibarea canalului ionic duce la scăderea durerii în modele pentru
durerea neuropatică, iar proteina este supraexprimată în animale cu nervii spinali ligaturați, fapt
corelat cu instalarea hiperalgeziei l a temperaturi crescute (Moore și colab, 2017).

31

Figură 9 : Implicarea canalelor TRP în diferite forme de durere neuropatică. În modelele de leziune ale
nervilor, expresia TRPV1 scade în neuronii direct lezați, dar crește în neuroni adiacenți. În modelele d iabetice, hipoxia
și hiperglicemia duc la activarea exagerată a TRPV1, cât și metil glioxalul la activarea exagerată a TRPA1. În
chimioterapia cu oxaliplatină sau paclitaxel se instalează hiperalgezia atât la temperaturi scăzute cât și crescute, dar și
hipersensibilitatea mecanică. Figură adaptată după Basso și colab, 2017.
Principala caracteristică a TRPV1 din nociceptorii din DRG este scăderea temperaturii prag
de activare după expunerea la molecule nociceptive (NGF, bradikinina, prostaglandina E2). Cel
mai bine înțeles rol al canalului ionic în contextul neuropatiei este în neuropatia diabetică.
Animalele diabetice prezintă două faze ale comportamentului asociat durerii. În primele stadii ale
maladiei este instalată hiperalgezia, ca poi aceasta să se tra nsforme în hipoalgezie. În timpul primei
faze s -a remarcat o creștere a expresiei TRPV1 în axonii neuronilor ce inervează pielea și în
neuronii din DRG. Supraexpresia a fost asociată cu curenți mai ampli înregistrați în neuroni din
DRG. Implicarea canalulu i a fost confirmată când silențierea genei sau blocarea farmacologică au
dus la ameliorarea durerii la șoareci. Mecanismul ce poate explica acest fapt implică hipoxia și
hiperglicemia asociate primei faze a diabetului (Basso și Altier, 2017). Expresia cana lului este de
asemenea afectată. Densitatea de exprimarea a TRPV1 scade în fibrele C și crește în fibrele A,
unde prezintă și o funcție amplificată, canale fiind fosforilate și relocate pe membrana plasmatică
(Marwaha și colab, 2016).

32
2.2.5 .2. Rolul TRPA1
În modelele de diabet și chimioterapie ale neuropatiei s -a demonstrat o creștere a nivelului
de ARNm și proteină în cazul TRPA1 în terminațiile periferice și centrale ale nociceptorilor (Giorgi
și colab, 2019). Astfel, TRPA1 a fost propus ca mediato r al hiperalgeziei mecanice și al alodiniei
la frig asociate neuropatiei (Jardin și colab, 2017). Prin studii ce au folosit microARN pentru
silențierea expresiei canalului ionic s -a remarcat îmbunătățirea simptomelor în șoareci (Giorgi și
colab, 2019).
Hipersensibilitatea mecanică ce apare în primele faze ale diabetului este ameliorată prin
blocarea TRPA1. În etapa târzie a diabetului poate fi observat faptul că activitatea TRPA1 induce
degenerarea fibrelor ce exprimă substanță P, inducând astfel alterări în simțul tactil, inhibarea
canalului ionic ducând la restituirea funcției. În diabet s -a observt creșterea concentrației de
metilglioxal, metabolit intermediar ce activează direct TRPA1 (Basso și Altier, 2017). Influxul
exagerat de ioni de calciu provocat de deschiderea canalului poate induce degenerarea periferică a
nervilor (Moore și colab, 2017).
Blocarea farmacologică a TRPA1 în modelele de durere neuropatică obținute prin lezarea
nervilor induce o ameliorare a alodiniei la frig. Același compus care b lochează proteina în aceste
modele (A -967079), nu induce și blocarea răspunsului la frig în animalele normale. În aceleași
modele, scăderea nivelului de expresie a canalului ionic din DRG prin intermediul unor
oligonucleotide antisens a indus atenuarea hip ersensibilității la frig (Basso și Altier, 2017). În
modelele cu nervii afectați apare și o hipersensibilitate mecanică, simptom ce poate fi îmbunătățit
prin aceleași mijloace, și anume inhibare farmacologică sau silențiere genică. De asemenea,
blocarea TR PA1 în neuropatia trigeminală a dus la scăderea nivelului de CGRP, substanță P și
TRPV1 (Giorgi și colab, 2019).
Acroleina este formată în unele modele de neuropatie și determină producerea de curenți
de calciu dependenți de TRPA1 în DRG, cât și supraexpr esia canalului ionic. Speciile reactive de
oxigen pot promova formarea acroleinei. Întrucât TRPA1 promovează exocitoza CGRP și
substanței P, mecanismele ce promovează expresia crescută a proteinei vor induce indirect și o
secreție crescută a mediatorilor. Prin intermediul CGRP și substanței P, nociceptorii ating un prag
de activare mai scăzut, instalându -se astfel inflamația neurogenică. Durerea poate fi ameliorată cu
ajutorul neutralizatorilor de acroleină sau inhibitorilor de TRPA1 (Giorgi și colab, 2019) .

33
Speciile reactive de oxigen și de azot sunt importante în dezvoltarea durerii neuropatice,
moleculele fiind agoniști cunoscuți ai TRPA1 (Jardin și colab, 2017). Durerea poate fi eliminată în
animale experimentale prin deleția genei pentru TRPA1, blocare a proteinei sau introducerea de
antioxidanți ca acidul α lipoic. În modelul de durere neuropatică bazat pe ligaturarea nervului safen
(saphenous nerve constriction ) s-a raportat o creștere a nivelului de ARNm pentru TRPA1 și D –
aminoacid oxidază (enzimă a c ăror produși secundari includ peroxidul de hidrogen) în DRG
(Giorgi și colab, 2019).
Alodinia la frig este un efect secundar des întâlnit al neuropatiei induse de compuși folosiți
în chimioterapie, iar TRPA1 se presupune că ar fi canalul ionic ce ar medi a acest efect (Moore și
colab, 2017). Proteina are o activitate amplificată în urma tratamentului cu agenți chimioterapeutici
precum paclitaxelul sau oxaliplatina (Basso și Altier, 2017). În animalele experimentale tratate cu
oxaliplatină se observă o sens ibilizare exclusiv a TRPA1, nu și a TRPV1 (se instalează doar
hipersensibilitatea la frig, nu și la căldură). S -a raportat că simptomele în modelele de studiu ale
neuropatiei rezultate în uma chimioterapiei sunt îmbunătățite după administrarea de glutation , un
agent reducător endogen. Molecula reduce secreția de CGRP și substanță P (compuși ce
promovează vasodilatarea și inflamația neurogenică), dar și scade numărul de macrofage și
monocite activate ce ar genera peroxid de hidrogen și ar activa TRPA1 (Giorg i și colab, 2019).
2.2.5 .3. Rolul TRPM8
TRPM8 are un rol dual în durerea neuropatică asociată leziunilor nervilor – în anumite
situații inhibarea canalului reduce durerea neuropatică, în timp ce în alte situații activarea cu
agoniști demonstrează propri etăți analgezice (Moore și colab, 2017). Pe de -o parte, blocarea
farmacologică sau silențierea genei au dus la reducerea hiperalgeziei la frig. Mai mult, în modelele
experimentale s -a raportat o supraexprimare a proteinei în DRG. Pe de altă parte, s -a demo nstrat
că activarea TRPM8 are proprietăți analgezice, inducând alinarea simptomelor de hiperalgezie
mecanică și termică în mai multe modele de durere neuropatică asociată leziunilor nervilor.
TRPM8 este hiperactivat în durerea neuropatică asociată chimiote rapiei. Acest fapt a fost
demonstrat in vitro – neuronii din DRG în cultură tratați cu oxaliplatină au prezentat răspunsuri mai
ample la temperaturi scăzute față de control. In vivo , s-a remarcat că blocarea canalului a dus la
ameliorarea simptomelor asocia te hipersensibilității la frig în șobolanii tratați cu oxaliplatină
(Basso și Altier, 2017).

34
Alte studii au raportat implicarea TRPM8 în alodinia la frig rezultată în urma leziunii
nervilor. Șobolani cu nervi afectați au prezentat reflexe mai puternice l a frigul indus de evaporarea
acetonei, dar și o creștere a numărului de neuroni ce exprimă TRPM8. Sensibilitatea la frig mediată
de TRPM8 este amplificată de factori neurotrofici, cum ar fi atemina și NGF. Aceștia își exercită
efectul prin intermediul unor receptori coexprimați cu canalul ionic (Moore și colab, 2017).

35
2.3. Interferența ARN mediată de ARN mic de interferență
2.3.1. Fenomenul de interferență ARN
Interferența ARN este un proces de reglare genică mediat de molecule de ARN, cum ar fi
ARN mic de interferență (ARNsi) (Nikam și Gore, 2018) sau micro ARN (miARN). Silențierea
este realizată post -transcripțional, după sinteza ARNm. A fost observată prima oară în 1990, în
petunii transgenice ce ar fi trebuit să aibe o culoare mai in tensă de violet, datorită unei gene
modificate pentru calcon sintază (chs) (Agrawal și colab, 2003). Gena modificată conținea
promotorul 35S de la virsului mozaic al conopidei, iar florile rezultate nu au avut culoarea urmărită
(violet mai închis decât flo rile obișnuite), ci diferite nuanțe de alb, roz, sau modele ce nu au fost
raportate anterior. Nivele de ARNm pentru chs au fost determinate atât în plante revertante, cât și
în cele transformate, pri n teste de protecție față de RN -aze. Cu ajutorul acestora s-a determinat un
nivel de ARNm de până la 50 de ori mai mic în organismele cu gena modificată (în care au fost
degradate și moleculele de ARNm rezultate din transcrierea genei normale). Fenomenul a fost
numit inițial co -supresie (Napoli și colab, 1990).
ARNsi face parte din familia ARN mici de silențiere , în care sunt incluse și micro ARN,
ARN ce interaționează cu PIWI (piARN) și altele . Caracteristicile definitorii ale acestei familii
sunt lungimea relativ scurtă (20 -30 de nucleotide) și interacția cu f amilia de proteine Argonaute
(Ago), pe care le pot ghida la molecule de ARNm pe care le degradează, alterând astfel expresia
genică. ARNsi derivă din ARN dubul catenar (ARNdc), prin clivarea mediată de o ribonuclează
specifică, Dicer. Prin clivare se forme ază duplexuri ARNsi de aproximativ 21 nuc leotide lungime,
în cadrul cărora o monocatenă mediază silențierea (catena ghid, antisens), iar cealaltă este
hidrolizată (catena pasager) (Ghildiyal și Zamore, 2009). ARNsi este cuplat cu Dicer, Ago2 și
Proteina d e legare la ARN a răspunsului transactivat (Transactivating Response RNA Binding
Protein -TRBP ) pentru a forma complexul de silențiere indus de ARN ( RNA induced silencing
complex -RISC). Ago2 hidrolizează catena pasager, după ce molecula ARNsi e ste desfăcută de un
domeniu N -helicazic al proteinei Dicer, astfel formându -se complexul RISC activat. Acesta se
poate lega la ARNm cu secvență complemetară cu cea a ARNsi, Ago2 având capacitatea de a cliva
molecula de ARNm (Nikam și Gore, 2018).
Pentru studi i in vitro și aplicații in vivo se poate folosi ARNsi sintetic ce mimează structurile
produse de proteina Dicer din ARNdc (Fig 1 0). Moleculele astfel formate prin sinteză pot acționa

36
direct în celule (Ho și colab, 2016). Moleculele sintetice prezintă efect e asemănătoare celor care ar
apărea dacă ar fi implicate molecule naturale . De asemenea, folosind ARNsi sintetizat în laborator
se poate obține fenomenul de interferență pentru gene ce s -au considerat imposibil de afectat prin
mijloace farmacologice (” undr uggable ”). Printre maladiile care se încearcă a fi tratate prin
folosirea ARNsi se numără sindromul ochiului uscat (gena pentru TRPV1), polipoza adenomatoasă
familială (CTNNB1), cancer pancreatic (KRAS) (Kanasty și colab, 2013) .
Când a fost descoperit procesul în Caenorhabditis elegans s-a presupus că ARNdc se poate
lega de an umite molecule de ARNm, oprind translația, idee ce a fost infirmată ulterior, prin
descoperirea RISC. De asemenea, pe C. elegans s-a demonstrat că interferența ARN poate fi
transmisă e reditar (Ghildiyal și Zamore, 2009) . Un avantaj al interferenței mediate de ARNsi este
faptul că acesta nu se integrează în geno m pentru a -și îndeplini funcția (Ho și colab, 2016) . De
asemenea, silențierea nu funcționează stoechiometric, experimente pe C. elegans au arătat că doar
2 molecule de ARNdc pot induce interferența unei gene exprimată abundent. (Agrawal și colab,
2003).

37
Figură 10 : Interferența ARN mediată de RISC . Interferența se fin alizează prin degradarea ARNm. Este
prezentat de asemenea modul în care sunt incluse in complexul de silențiere moleculele de ARN exogen sau ARNsi
sintetic. Moleculele de ARN exogen trebuie să fie inițial prelucrate de proteina Dicer Figură adaptată după Kanasty și
colab, 2013.
2.3.2. Structură ARNsi
În urma clivării moleculei de ARNdc prin acțiunea Dicer se formează molecule de ARNsi
ce prezintă la capetele 3 ’ câte două nucleotide neîmperecheate. (Kanasty și colab, 2013).
Moleculele sunt asemănătoare produșilor hidrolizei mediate de RN -aza III de la Escherich ia coli
(Agrawal și colab, 2003). Moleculele au 21 -25 nucleotide lungime (Nikam și Gore, 2018) și sunt
formate dintr -o catenă ghid antisens ce va media silențierea și o catenă pasager ce va fi ulterior
hidrolizată (Ghildiyal și Zamore, 2009). Moleculele de ARNsi pot fi identificate de proteinele
Ago2 prin intermediul capetelor 3 ’. De asemenea, RISC poate face distincția între ARNdc și
ADNdc, întruc ât AND dc are o conformație de tip B (helix de dreapta, 10 perechi de baze pe tur de
spiră, 20 Å diametru), pe c ând ARNdc are o conformație de tip A (un tur de spiră are 11 perechi
de baze, 23 Å diametru). Fosa majoră mai lată a conformației A este absolut necesară pentru
interacția stabilă dintre RISC și ARNm ce va fi degradat. (Alagia și Eritja, 2016)
După maturar ea RISC și hidroliza catenei pasager, Ago2 împarte catena ghid în 5 fragmente
funcționale: ancoră, seed, central, 3’ suplimentar ă, coadă (Fig 11). Situsul ancoră, primul nucleotid
al lanțului ghid, este asociat puternic cu domeniul MID al proteinei Ago2 și nu este implicat activ
în recunoașterea ARNm. Gruparea fosfat din 5’ e ste necesară pentru realizarea eficientă a funcțiilor
ARNsi, anume asocierea cu RISC și clivarea mediată de Ago2. S -a remarcat că există o preferință
pentru adenină și uracil, acestea neavând rol în recunoașterea ARNm ci în menținerea stabilității
complexului format între ARNm și Ago2. S -a observat de asemenea, că se pot induce modificări
asupra regiunii ancoră pentru sporirea randamentului silențierii, de exemplu înlocuirea primului
nucleotid cu un derivat triazolic. Regiunea seed (nucleotidele 2 -8) este responsabilă de asocierea
cu molecula țintă. Modificările făcute la nivelul acestei regiuni determină frecvența efectelor
nespecifice. Regiunea centrală și cea suplimentară sunt necesar e pentru rec unoașterea moleculei
ARNm țintă și există mai multe mecanisme prin care poate fi crescută specificitatea. Regiunea
coadă prezintă cele 2 nucleotide ce nu erau împerecheate cu cealaltă catenă a ARNsi și
interacționează cu domeniul PAZ al Ago2. I nteracțiunea e necesară pentru dezorganizarea
moleculei inițiale dublu catenare și hidroliza și eliminarea catenei pasager. Modificări la nivelul

38
acestei regiuni pot duce la silențieri de lungă durată, inducând o rezistență mai mare la acțiunea
nucleazelor . Aceste modificări au însă efecte remarcabile doar in vivo , eficiența in vitro fiind
determinată de timpul de dublare celulară.(Alagia și Eritja, 2016).

Figură 11 : Structura ARNsi în interacțiunea cu proteina Ago 2, figură adaptată după Alagia și Eritja , 2016.
2.3.3. ARNsi endogen
Inițial s -a observat prezența ARNsi endogen în plante, dar mai apoi s -a descoperit și în C.
elegans, Drosophila melanogaster și mamifere. În plante și C. elegans , ARNsi endogen este fo rmat
prin acțiunea ARN polimerazei ARN dependente proteină ce nu se găsește în genomul muștelor
sau mamiferelor. Primul element endogen ARNsi remarcat a corespuns elementului nuclear lung
interspersed L1, un retrotranspozon a cărui activitate a fost observa tă în celulele umane din cultură.
Elementul complet L1 conține promotori atât pe catena sens cât și pe cea antisens, facilitând astfel
transcrierea bidirecțională. Prin acest tip de transcriere se formează transcripți complementari ce
pot fi procesați de D icer pentru formarea de ARNsi. Nu se cunoaște însă mecanismul ce determină
formarea acestui transcript. Au fost observate molecule de ARNsi endogene în celule germinative
și somatice de D. melanogaster . Amestecuri de ARN scurte au fost imunoprecipitate și molecule
de ARNsi au fost distinse de miARN și ARN PIWI prin structură și prin faptul că nu au uracil ca
prim nucleotid. În tulpini de D. melanogaster mutante pentru dcr -2 și ago -2 s-a observat o creștere
a nivelului de ARNm transpozomal, sugerând existenț a unei căi endogene de interferență ARN ce
silențiază amplificarea acestor elemente mobile. ARNsi endogen în muște poate deriva din

39
transpozomi, regiuni intergenice, transcripți ARN lungi și ARNm. ARNsi endogen a fost observat
și în ovocitele de șoarece. Moleculele au tot o lungime de 21 nucleotide, sunt dependente de Dicer
și pot fi derivate din transcripți ai unor pseudogene ce pot forma structuri repetitive inversate sau
din gene codificatoare de proteine, anume cele ce se pot asocia cu pseudogene înrud ite. Este posibil
ca unele pseudogene să fie păstrate evolutiv pentru a putea regla expresia genelor din care au
derivat (Ghildiyal și Zamore, 2009).
Rolul presupus al interferenței ARN in vivo este cel de silențiere a genelor post -transcripție
(Agrawal și colab, 2003). Acest mecanism poate servi drept protecție împotriva infecțiilor virale,
genelor parazite sau străine, dar rolul său încă nu este pe deplin elucidat (Ghildiyal și Zamore,
2009).
2.3.4. Proteinele de clivare ale ARNdc, RISC și proteina Ago2
Procesul de interferență presupune clivarea unor molecule de ARNdc endogene sau
exogene în molecule mai mici ce vor determina în final degradarea unor molecule de ARNm. Acest
fapt este realizat în principal de proteinele Dicer. Endonucleazele sunt conser vate pe linie
evolutivă, au 4 tipuri de domenii disticte (domeniu helicazic, domenii RN -ază III, domeniu de
legare ARNdc și domeniu PAZ) (Agrawal și colab, 2003).
Mamiferele și C. elegans prezintă o singură ribonuclează Dicer, ce formează atât ARNsi
cât și microARN. În organsimul viermelui s -a identificat o proteină adițională, de legare la ARNdc
(RDE -4), proteină ce reglează activarea interferenței ARN. În D. melanogaster există două proteine
Dicer, DCR -1 și DCR -2. DCR -1 formează prin activitatea sa microARN, în timp ce DCR -2
formează ARNsi. Produșii DCR -2 interacționează cu Ago 2 și duc la clivarea ARNm. S -a remarcat
că genele dcr -2 și ago -2 de la Drosophila au o evoluție rapidă, fapt ce ar putea fi corelat cu funcția
biologică a mecanismelor de interferență (Ghildiyal și Zamore, 2009), aceea de a proteja
organismele de ADN paraziți, virusuri sau elemente genetice mobile (transpozomi și
retrotranspozomi) (Agrawal și colab, 2003).
Mai multe experimente au arătat că în D. melanogaster, in vivo , clivarea ARNdc în ARNsi
este dependentă de ATP. Activitatea în medii ce nu ofereau un aport suficient de energie era
încetinită de până la 6 ori. La oameni, clivarea ARNdc în ARNsi es te realizată în prezența ionilor
de Mg2+, fără consum de ATP (Agrawal și colab, 2003).

40
În cadrul celulelor umane au fost identificate 8 proteine din familia Argonaute, dintre ele
doar Ago2 având capacitatea de a cliva moleculele de ARNm. Datorită funcției sale, Ago2 are
domenii și structură înalt conservate. Domeniul MID interacționează cu primul nucleotid de la
capătul 5’ al catenei ghid ARNsi. Domeniul PIWI prezintă centrul catalitic activ ce determină
degradarea ARNm țintă. Domeniul PAZ este hidrofob și recunoaște capătul 3 ’ neîmperecheat al
catenei ghid. Lobul N este necesar pentru dezorganizarea ARNsi dublu catenar și maturarea RISC
(Alagia și Eritja, 2016). Proteina omoloagă Ago2 în C. elegans e RDE1, având domenii PAZ și
PIWI specifice ( Agrawal și co lab, 2003). În D. m elanogaster , proteina Ago 2 are o secvență diferită
de aminoacizi față de cea de la mamifere, neputând fi găsită o omologie (Ghildiyal și Zamore,
2009).
Complexul de silențiere indus de ARN este alcătuit din Dicer, Ago2, TRBP și molecul e de
ARNsi asociate complexului de încărcare a RISC. RISC poate prezenta și componente auxiliare,
cum ar fi proteine ce direcționează ARNm specific către zone unde va fi degradat. RISC se
maturează prin clivarea ARNsi dublu catenar (degradarea catenei pasa ger) și metilarea la capătul
3’. Metilarea este realizată de o proteină specifică, anume S -adenozil metiltransferaza metionin
dependentă. La plante, atât ARNsi cât si microARN sunt metilate pentru a li se asigura stabilitatea
(Ghildiyal și Zamore, 2009).
În D. melanogaster , identitatea monocatenelor de ARNsi este determinată de stabilitatea
termodinamică a capatelor 5 ’, determinată de proteina de legătură R2D2, proteină auxiliară a
complexului RISC (Ghildiyal și Zamore, 2009).
În celule se estimează că există o concentrație de 3 -5 nM RISC, deci mecanismele de
interferență ARN ar fi saturate la concentrații de 10 -100pM ARNsi. În cazul experimentelor cu
ARNsi transfectat, apare o competiție între acesta și moleculele miARN endogene pentru situsurile
RISC. Astfel, în cazul unei transfecții pot apărea creșteri în exprimarea genelor silențiate în mod
obișnuit de miARN (Alagia și colab, 2016).
Există posibilitatea transfecției stabile cu ARNsi, mai eficientă pentru celule de mamifere.
Astfel, ADN ce codifică b ulce scurte ARN ( short -hairpin RNA – shARN) este introdus în celule,
va fi integrat în genom și ARN polimerazele II sau III vor transcrie shARN ce va migra în
citoplasmă și va iniția interferența ARN, prin activitatea unei ribonucleaze Drosha (realizează
conversia shARN în ARNsi). ARNsi poate intra apoi în RISC pentru a opri expresia ARNm.

41
Atașarea ARNsi la regiunea 3 ’ netradusă a ARNm, cu ajutorul proteinelor Ago1, Ago3 și Ago4
poate duce la represia translației. Complementaritatea cu o regiune ce va fi tr adusă în aminoacizi
va duce la degradarea moleculei de ARNm mediată de Ago2 (Fig 12) (Fakhr și colab, 2016).

Figură 12 : Activarea mecanismului RISC de către ARNsi sau shARN ce este maturat ulterior în ARNsi.
Mecanismul RISC poate fi activat atât de ARNsi, cât și de shARN ce pot fi maturate în molecule de ARNsi. Se poate
realiza o transfecție stabilă cu ADN ce este transcris în shARN. Silențierea poate fi făcută prin clivarea ARNm, mediat
de Ago2, dacă ARNsi es te complementar cu o regiune ce va fi tradusă în aminoacizi. Cealată posibilitate e blocarea
translației, mediată de complexul Ago 1 -4, dacă există complementaritate cu regiuni necodificatoare din ARNm.
S-a reportat că mutații ale ARN polimerazei ARN dep endente afectează interferența ARN
în plante și C. elegans . Astfel, s -a presupus că ARN polimeraza ARN dependentă ar putea replica
molecule de ARNsi pentru a putea fi amplificate și transmise generațiilor următoare. S -a observat
și formarea de ARNsi specif ic pentru anumite ARNm, independent de ARNdc original. Interferența
astfel rezultată a fost denumită interferență tranzientă, dar fenomenul de amplificare ARNsi nu a
fost semnalat la mamifere sau D. melanogaster (Agrawal și colab, 2003).

42
2.3.5. Agenți de transfecție
S-a demonstrat că utilizarea ARNdc ce ar fi fost clivat este redundantă având în vedere că
procesul de interferență ARN se realizează prin intermediul ARNsi. Astfel, se caută mijloace cât
mai eficiente și specifice de transport a moleculelo r mici de ARN, atât pentru realizarea unui
potențial terapeutic, cât și pentru studii ale funcțiilor genelor in vitro .
Majoritatea sistemelor ARNsi pătrund în celule prin endocitoză. Veziculele pătrunse în
celule fuzionează cu endozomii, iar anumite sisteme de transport interacționează cu pH -ul scăzut
din cadrul endozomilor pentru a declanșa eliberarea ARNsi în citoplasmă (Kanasty și colab, 2013).
Optimizarea transportului ARNsi in vivo constă în asigurarea unei protecții eficiente împortriva
atacuril or enzimatice și facilitarea endocitozei nespecifice. Prin perfecționarea acestor paramatetri
se poate realiza o eficiență mai mare a trasnmiterii (Ho și colab, 2016).
În ceea ce privește internalizarea de acizi nucleici de către o celulă, procesul este d enumit
transducție dacă este mediat viral sau transfecție dacă nu este mediat de un virus. Prin metodele
prin care poate fi internalizat ADN pentru diferite terapii genice sau transformări, pot fi introduse
în celule și molecule de ARN, atât ARNm pentru ex presie proteică, cât și ARNsi pentru activarea
mecanismului de interferență ARN. Sistemele virale sunt mai costistitoare, astfel, în special in
vitro , se folosesc sistemele de transport nevirale (Damen și colab, 2018).
Cea mai mare provocare în utilizarea ARNsi este transportul până la celule și internalizarea
acestuia. Mai multe teste clinice au arătat că translocarea de ARNsi nud prin membrane celulare
nu este eficientă, așadar este importantă crearea de agenți de transport care să aducă moleculele de
ARN la locul dorit (Foged, 2012). Unele din problemele ce apar în utilizarea ARNsi nud sunt
potențialul imunogen și incapacitatea de a trece singur prin membranele celulare datorată
dimensiunii (20 -25 nucleotide) și hidrofilicității crescute (Kanasty și colab , 2013). Alte piedici sunt
omniprezența nucleazelor și rata mare de excreție (Foged, 2012).
Agenții de transport lipidici sunt eficienți deoarece facilitează trecerea prin bistratul
fosfolipidic al membranelor plasmatice. Întrucât moleculele de ARNsi au m ulte sarcini negative
datorită scheletului pentozo -fosfat, cele mai multe lipide folosite pentru transport sunt lipide
cationice ce pot interacționa cu sarcinile acidului nucleic. Complexul format între lipidele cationice
și ARNsi se numește lipoplex și es te un agregat stabil și heterogen. Eficacitatea crescută de

43
transport a lipidelor cationice este datorată capacității de complexare cu moleculele de acizi
ribonucleici mediată electrostatic (Foged, 2012).
Un alt avantaj al lipozomilor cationici este sarci na electrică globală pozitivă, ceea ce le
permite aderarea la proteoglicanii încărcați negativ de pe suprafața celulelor. Un exemplu ce s -a
demonstrat a fi eficient pentru transfecția ARNsi in vitro este lipidoid 98N 12-5 (Fig 13), un izomer
cu 5 cozi al trietilnetetramină -laurilaminopropionat. La aceste sisteme pot fi adăugate lipide cu
proprietăți fuzogene ce fac mai ușoară endocitoza, destabilizând membrana plasmatică a celulelor
țintă și fuzionând cu aceasta (Foged, 2012).

Figură 13 : Structură lipido id 98N 12-5, figură preluată din Ho și colab, 2016.
Mai pot fi folosite lipide anionice sau neutre, avantajul lor fiind timpul de retenție crescut
in vivo. Totuși, acestea prezintă dificultăți în încapsularea ARNsi, din cauza respulsiior
electrostatice. Lip ozomi neutrii compuși din dioleoil fosfatidil colină (DOPC) pot încapsula ARNsi
în raport de 10:1. Moleculele de ARNsi pot fi căptușite cu un polimer policationic ce va putea
interacționa cu lipozomi neutri sau anionici. De asemenea s -a demonstrat că utili zarea
stabilizatorilor ca polietilen glicolul, permite transportul specific către zonele din organism unde
țesutul endotelial este imperfect (cum ar fi în cazul tumorilor sau a procesului inflamator). Pentru
o specificitate și mai crescută in vivo se pot a tașa liganzi cum ar fi anticorpi, peptide, vitamine
(Foged, 2012). Există diferiți liganzi pentru receptori specifici și peptide în complexe cu alți
compuși ce pot pătrunde ușor în citoplasmă (Kanasty și colab, 2013).
Alte mijloace de transport pot fi poli merii, aceștia având o versatilitate foarte mare,
propritățile lor fizico -chimice putând fi ajustate pentru condițiile necesare și pentru eficiență
maximă. Prin intermediul scheletului pentozo -fosfat se pot forma poliplexe cu polimeri cationici.
Proprietăț i ce pot fi ajustate prin structura monomerilor sunt masa moleculară, densitatea sarcinilor
electrice, hidrofobicitatea, tipurile de substituenți la catena laterală, proporția de ARN/polimer din
cadrul poliplexului. Pentru transportul ARNsi se preferă poli meri ramificați cum ar fi dendrimerii
de poiamidoamină, polipropilenimine sau poli L lizină (Fig 14) (Ho și colab, 2016).

44

Figură 14 : Structura poli -L lizină -acid colic polietilen glicată. Poli -L lizina este modificată prin atașarea unui
acid colid hidrofob și a polietilen glicolului prin intermediul unui linker sensibil la pH acid. Polimerul poate forma
micele cationice alcătuite dintr -un miez hidrofob (ce permite încapsularea moleculelor insolubile în apă) și o suprafață
hidrofilă (ce permite compl exarea electrostatică cu acizii nucleici). Figură adaptată după Ho și colab, 2016.
O altă metodă de introducere a ARNsi în celule este electroporarea. Tehnica presupune
utilizarea de pulsuri electrice puternice pentru a forma pori hidrofili în membrana pla smatică pentru
perioade scurte de timp. Prin intermediul acestor pori pot fi preluate macromolecule hidrofile,
printre care și ARNsi. Electroporarea are o eficiență mai mare pentru celule în suspensie și pentru
alte tipuri de celule greu transfectabile. O problemă majoră a electroporării este mortalitatea mare
a celulelor, astfel încât pentru o bună eficiență, trebuie optimizați anumiți parametri cum ar fi
voltajul, numărul de pulsuri și durata pulsurilor (Han, 2018).
2.3.6. Optimizarea eficienței silenție rii și metode de măsurare a acesteia
Capacitatea de silențiere a unei molecule de ARNsi nu e ste determinată doar de secvența
de nucleotide cu care e ste complementară. Specificitatea este afectată de complementaritatea
parțială cu alte situsuri. De asemenea, pot apărea dificultăți în complexarea cu moleculele de
ARNm, care pot prezenta structuri secundare și terțiare. Pentru a se asigura o specificitate a proape
absolută, pot fi create molecule validate prin metode bioinformatice (Alagia și colab, 2016).

45
Introducerea ARNsi în celule poate determina în acestea efecte ce nu sunt neapărat un
rezultat al silențierii. Din acest motiv, cuantificarea eficienței silențierii este indicat să fie
determinată independent de efectul fenotipic al acesteia. (Borawski și colab, 2007). Din acest motiv
se caută sinteza de molecule ARNsi cu o specificitatea și un randament al silențierii cât mai mare,
pentru a afecta cât mai puțin mecanismele autonome ale celulelor (Alagia și colab, 2016).
Astfel se poate studia efectul interferenței asupra unor gene exogene, cum ar fi luciferaza
(pGL3) sau proteina fluorescentă verde (GFP). Prin măsurarea silențierii acestor gene raportor
supraexprimate se poate determina doar influența ARNsi, putând astfel fi optimizate metodele de
transfecție. Experimentele au fost făcute pe mai multe linii celulare în care s -a exprimat printr -un
vector viral (lentivirus) gena pentru luciferază. În urma tra nsfecției cu ARNsi mediată de lipide
s-a observat că diferite linii celulare preferă diferiți agenți de transfecție, aceștia neafectând
viabilitatea celulelor. Condițiile de transfecție folosite pentru silențierea luciferazei au fost folosite
ulterior și pentru silențierea unor gene endogene, obținându -se o reducere a nivelului de ARNm de
până la 70% (Borawski și colab, 2007).
Odată realizată transfecția, eficiența poate fi cuantificată atât prin Reacția de polimerizare
în lanț, cantitativă, cu revers t ranscriere, ( Reverse Transcription quantitative Polymerase Chain
Reaction RTq -PCR ), pentru a se calcula nivelul de ARNm, sau Western Blot, pentru a se evalua
expresia proteică, cât și funcțional. Abordarea prin RTq -PCR este utilă întrucât activitatea ARNsi
duce la degradarea moleculelor de ARNm. Se poate face diferențierea între un grup de celule
control și un grup de celule care au fost tratate cu ARNsi. Controlul negativ este realizat pentru a
distinge efectele specifice ale ARNsi asupra genei de interes, de efectele nespecifice date de
transfecție. Moleculele de ARNsi folosite în condiții control pot fi molecule cu aceeași compoziție
nucleotidică, dar care nu prezintă omologie pentru genomul uman sau pentru zona țintită din
genom. Moleculele de ARNsi astf el construite și folosite sunt denumite ARN Scrambled (Han,
2018).
În funcție de gena, respectiv proteina urmărită ar putea fi necesară și estimarea nivelului
proteinei exprimate prin Western Blot, întrucât există proteine ce au un timp de viață lung. În c adrul
acestor tipuri de modele, o examinare cu RTq -PCR ar indica o silențiere mai mare decât cea reală.
Tot dependent de gena urmărită și rolul ei pot fi urmărite și efecte funcționale ale silențierii, cum
ar fi nivelul de apoptoză, căile de semnalizare sa u rata diviziunii celulare (Han, 2018).

46
3. Materiale și metode
3.1. Reactivi și soluții utilizate
Soluția de incubarea a celulelor în cultură (Inc Mix) conține NaCl 155mM, K 2HPO 4
1.5mM, acid 4 -(2-hidroxietil) 1 -piperazineteil sulfonic (HEPES) 5.6 mM, Na -HEPES 4.8mM. La
acestea s -a adăugat glucoză și gentamicină (Sigma G -1272) pentru concentrații fi nale de 5mM,
respectiv 50µg/ml; pH -ul soluție i a fost ajustat la 7.2-7.4.
Mediul Nut Mix conține mediu Dulbeco ’s Modified Eagle ’s Medium (DMEM) F12 la care
s-a adăugat 1.5g bicarbonat de sodiu/L; pH -ul a fost ajustat la 7.4-7.5 la temperatura camerei, și
care s -au adăugat ser de cal 10% (Sigma) și gentamicină 50µg/mL.
Soluția de despri ndere a celulelor de substrat conține Tripsină (Sigma) 0.5mg/ml, acid
etilendiamintetraacetic (EDTA) 0.5mg/ml și Phenol Red 11µg/ml.
Tamponul fosfat salin (PBS) conține NaCl 137mM, KCl 2.7mM, NaH 2PO 4 10mM, K 2HPO 4
1.8mM.
Soluția R inger (extracelulară) cu glucoză conține NaCl 140mM, KCl 4mM, CaCl 2 2mM,
MgCl 2 1mM, HEPES 10mM, NaOH 4.54 mM la pH 7.4 la 25° C, la care s -a adăugat glucoză pentru
o concentrație finală 5mM.
Soluția de Calcium Green (Invitrogen) 2mM e preparată prin dizolvarea 50µg Calcium
Green în 19.3µL dimetil sufloxid (DMSO, Sigma), fiind păstrată în alicoturi de 1µL la 4° C.
Tamponul de liză RIPA 1% conține 0.1% dodecil sulfat de sodiu (SDS), NaCl 50mM,
Trisaminometan (Tris) 50mM, 2mM EDTA, 1% NP -40, 0.5% deoxicolat de sodiu (DOC) ; înainte
de folosire s-a adăugat Protease inhibitor cocktail de la Roche Diagnostics 1%, orto -vanadat 1mM,
acid iodacetic 5mM și fluorură de fenilmetansulfonil (PMSF) 1mM.
Tamponul de încărcare conține 250mM Tris -HCl la un pH de 6.8, 10% SDS, 0. 5%
bromfenol Blue, 50% g licerol și 500mM ditioeritriol (DTT).
Tamponul de migrare utilziat conține SDS 17.33mM, glicină 0.96M și Tris -bază 0.125M.
Tamponul de transfer conține Tris -bază 0.25M și glicină 1.9M la pH 8.3.

47
TBST conține soluție salină tamponată de Tris (TBS) și soluție Tween -20. TBS conține
50mM Tris și 0.15M NaCl la pH 7.5.
3.2. Mod de lucru
3.2.1.Cultură primară de neuroni din ga nglionii spinali de la șobolan
Pentru realizarea culturilor de neuroni au fost utilizați șobolani masculi adulți (150 -200 g)
din rasa Wistar , care au fost sacrificați prin sufocare cu dioxid de carbon 100%, timp de 2 minute,
după care a fost decapitați. Ganglionii spinali au fost extrași și au fost stocați într -un vas Petri de
35 mm diametru în Inc Mix (vezi 3.1. Reactivi și soluții utilziate).
Pentru disocierea neronilor s -a făcut un tratament enzimatic cu colagenază (extrasă de la
Clostridium histolyticum , Sigma) 2mg/ml și dispază (Gibco) 3mg/ml dizolvate în Inc Mix, timp de
o oră, la 37° C. După disocierea enzimatică, neuronii au f ost preluați cu o pipetă Pasteur și puși în
1mL Nut Mix. Masa celulară a fost triturată cu ajutorul unei pipete Pasteur, după care s -a adăugat
Nut Mix până la un volum final de 5 ml. Tubul a fost pus la centrifugat la 800xg, 10 minute la
temperatura camere i. Peletul a fost resuspendat în 1mL Nut Mix, după care au fost pipetați câte
500µL în vase Petri de 35mm tratate cu poli -D-lizină 0.1mg/mL (Sigma), timp de 30 de minute.
După ce au fost puse celulele, vasele au fost incubate o oră la 37° C, 5% CO 2 pentru a se asigura
aderarea. Du pă incubare s -a adăugat aproximativ 2mL Nut Mix și neuronii au fost ținuți în
incubator minim 3 ore înainte de transfecție.
3.2.2. Silențierea genei pentru p orfobilinogen deaminază (PBGD)
Pentru transfecția cu ARN de silențiere (AR Nsi) și ARN scrambled (ARN cu același raport
al nucleotidelor componente dar care nu prezintă complementaritatea specifică pentru ARNm țintă)
s-a folosit kit -ul Dharma FECT transfection de la GE Healthcare Dharmacon. Concentrația finală
a ARNsi și ARN scra mbled a fost de 25nmoli/volum final .Au fost preparate câte 10µl de ARNsi
și ARN scrambled de concentrații 5µM. Pentru vase cu suprafața de 9cm2 s-au pregătit câte două
tuburi, în primul s -au omogenitzat 10µL ARNsi, respectiv ARN scrambl ed, 5µM, cu 190µL mediu
fără ser (pus la dispoziție de kit), în al doilea s -au pipetat 5µL Dharmafect (agent de trasnfecție
lipidic) și 195µL mediu fără ser. După pipetări, tuburile au fost lăsate 5 minute la temperatura
camerei, după care conținutul primului tub a fost turnat în cel de -al doilea și amestecul a fost lăsat
timp de 20 de minute la temperatura camerei. În timpul incubării amestecului de tranfecție a fost

48
sucționat mediul din vasele cu neuroni și înlocuit cu 1.6mL mediu proaspăt Nut Mix cu factor de
creștere neuronal (NGF) 50 mg/ml. Amestecurile de transfecție au fost adăugate peste neuroni, iar
vasele au fost păstrate în i ncubator la 37° C. După 24 de ore s -a sucționat mediul cu ARNsi,
respectiv ARN scrambled și s -a adăugat aproximativ 2ml de mediu Nut Mix cu NGF. După încă
48 de ore, neuronii au fost tratați cu 500µL tripsină (vezi 3.1. Reactivi și soluții utilizate ) timp de
3 minute pentru a se desprinde de pe vasele pe care au aderat. Suspensia rezultată a fost amestecată
cu aproximativ 500µL Nut Mix după care a fost pusă la centrifugat 5 minute, 1000 RPM, la
temperatura camerei. Peletul s -a resupendat în 200µL Nut Mix. Din cei 200 µL suspensie au fost
plasați câte 20 de µL pe 4 lamele de sticlă (grosime 0.17mm, diametru 25mm) tratate în prealabil
cu poli -D-lizină 0.1mg/mL timp de 30 de minute. Vasele au fost ținute o oră la 37° C, după care s –
a adăugat aproximativ 2mL Nu t Mix cu NGF și au mai fost incubate înca o oră. Restul de suspensie
de neuroni a fost păstrată pentru analiza exprimării proteice prin tehnica Western blot, pentru
evidențierea silențierii. Suspensia a fost pusă la centrifugat 5 minute, 1000RPM, la temper atura
camerei, iar peletul a fost resuspendat în 200µL PBS (vezi 3.1. Reactivi și soluții utilizate ), pentru
spălare. Suspensia a fost centrifugată din nou în aceleași condiții, după care supernatantul a fost
sucționat, iar peletul înghețat la -80° C.
3.2.3. Imagistică de calciu pentru observarea activității canalelor TRPA1, TRPV1 și
TRPM8
Imagistica de calciu este o tehnică bazată pe capacitatea unor molecule de a emite
fluorescență la contactul cu ioni de calciu. Primii compuși de acest tip au fost sintet izați la începutul
anilor 80, până atunci fiind folosiți microelectrozi sau Aeqorina, o fotoproteină activată de calciu
de la meduze. Metodele vechi nu puteau fi folosite cu ușurință pentru toate celulele mamiferelor.
Propritetățile noilor compuși sunt baz ate pe capacitatea de chelator de ioni de Ca2+ a acidului
egtazic (EGTA). Proprietatea tuturor indicatorilor este faptul că legarea ionilor de calciu determină
o schimbare a lungimii de undă în care este emisă fluorescența. Compușii sunt de două tipuri,
primul tip prezintă exictare la lungimi de undă din domeniul ultraviolet (330 -380 nm), iar cel de –
al doilea fiind excitat de lumină la lungimi de undă din domeniul vizibil (450nm sau mai mult).
Introducerea indicatorilor în celule presupune creșterea lipofil icității lor, întrucâ sunt molecule
hidrofile. Lipofilicitatea este crescută prin esterificarea de acetoximetil la grupările carboxil din
structura sa. Gruprările esterificate sunt hidrolizate de esteraze ce se găsesc în celulele în celulele

49
încărcate (Lam bert și Rainbow, 2013). Indicatorul folosit în experimentele realizate pentru această
lucrare (Calcium Green -1) este de tipul 2.
Pentru a se realiza imagistica de calciu s -a folosit un amestec de conține soluție Ringer (vezi
3.1. Reactivi și s oluții utiliz ate), Calcium Green -1 AM 2µM (indicator fluorescent de calciu, neutru
din punct de vedere electric, care difuzează prin membrana plasmatică) (Invitrogen) și Pluronic F –
123 0.02% (facilitează difuzia indicatorului fluorescent, având rol de surfactant) (Invi trogen).
Amestecul a fost pipetat peste neuronii aderați pe lamelele de sticlă, după ce a fost aruncat mediul
în care au fost incubați și s -a efectuat o spălare cu 1mL Ringer cu glucoză 5mM. Vasul a fost
incubat 30 de minute, după care s -a efectuat încă o spălare cu 1mL ringer cu glucoză, iar după încă
30 de minute a putut fi făcută înregistrarea.
Pentru înregistrare lamelele cu neuroni au fost montate într -o cameră de teflon (MSC TD,
Digimeter, Welwyn Garden, UK) pe masa unui microscop inversat Olympus IX 70. Neuronii au
fost iluminați de un LED albastru ce emite la 470nm, controlat de Dual OptoLED (Cairn Resea rch,
Faversham, UK). Semnalele de fluorescență s -au înregistrat cu ajutorul unei camere CCD (Cohu
4910; Pieper GmbH, Schwerte, Germania) controlată d e programul Axon Imaging Workbench 2.2
(Axon Instruments, Union, CA), program ce a fost folosit și pentru obținerea imaginilor și analiza
acestora.
Experimentele de imagistică de calciu au fost realizate pentru a observa modificările induse
în urma silenț ierii enzimeri PBGD asupra canalelor ionice din familia TRP, din neuroni. Protocolul
a constat în aplicarea de WS -12 5µM, (Sigma) (30 sec), alil izotiocianat 50µM (AITC, Fluka) (1
min), capsaicină 100nM (Cap, Sigma) (30 sec) și KCl (soluție Ringer fără glu coză cu KCl 50mM).
Capsaicina a fost folosită pentru a putea fi selectați neuronii ce exprimă TRPV1, AITC pentru
neuronii ce exprimă TRPA1, WS -12 pentru neuronii ce exprimă TRPM8. KCl a fost folosit pentru
a se distinge neuronii de cel elalte celule ce au proliferat în timpul incubărilor. Agoniștii au fost
aplicați la intervale de câte 3 minute, între aplicări celulele fiind tratate cu soluție Ringer.
Variațiile nivelului de calciu intracelular indicate de fluorescență au fost analizate cu
ajutorul unui Mac ro Excel urmărindu -se raportul între variația maxim ă de fluorescență în timpul
stimulului și fluorescența inițială (ΔF/F 0). ΔF reprezintă diferența dintre fluorescența maximă
observată pe parcursul aplicării unui agonist (F max), iar F 0 reprezintă fluoresce nța bazală a
respectivului neuron. Valorile raportului mai mari de 0.1 au fost considerate drept răspuns. De

50
asemenea a fost calculată și aria de sub grafic (A.U.C.) pentru fiecare stimul, indicator al influxului
total de calciu în celule. Pentru prelucrar ea și reprezentarea răspunsurilor neuronilor obținute în
urma aplicării substanțelor din protocolul experimental a fost utilizat programul Origin 8
(OriginLab Corporation, Northhampton, MA, USA).
3.2.4. Western blot pentru evidențierea silențierii genei PB GD
Western blot este o tehnică de biologie moleculară prin care se poate evalua prezența dar si
cantitatea unei proteine specifice dintr -un amestec. Tehnica presupune 3 pași. În primul rând,
ames tecul proteic trebuie supus electroforezi pentru a se asig ura separarea în funcție de masa
moleculară. În al doilea rând, proteinele migrate trebuie transferate pe un suport solid. În ultimul
rând, odată ajunse pe suportul solid, proteinele de interes pot fi marcate și vizualizate cu ajutorul
unor anticorpi. Anticor pul ce se leagă direct de proteina de interes se numește anticorp primar, iar
anticorpul ce permite analiza calitativă și cantitativă se numește anticorp secundar. Probele cel mai
des folosite sunt lizatele celulare, însă e ste nevoie de păstrarea lor pe gh eață și adăugarea unor
inhibitori de proteaze pentru a se asigura menținerea integrității acestora. De asemenea se
recomandă încărcarea în gelul de electroforeză probe a le căror concentrație proteică este cunoscută
pentru a se asigura compararea exactă a acestora (Mahmood și Yang, 2012) .
Gelul de poliacrilamidă folosit are două componente, un gel de concentrare și un gel de
migrare. Gelul de concentrare e mai poros, fapt ce permite formarea unui front subțire de migrare,
ce poate apoi fi separat în al doilea fragment al gelului. Proteinele au fost denaturate termic înainte
de încărcare, astfel încât migrarea lor să fie influențată doar de masa moleculară. Tamponul asigură
încărca rea negativă uniformă, și deci migrarea spre catod (Mahmood și Yang, 2012) .
Membrana pe care se realizează transferul poate fi de fluoro poliviniliden (PVDF ) sau de
nitroceluloză. Membranele de nitroceluloză au o afinitate mai mare pentru proteine, în să se pot
rupe ușor și nu pot fi păstrate pentru analize ulterioare. Blocarea membranei împiedică legarea
nespecifică a anticorpilor și poate fi realizată cu lapte 5% sau cu albumină serică bovină (BSA).
Preferința pentru soluțiile de blocare este determin ată de tipul de detecție (de exemplu,
fosfoproteinele nu pot fi determinate pe membrane blocate cu lapte, întrucât cazeina, proteină
găsită în lapte, este o fosfoproteină). Detecția se face de obicei prin intermediul unei enzime legate
de anticorpul secund ar, de obicei peroxidaza din hrean (Mahmood și Yang, 2012).

51
Neuronii înghețați la -80° C au fost dezghețați și resuspendați în 100µl tampon de liză RIPA
1% (vezi 3.1. Reactivi și s oluții utilizate ), pe gheață. Celulele s -au lizat mecanic prin trecerea printr –
un ac de seringă de 5 -6 ori, după care s -au ținut 20 de minute pe gheță. Tuburile au fost centrifugate
30 de minute, la 4° C, 20000 xg.
S-a determinat concentrația totală de proteină folosindu -se kitul Pierce BCA Protein Assay
(Thermo Scientific). R eactivul s -a preparat amestecând 50 de părți din soluția A cu o parte din
soluția B. Probele și controalele (tampon de liză a fost utilizat ca blank) au fost pipetate într -o placă
cu 96 de godeuri, în duplicat. În fiecare godeu s -au amestecat 10µL probă, r espectiv tampon de liză
pentru blankuri cu 200µL soluție pentru colorare. Placa cu 96 de godeuri a fost incubată 30 de
minute la 37° C. S -au citit concentrațiile de proteină pentru fiecare probă și s -au făcut diluțiile
necesare cu tampon de liză pentru a s e obține aceeași concentrație în fiecare probă. Peste probe a
fost adăugat tampon de încărcare 5X ( vezi 3.1. Reactivi și s oluții utilizate ), la o concentrație finală
de 1X. Probele au fost denaturate termic la 95° C timp de 5 minute și încărcate într -un ge l de
poliacrilamidă de concentrație 10%. În primul godeu al gelului a fost încărcat un marker de masă
moleculară, Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Thermofisher). În cuva de migrare a
fost pus tampon de migrare ( vezi 3.1. Reactivi și s oluții utilizate ). Cuva cu gelul a fost fixată la o
sursă de curent și proteinele au migrat 15 minute la 150V și 45 minute la 180V. Migrarea s -a oprit
când frontul de migrare a părăsit gelul.
Transferul proteinelor din gel pe membrana de PVDF s-a făcut în urma ac tivării membranei.
Aceasta a stat 2 minute în alcool etilic absolut după care a fost păstrată în tampon de transfer ( vezi
3.1. Reactivi și s oluții utilizate ), cel puțin 5 minute. Odată scos din cuva de migrare gelul a fost
ținut 5 minute în tampon de trans fer. S -a asamblat un sandviș de transfer punând u-se într-un suport,
de la partea la care va fi conectat anodul către catod, în ordine: burete, hârtie de filtru îmbibată în
tampon de transfer, gelul SDS PAGE în care au migrat proteinele, membrana de PVDF, h ârtie de
filtru îmbibată în tampon de transfer, burete. Suportul a fost pus într -o cuvă de transfer pe gheață
pentru a menține o temperatură scăzută în timpul transferului. Cuva de transfer a fost conectată la
o sursă de curent menținută o oră la un ampera j de 80mA.
După transfer membrana a fost pusă într -o soluție salină tamponată de Tris (TBS, vezi 3.1.
Reactivi și s oluții utilizate ), care conține 1% Tween -2- (TBST). Membrana a fost blocată prin
incubare cu lapte 5% (Sigma), prin balansare timp de o oră. După blocare, peste membrană a fost

52
pus anticorpul anti PBGD obținut din iepure (Abcam, ab232927), 2µg/mL preparat în lapte 5%.
Vasul a fost incubat peste noapte pe balansor, la 4° C. Membrana a fost spălată de trei ori în TBST
timp de 5 minute, apoi s -a incubat cu anticorpul secundar anti iepure (Invitrogen) diluat 1:4000 în
lapte 5%. Membrana a fost lăsată în soluția cu anticorpul s ecundar pe balansor timp de o oră, la
temperatura camerei, după care au fost făcute 3 spălări cu TBST timp de 8 minute. Vizionarea
proteinei PBGD s -a realizat ărin incubarea membranei timp de 5 minute cu substratul HRP Super
Signal West Femto (Thermo Fisch er Scientific), ce conține luminol și tampon pentru peroxidază,
amestecate în raport de 1 la 1. După vizualizarea proteinei PBGD, membrana a fost incubată pe
balansor timp de o oră cu anticorpul de control al încărcării, anti -GAPDH -HRP dizolvat în lapte
5% la un raport de 1:250. După încă 3 spălări cu TBST timp de 8 minute fiecare, s -a citit din nou
luminescența după incubarea timp de 5 minute a membranei în substratul HRP.
Datele experimentale obținute au fost cuantificate cu ajutorul progamului ImageJ și
prelucrate cu Origin 8 (OriginLab Corporation, Northhampton, MA, USA).
3.2.5. Imagistică ROS
Pentru realizarea experimentelor de imagistică de ROS au fost utilizați neuroni din
ganglionii spinali de la șobolan, obținuți prin protocolul descris mai sus. Pe letul format din neuroni,
obținut în urma centrifugării a fost resuspendat în Nut Mix cu NGF și depus pe lamelele de sticlă
tratate cu poli -D-lizină 0.1 mg/mL timp de 30 de minute, după ce în prealabil au fost sterilizate cu
alcool etilic 100%. Neuronii pu și pe lamele de sticlă au fost încărcați timp de 15 minute cu
indicatorul de specii reactive de oxigen, diacetat de 2 ’ 7’ diclorodihidrofluoresceină (H2DCFDA,
ThermoFischer Scientific) 50mM, dizolvat în DMSO, diluat în 1mL soluție Ringer cu glucoză
5mM. Du pă incubare au fost efectuate trei spălări la intervale de 5 minute cu Ringer cu glucoză.
Experimentele de imagistică de ROS au fost realizate pentru a observa modificările induse
de aplicarea ALA și PBG asupra nivelului speciilor reactive de oxigen din n euroni. În timpul
înregistrării, neuronii au fost tratați cu ALA sau PBG (Sigma) 20µM în Ringer, timp de 10 minute.
Peroxidul de hidrogen 100mM a fost aplicat la final și a fost folosit drept control pozitiv pentru
formarea speciilor reactive de oxigen. În tre aplicările de substanțe, neuronii au fost perfuzați cu
soluție Ringer.

53
Pentru prelucrarea datelor și reprezentarea răspunsurilor neuronilor obținute în urma
aplicării substanțelor din protocolul experimental a f ost utilizat programul Origin 8 (OriginL ab
Corporation, Northhampton, MA, USA).

54
4. Rezultate și discuții
4.1. Rezultate
4.1.1. Silențierea genei HMBS în neuroni din DRG de șoboloan și determinarea
nivelului proteinei prin Western blot
Corpii neuronilor din ganglionii spinali au fost supuși unui tratament cu ARNsi sau ARN
scrambled conform protocolului descris în capitolul anterior (3.2.2.). Transfecția a fost realizată
pentru a simula condițiile întâlnite în organismele cu porfirie acută intermitentă, diminuând
expresi ei genei PBGD la nivel de proteină. Nivelul de silențiere a fost apreciat prin evaluarea
nivelului de exprimare al proteine i, prin tehnica Western blot descrisă în subcapitolul 3.2.4..

Figură 15 : Aprecierea nivelul proteic din 3 populații de neuroni și aspectul benzilor de proteine marcate cu
anticorpi specifici . Populațiile de neuroni au fost grupul control, netratați cu ARN sau cu agenți de transfecție, grupul
ARN scrambled, tratat cu ARN ce nu afectează expresia proteică și grupul ARNsi, tratat cu ARNsi ce induce fenomenul
de interferență ARN. Aprecierea a fost făcută prin Western Blot, folosindu -se anticorpi specifici pentru PBGD .
Proteina de referin ță a fost gliceraldehid 3 fosfat dehidrogenaza (GAPDH) . În total, s -a remarcat o scădere a expresie i
HMBS la nivel de proteină cu aproximativ 30% față de grupul control .

55
4.1.2. Imagistică de calciu pentru evidențierea activității modificate a TRPA1, TRPV1
și TRPM8
Întrucât crizele acute de porfirie sunt marcate de diferite tipuri de durere și dezvoltar ea bolii
implică în unele cazuri și neuropatia nervilor senzitivi (Lin și colab, 2011), am presupus implicarea
canalelor ionice observate de obicei în nocicepție. Înregistrări de imagistică de calciu au fost
realizate pe DRG, confrom protocolului descris î n 3.2.3., atât pentru neuroni care au fost tratați cu
ARN scrambled, cât și pentru neuroni tratați cu ARNsi (mimând condițiile porfiriei acute
intermitente).

Figură 16 : Câmp de neuroni în care se observă activarea acestora la aplicarea diferiților agoniști specifici.
Neuronii ce exprimă TRPM8 au fost identificați prin aplicarea de WS -12 (stânga sus). Neuronii ce exprimă TRPA1 au
fost identificați prin ap licarea de AITC ( dreapta sus). Neuronii ce exprimă TRPV1 au fost identificați prin aplicarea de
capsaicină ( stânga jos). Viabilitatea neuronală a fost confirmată prin aplicarea la final de soluție Ringer cu KCl, ce

56
determină un influx pute rnic de calciu (d reapta jos). În f ragmentele de stânga sus ale fiecărui chenar este reprezentat
timpul la care a fost făcută poza. Influxul de calciu a putut fi observat datorită înărcării cu Calcium Green, indicator
fluorescent, activat de ionii Ca2+. Imaginile au fost preluate cu ajutoru l programului Axon Imaging Workbench 2.2
(Axon Instruments, Union, CA).
A fost apreciată variația numărului de neuroni care au răspuns la cei 3 agoniști în cele două
condiții (tratament cu ARN scrambled, respectiv ARNsi).

Figură 17: Procentele de neuro ni care au răspuns la diferiții stimuli. Se poate observa o proporție mai mare
de neuroni care au răspuns la capsaicină în populațiile tratate cu ARNsi (aproximativ 42% din neuroni, comparativ cu
doar 26% în populația tratată cu ARN scrambled)..
Fluorescența emisă în urma aplicării agoniștilor și soluției Ringer cu KCl a fost determinată
pentru toate câmpurile ce conțineau neuroni (au prezentat o creștere a semnalului fluorescent la
aplicarea de KCl).

57

Figură 18 : 6 neuroni care prezintă răspunsuri la aplicarea agoniștilor specifici pentru TRPM8, TRPA1,
respectiv TRPV1. Pentru ambele tipuri de condiții (tratați cu ARN scrambled, notați cu negru pe grafic sau cu ARNsi,
notați cu roșu) a fost folosit același protocol în timpul înregistrării. Acesta a fost descris în subcapitolul 3.2.3., 30 de
secunde aplicare WS -12 5µM, 1 minut AITC 50µM și 30 de secunde Cap 100 nM. Au fost reprezentați neuroni în care
raportul ΔF/F 0 la aplicarea de Ringer cu KCl a fost mai mare ca 0, 1. Pe abcisă este reprezentat timpul în minute, iar pe
ordonată fluorescența exprimată în unități arbitrare.
Au fost selectați exclusiv neuroni ce prezentau o valoare a ΔF/F 0 la aplicarea de KCl mai
mare de 0,1, pentru a se asigura viabilitatea acestora. Au fost identificați toți neuronii ce
îndeplineau această condiție și au fost selectați dintre aceștia cei ce au prezentat valori ΔF/F 0 mai
mari ca 0,1 și la aplicarea agonișt ilor. A fost făcută o medie a valorilor ΔF/F 0 pentru fiecare aplicare
și au fost reprezentate comparativ (grupul tratat cu ARN scrambled și grupul tratat cu ARNsi).

58

Figură 19 : Evaluarea statistică a răspunsurilor la cei 3 agoniști. A fost realizată o me die a ΔF/F 0 a tuturor
neuronilor care au răspuns la un anumit agonist. Cu negru este reprezentată media valorilor neuronilor tratați cu ARN
scrambled (16 au răspuns la WS -12, 28 la AITC și 30 la Cap), iar cu roșu este reprezentată media valorilor neuronil or
tratați cu ARNsi (21 au răspuns la WS -12, 33 la AITC și 51 la Cap). Barele de eroare reprezintă eroarea standard medie
Se observă din figura 18 că nu există diferențe semnificative statistic între răspunsurile
neuronilor ce prezintă o expresie normală a HMBS și a celor ce prezintă o expresie alterată a acestei
enzime.
A fost calculată și aria de sub grafic pentru a se verifica dacă există difer ențe în cantitatea
totală de calciu ce intră în celule în timpul stimulilor. Au fost selectați aceeași neuroni ca pentru
cuantificarea ΔF/F 0 întrucât aceștia prezentau răspunsuri veritabile la diferiții agoniști.

59

Figură 20: Evaluarea influxului total de calciu prin cuantificarea ariilor de sub cur bă pe parcursul fiecărui
stimul . Notațiile în figură sunt identice cu cele din figura anterioară.
Se observă că nu există diferențe relevante statistic nici în influxul total de calciu.

60
4.1.3. Imagist ica DRG a speciilor reactive de oxigen
Deoarece în condițiile porfiriei acute intermitente se remarcă o acumulare a speciilor
reactive de oxigen în celule ca rezultat a concentrațiilor crescute de ALA și PBG (Lin și colab,
2011; Cardenas și Guerrero, 2018 ) am încercat observarea acestor efecte in vitro, pe DRG.

Figură 21: Efectele aplicării ALA și PBG asupra nivelului de specii reactive de oxigen din DRG. A fost
făcută o medie a fluorescenței neuronilor în fiecare dintre condiții. Neuronii au fost tratați conform protocolului descris
în 3.2.5. (10 minute ALA sau PBG 20µM), indicatorul fluorescent pentru speciile reactive de oxigen fiind diacetatul
de 2’ 7’ diclorodihidrofluoresceină. Pe abcisă este reprezentat timpul în minute și intervalele de aplicare ale
intermediarilor (ALA și PBG) și a peroxidului de hidrogen (folosit drept control pozitiv pentru stresul oxidativ ), iar pe
ordonată este reprezentată fluorescența în unități arbitrare. Au fost evaluați 56 de neuroni în aplicările de PBG, 65 în
aplicările de ALA și 60 pentru formarea unui grup control.

61
4.2. Discuții
Porfi riile acute sunt maladii ce afectează printre altele și sistemul nervos periferic, putând
induce neuropatie periferică (Siegesmund și colab, 2011). Disfuncțiile nervilor pot apărea ca
rezultat a mai mulți factori ce se acumulează în cadrul porfiriilor. Cei mai importanți sunt
neurotoxicitatea directă determinată de concentrații intracelulare mari de ALA și PBG, principalii
metaboliți observați în porfirii și acumularea de specii reactive de oxigen ca urmare a efectelor
nocive ale intermediarilor (Cardenas ș i Guerrero, 2018). Un alt motiv ce explică afectarea
neuronilor ar putea fi scăderea nivelului de hem și funcționarea defectuasă a catenei transportatoare
de electroni din mitocondrie și astfel scăderea nivelului de ATP (Lin și colab, 2011).
Deoarece cana lele TRP sunt principalele proteine implicate în transmiterea durerii și în
special a durerii asociate neuropatiei (Jardin și colab, 2017), am presupus că ar putea avea o
activitate modificată în cadrul contextului porfirinic. Un alt indicator al potențial ei implicări a
TRPA1 în simptomele asociate acestei maladii este activarea directă determinată de speciile
reactive de oxigen (Dai, 2015).
În afară de diferența procentului de neuroni care au răspuns la capsaicină (Fig 17),
experimentele realizate nu au produs rezultate semnificative din punct de vedere statistic. Nu s -a
observat o creștere a fluorescenței determinate de specii reactive de oxigen în neuronii ganglionilor
spinali în cultură primară în timpul perfuzării ALA sau PBG (Fig 21). Nu a fost remar cată nici o
diferență în răspunsurile la agoniști (Fig 19) sau în influxul total de calciu (Fig 20) ale TRPA1,
TRPV1 și TRPM8 în DRG care au fost tratați cu ARNsi ce a dus la o scădere a nivelului p roteic
cu aproximativ 30% (Fig 15 ).
Deși nu au fost obțin ute rezultatele așteptate, există anumite perspective de studiu. În primul
rând ar putea fi optimizat protocolul de transfecție pentru a se obține o interferență ARN mai bună
și implicit o cantitate mai mică de proteină în celule. De asemenea, ar putea fi testată activitatea
canalelor TRP după perfuzarea sau incubarea DRG cu ALA și PBG pentru perioade mai mult sau
mai puțin îndelungate. Sunt posibile și studiile pe DRG recoltați de la șobolani PBGD knock -out
(PBGD-/-), pentru ca neuronii senzitivi din coarn ele dorsale să fie afectați de condițiile complete
ale afecțiunii. Ar putea fi făcute și experimente comportamentale pe ș obolani PBGD knock -out,
determinându -se intensitatea durerii la injectarea de diferiți agoniști pentru c anale TRP, comparativ
cu șobola ni control.

62

5. Concluzii
Durearea ce apare în timpul crizelor acute de porfirie este unul din factorii principali ce
scade calitatea vieții la pacienți. Descoperirea mecanismelor prin care aceasta este transmisă ar
putea avea implicații în utilizarea de analgezice ce blochează direct respectivele mecansime. De
asemenea, poate fi studiată și durerea asociată neuropatiei rezultate din urma acestor maladii.
Canalele TRPM8, TRPA1 și TRPV1 sunt principalii canditați pentru implicarea în
transmiter ea durerii a sociată neuropatiei, iar în această lucrare a fost investigată implicarea lor în
transmiterea durerii în cadrul porfiriilor acute.
Experimentele realizate pe DRG tratați cu ARNsi pentru PBGD, au arătat activitatea
canalelor nu a fost modificată în condiții ce simulează porfiria acută intermitentă. De asemenea, în
cadrul experimentelor pe DRG netratați cu ARNsi nu a fost observată o creștere a nivelului de ROS
în celule perfuzate cu ALA sau PBG. Totuși, a fost observată o creștere a expresiei TRPV1 în
cadrul neuronilor tratați cu ARNsi, comparativ cu neuronii tratați cu ARN scrambled (Fig 17). Este
neclar însă efectul acestei aparente supraexpresii întrucât atât amplitudinea cât și influxul total de
calciu din timpul răspunsurilor la agonistul specific au fos t asemănătoare în cele două condiții.
Efectele pozitive ale descoperirii mecanismului molecular de transmitere a durerii în
porfiriile acute sunt destul de mari pentru a justifica o continuare a explorării activității canditaților
din familia TRP implicați de obicei în transmiterea durerii, în diferite condiții experimentale ce
simulează cât mai fidel maladiile.

63

6. Bibliografie
1.Agrawal N., Dasaradhi P. V. N., Mohmmed A., Malhorta P., Bhatnagar R. K., Mukherjee S. K.,
2003, RNA Interference: Biology, Mechanism, and Applications, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67
(4), 657 -685.
2.Akopian N. A. 2010, Regulation of Nociceptive Transmission at the Periphery Via TRPA1 –
TRPV1 Interactions. Curr. Pha rm. Biotechnol. 12, 89 –94.
3.Alagia, A. & Eritja, R. ,2016, siRNA and RNAi optimization. Wiley Interdiscip. Rev. RNA 7,
316–329.
4. Ba, X., Wang, J., Zhou, S., Luo, X., Peng, Y., Yang, S., Hao, Y., & Jin, G. 2018. Cinobufacini
protects against paclitaxel -induced peripheral neuropathic pain and suppresses TRP V1 up –
regulation and spinal astrocyte activation in rats. Biomed. Pharmacother. 108, 76 –84.
5.Balwani, M. & Desnick, R. J. 2012 The porphyrias: Advances in diagnosis and treatm ent. Blood
120, 4496 –4504 .
6.Basso, L. & Altier, C. 2017 Transient Receptor Pote ntial Channels in neuropathic pain. Curr.
Opin. Pharmacol. 32, 9 –15.
7.Benemei, S., Patacchini, R., Trevisani, M. & Geppetti, P. 2015 TRP channels. Curr. O pin.
Pharmacol. 22, 18 –23.
8.Besur, S., Schmeltzer, P. & Bonkovsky, H. L. 2015, Acute Porphyrias. J. Emerg. Med. 49, 305 –
312.
9.Bisell, D.M., Wang, B. 2015, Acute Hepatic Porphyria, J Clin Transl Hepatol, vol.3, 17 -26
10.Bissell, D. M., Anderson, K. E. & Bonkovsky, H. L. 2017 Porphyria. N. En gl. J. Med. 377,
862–872.
11.Borawski, J., Lindeman, A., Buxton, F., Labow, M. & Gaither, L. A. ,2007, Optimization
procedure for small interfering RNA transfection in a 384 -well format. J. Biomol. Screen. 12, 546 –
559.

64
12.Cardenas, J. L. & Guerrero, C. 2018 Acute intermittent porphyria: general aspects with focus
on pa in. Curr. Med. Res. Opin. 34, 1309 –1315 .
13.Ciobanu, A. C., Selescu, T., Gasler, I., Soltuzu, L. & Babes, A. 2016 Glycolytic metabolite
methylglyoxal inhibits cold and menthol activation of the transient receptor potential melastatin
type 8 channel. J. N eurosci. Res. 94, 282 –294.
14.Dai, Y. 2016, TRPs and pain. Semin. Immunopathol. 38, 277 –291.
15.Damen, M., Groenen A. J. J., Dongen S. F. M, Nolte R. J. M.m Scholte B. J. Feiters M. C.
,2018,. Transfection by cationic gemini lipids and surfactants. Medchemco mm 9, 1404 –1425.
16.Fakhr, E., Zare, F. & Teimoori -Toolabi, L., 2016, Precise and efficient siRNA design: A key
point in competent gene silencing. Cancer Gene Ther. 23, 73 –82.
17.Fernandes, E. S., Fernandes, M. A. & Keeble, J. E. 2012, The functions of TRP A1 and TRPV1:
Moving away from sensory nerves. Br. J . Pharmacol. 166, 510 –521.
18.Foged, C., 2012, siRNA Delivery with Lipid -based Systems: Promises and Pitfalls. Curr. Top.
Med. Chem. 12, 97 –107.
19.Ghildiyal, M. & Zamore, P. D., 2009, Small silencing RNA s: An expanding universe. Nat. Rev.
Genet. 10, 94 –108.
20.Giorgi, S., Nikolaeva -Koleva, M., Alarcón -Alarcón, D., Butrón, L. & González -Rodríguez, S.
2019, Is TRPA1 burning down TRPV1 as druggable target for the treatment of chronic pain? I nt.
J. Mol. Sci. 20, 1 –20.
21.Gorchein A. 1997, Drug treatment in acute por phyria. Br J Clin Pharmacol ;44(5):427‐434.
22.Han, H., 2018, RNA interference to knock down gene expression. Methods Mol. Biol. 1706,
293–302.
23.Harper, P. & Sardh, E. 2014, Management of acute i ntermittent porphyria. Expert Opin . Orphan
Drugs 2, 349 –368.
24.Herrick, A. L. & McColl, K. E. L. 2005 Acute intermittent porphyria. Best Pract. Res. Clin.
Gastroenterol. 19, 235 –249.

65
25.Ho, W., Zhang, X. Q. & Xu, X., 2016 Biomaterials in siRNA Delivery: A Comprehensive
Review. Adv. Healthc. Mater. 5, 2715 –2731.
26.Hung, C. Y. & Tan, C. H. 2018, TRP channels in nociception and pathological pain. Adv. Ex p.
Med. Biol. 1099, 13 –27.
27.Jardín, I. et al. TRPs in pain sensation. Front. Physiol. 8, 1 –10 (2017).
28. Kambiz S, Duraku LS, Holstege JC, Hovius SE, Ruigrok TJ, Walbeehm ET . 2014, Thermo –
sensitive TRP channels in peripheral nerve injury: A review of their role in cold intolerance. J.
Plast. Reconstr. Ae sthetic Surg. 67, 591 –599.
29.Kanasty, R., Dorkin, J . R., Vegas, A. & Anderson, D., 2013, Delivery materials for siRNA
therapeutics. Nat. Mater. 12, 967 –977.
30. Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim,
J., Park, C. S., Kernan, M. J., & Kim, C , 2003, A TRPV family ion channel required for hea ring in
Drosophila. Nature. ;424(6944):81 –84
31.Lambert D. G. & Rainbow R. D., 2013, Caclium Signaling Protocols Third Edition, Human
Press
32.Lin, C. S. Y., Lee, M. J., Park, S. B. & Kiernan, M. C. 2011, Purple p igments: The
pathophysiology of acute porphyric neuropathy. Clin. Ne urophysiol. 122, 2336 –2344 .
33.Mahmood, T. & Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N. Am. J.
Med. Sci. 4, 429 –434 (2012).
34.Marwaha L, Bansal Y, Singh R, Sar oj P, Bhandari R, Kuhad A. 2016, TRP channels: potential
drug target for neuropathic pain. Inflammopharmacology . 24(6):305‐317.
35.Moore, C., Gupta, R., Jordt, S. E., Chen, Y. & Liedtke, W. B. 2018 , Regulation of Pain and Itch
by TRP Channels. Ne urosci. Bull. 34, 120 –142.
36.Napoli, C., Lemieux, C. & Jorgensen, R., 1990, Introduction of a chimeric chalcone synthase
gene into petunia results in reversible co -suppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2,
279–289.

66
37.Naziroǧlu, M., Merve Dikici, D. & Dursun, Ș. 2012 , Role of oxidative stress and Ca2+ signaling
on molecular pathways of neuropathic pain in diabetes: Focus on TRP channels. Neur ochem. Res.
37, 2065 –2075 .
38.Nikam, R. R. & Gore, K. R., 2018, Journey of siRNA: Clinical Developments and Ta rgeted
Delivery. Nucleic Acid Ther. 28, 209 –224.
39.Poblete -Gutiérrez, P., Wiederholt, T., Merk, H. F. & Frank, J. 2006 , The porphyrias: Clinical
presentation, diagnosis and treatment. Eur. J . Dermatology 16, 230 –240.
40.Ponka, P. 1999 , Cell biology of hem e. Am. J. Med. Sci. 318, 241 –256.
41.Puy, H., Gouya, L. & Deybach, J. C. 2010 , Porphy rias. Lancet 375, 924 –937.
42.Sałat, K. & Filipek, B. 2015 , Antinociceptive activity of transient receptor potential channel
TRPV1, TRPA1, and TRPM8 antagonists in neurogenic and neuropathic pain models in mice. J.
Zhejiang Univ. Sci. B 16, 167 –178.
43.Siegesmund, M., Van Tuyll Van Serooskerken, A. M., Poblete -Gutiérrez, P. & Frank, J. 2010 ,
The acute hepatic porphyrias: Current status and future challenges. Best Pract. Res. Clin.
Gastroenterol. 24, 593 –605.
44.Wang, B., Rudnick, S., Cengia, B. & Bonkovsky, H. L. 2019 , Acute Hepatic Porphyrias:
Review and Recent Pr ogress. Hepatol. Commun. 3, 1 93–206.

67
7. Listă figuri
Figură 1 . Calea de sinteză a hem -ului……………………………………………………………….5
Figură 2 . Cele mai frecvente manifestări ale durerii în crizele acute de porfirie …………………….9
Figură 3 . Inducerea unui atac acut, determinată de scăderea concentrației de hem ………………..14
Figură 4 . Schemă de diagnostic diferențial pentru tipurile de porfirie acută ………………………17
Figură 5 . Silențierea ARNm pentru ALAS 1 prin intermediul ARNsi …………………………….19
Figură 6 . Reprezentare schematică a mecanismelor în care sunt implicate TRPA1 și TRPV1 pentru
a induce durerea neuropatică ………………………………………………………………………28
Figură 7 . Implicarea canalelor TRP în durerea neuropatică și consecințele distrugerii neuronilor ..29
Figură 8 . Observarea dezvoltării hi peralgeziei la temperaturi scăzute în șoareci tratați cu paclitaxel,
comparativ cu animale control ……………………………………………………………………30
Figură 9 . Implicarea canalelor TRP în diferite forme de durere neuropatică ……………………… 31
Figură 10 . Interferența ARN mediată de RI SC…………………………………………………… 36
Figură 11 . Structura ARNsi în interacțiunea cu proteina Ago 2 …………………………………… 38
Figură 12 . Activarea mecanismului RISC de către ARNsi sau shARN ce este maturat ulterior în
ARNsi ……………………………………………………………………………………………. 41
Figură 13 . Structură lipidoid 98N 12-5…………………………………………………………….. 43
Figură 14 . Structura poli -L lizină -acid colic polietilen glicată …………………………………… 44
Figură 15 . Aprecierea nivelul proteic din 3 populații de neuroni și aspectul benzilor de proteine
marcate cu anticorpi sp ecifici ……………………………………………………………………… 54
Figură 16 . Câmp de neuroni în care se observă activarea acestora la aplicarea diferiților agoniști
specifici …………………………………………………………………………………………… 55
Figură 17 . Procentele de neuroni care au răspuns la diferiții stimuli ……………………………… 56
Figură 18 . 6 neuroni care prezintă răspunsuri la aplicarea agoniștilor specifici pentru TRPM8,
TRPA1, respectiv TRPV1 ………………………………………………………………………… 57
Figură 19 . Evaluarea statistică a răspunsurilor la cei 3 agoniști ………………………………….. 58
Figură 20 . Evaluarea influxului total de calciu prin cuantificarea ariilor de sub curbă pe parcursul
fiecărui stimul …………………………………………………………………………………….59
Figură 21 . Efectele aplicării ALA și PBG asupra nivelului de specii reactive de oxigen din DRG
………………………… ………………………………………………………………………… 60