1. Embriogeneza mușchilor masticatori 5 1.1 Introducere 5 1.2 Formarea regiunii faringiene 5 1.2.1 Elemente componente ale arcurilor faringiene 8… [308309]

CUPRINS

Introducere 3

1. Embriogeneza mușchilor masticatori 5

1.1 Introducere 5

1.2 Formarea regiunii faringiene 5

1.2.1 Elemente componente ale arcurilor faringiene 8

1.2.2 Derivatele primului arc branhial (arc mandibular) 9

1.3 Morfogeneza mușchilor masticatori 10

1.4 Creșterea și dezvoltarea mușchilor masticatori 12

2. Anatomia mușchilor masticatori 15

2.1 Mușchiul maseter 15

2.2 Mușchiul temporal 17

2.3 Mușchiul pterigoidian medial 19

2.4 Mușchiul pterigoidian lateral 21

3. Histologia țesutului muscular striat 23

4. Ultrastructura fibrei musculare scheletice 26

4.1 Clasificarea fibrelor musculature scheletale 27

4.2 Componentele fibrei musculare 28

4.2.1 Sarcolema 28

4.2.2 Sarcoplasma 29

4.2.3 Nucleu 30

4.2.4 Miofibrile 30

4.2.5 Mitocondrii 31

4.2.6 Reticul sarcoplasmic 32

4.3 [anonimizat] 34

4.3.1 Formarea VVO 34

4.3.2 Structura 35

4.3.3 Funcții 36

5. Celule stem 38

5.1 Celulele stem: definiție, caracteristici, clasificare 38

5.1.1 Definiție 38

5.1.2 Celule stem embrionare și adulte 38

5.1.3 Proprietățile celulelor stem 39

5.1.4 Clasificare 40

5.1.5 Localizarea celulelor stem adulte 41

5.2 Nișe stem 42

5.2.1 Generalități 42

5.2.2 Funcția și mecanismele de reglare 42

5.2.3 Nișă specifică și nespecifică 43

5.3 Nișa stem perivasculară 44

5.3.1 Nomenclatură 44

5.3.2 Pericitele: heterogenitate și funcții 45

5.4 Nișe stem musculare 46

5.4.1 Generalități 46

5.4.2 Celulele satelite 47

6. Material și metodă de studiu 49

7. Rezultate 50

8. Discuții 67

8.1 Discuții privind nișa stem musculară 67

8.1.1 Proprietățile și variația numerică a celulelor satelite 69

8.2 Anatomia ultrastructurală a reticulului sarcoplasmic 74

8.2.1 Receptorii de rianodină la nivelul anvelopei nucleare 75

8.3 Discuții asupra reticulului mitocondrial 76

8.3.1 Funcția mitocondriilor de cablu electric intracelular 77

8.3.2 Microtubulii și dinamica mitocondrială 81

Concluzii 86

Bibliografie 88

Introducere

Ipoteza inițială a studiului din cadrul prezentei lucrări de licență a fost aceea a potențialului regenerativ al mușchilor masticatori. [anonimizat] o a [anonimizat] a [anonimizat].

Scopul a fost acela de a obiectiva în anatomia ultrastructurală prezența celulelor satelite (celule regenerative) în mușchiul maseter și de a [anonimizat].

Histologia, termen provenit din limba greacă (“histo” – țesut + “logos” – știință), [anonimizat] a forma organe. Histologia, [anonimizat], [anonimizat], țesuturilor și organelor. Dimensiunile mici ale celulelor și componentelor matricei extracelulare fac indispensabilă utilizarea microscopului optic sau electronic.

Ultimele decenii au adus pentru histologie progrese deosebit de importante legate de perfecționarea microscopiei electronice și a [anonimizat].

[anonimizat] a craniului, între mușchii mimicii și cei paravertebrali. Mușchii masticatori formează componenta musculară a aparatului dento-maxilar, cu un rol funcțional important în realizarea masticației, în primul rând, dar și în deglutiție, și vorbire articulată. Cu toate că în masticație sunt implicați mușchii suprahioidieni sau coborâtori ai mandibulei, sub denumirea de „mușchi masticatori” sunt cunoscuți doar patru mușchi, considerați a fi cei mai importanți: mușchiul temporal, mușchiul maseter și mușchii pterigoidian lateral și medial. Aceștia acționează asupra mandibulei pe care o mobilizează și realizează mișcările de elevație, propulsie, retropulsie, lateralitate și prin intermediul pterigoidianului lateral inițiază mișcarea de coborâre.

Mușchii masticatori intră în categoria mușchilor scheletici, care dețin capacitatea de a genera contracții puternice și rapide sub control voluntar. Din punct de vedere histologic, sunt formați din țesut muscular striat. Țesutul muscular striat este format din fibre musculare, fascicule alcătuite din celule multinucleate cilindrice foarte lungi.

Sunt extrem de puține publicațiile care apreciază ultrastructura mușchiului maseter1-5; de regulă este vorba de experimente la diferite specii, la care sunt apreciate, mai mult sau mai puțin detaliat, modificările ultrastructurale ale mușchiului, acestea fiind de regulă nespecifice.

Cu această ocazie vreau să aduc mulțumiri Dl.Prof.Dr.Med.Dr.Biol.Dr.Hab. Mugurel Constantin Rusu pentru ajutorul acordat în realizarea părții practice și coordonarea Lucrării de Licență.

Embriogeneza mușchilor masticatori

Introducere

Obiectul de studiu al embriologiei este reprezentat de formarea și devoltarea produsului de concepție de la stadiul de zigot până la cel de nou-născut. În evoluția intrauterină, va fi parcursă o perioadă embrionară de 8 săptămâni, în care are loc constituirea organelor, urmată de perioada fetală desfășurată până la naștere, în care se continuă creșterea și diferențierea lor6.

Dezvoltarea structurii regiunii cefalice, cuprinsă în perioada de embriogeneză, începe în săptămâna a III-a și continuă până în săptămâna a VIII-a de viață intrauterină6. Responsabil de formarea acestei regiunii este mezenchimul provenit din mezodermul paraaxial și al plăcii neurale, creasta neurală și placodele ectodermice. Din mezodermul paraaxial se dezvoltă parțial cutia craniană, mușchii striați cranio-faciali, dermul, țesutul conjunctiv din partea posterioară a capului și meningele inferior de prozencefal. Din placa laterală rezultă cartilajul aritenoid și cricoid și țesutul conjunctiv de la acest nivel. Suportul scheletic medio-facial și al arcurilor branhiale, dar și celelalte țesuturi din regiune sunt derivate din celulele crestei neurale. Pe lângă cele menționate mai sus, din celulele crestei neurale și ale placodelor ectodermice iau naștere ganglionii senzoriali ai nervului trigemen, facial, glosofaringian și vag7.

Formarea celor 5 perechi de arcuri faringiene este un element caracteristic al regiunii cefalice, suportul embriologic în baza căruia se realizează diferențierea structurilor de la nivelul capului și gâtului. De-a lungul timpului, au mai fost denumite arcuri viscerale sau branhiale, dar astăzi se preferă cea de arcuri faringiene, fiind considerată cea mai corectă. Acestea sunt separate între ele de șanțuri adânci numite fante faringiene. Pe lângă arcuri și fante faringiene, concomitent cu acestea, se dezvoltă recesuri faringiene la nivelul segmentului superior al intestinului anterior, de-a lungul pereților laterali6.

Formarea regiunii faringiene

Arcurile faringiene se formează în săptămânile IV și V ale perioadei embrionare, în regiunea anterolaterală, între proeminența cardiacă și mugurele frontonazal6. În literatura de specialitate, în funcție de autorul lucrării, se întâlnește o variație între 4 și 6 a numărului perechilor de arcuri. Majoritatea consideră că se formează 5 perechi. Acestea vor fi numerotate în sens cranio-caudal (1,2,3,4,6) și vor apărea conform numerotării. Astfel, în ziua 20 va apărea primul arc faringian (arc mandibular) ce va fi succedat de al II-lea (arc hioidian) și al III-lea arc (arc tiroidian), arcurile 4 și 6 formându-se ultimele. Fiecare este compus din mezenchim cu structură laxă înconjurat de un înveliș epitelial format din ectoderm embrionar la exterior și endoderm faringian la interior8. Mezenchimul își are originea pe de-o parte în mezodermul cefalic – celule ectodermale din șanțul primitiv migrate la nivelul arcurilor, iar pe de altă parte în creasta neurală – celule ectodermale cu importanță deosebită în dezvoltarea tisulară, care pot fi responsabile de anomaliile congenitale din regiunea faringiană6.

Celulele implicate în formarea arcurilor faringiene provin din toate cele 3 straturi germinative embrionare (ecto, mezo și endoderm) și din crestele neurale. Ectodermul este stratul situat la exteriorul arcurilor faringiene; prezintă invaginații, numite fante faringiene, care delimitează arcurile între ele. Endodermul estefoița embrionară situată la interiorul arcurilor, care tapetează evaginările dintre arcuri formând recesurile faringiene. Mezodermul este cel de-al treilea strat germinativ embrionar care cuprinde: (a) mezodermul rostral – respectă membrana orofaringiană; (b) mezodermul caudal: din mezodermul axial ia naștere placa precordală, rezervorul de celule mezodermale al capului și gâtului; (c) mezodermul paraaxial se organizează în somitomere; exceptând primele 7 perechi, somitomerele formează somite6.

Creasta neurală, structură cu existență efemeră, este localizată la nivelul axului cranio-caudal embrionar. Placa neurală rezultă din îngroșarea ectodermului de la suprafața notocordului și a mezodermului precordal. Inducția celulelor de la nivelul plăcii neurale inițiază neuruluția. După acest eveniment declanșator al procesului de neurulatie, are loc elongația și creșterea spre linia primitivă a plăcii neurale. Ulterior, marginile laterale ale acesteia proemină formând plicile neurale, iar șanțul neural din zona centrală a plăcii separă embrionul în două părți egale. Plicile neurale se alipesc pe linia mediană în zona cervicală, continuând apoi atât spre cranial, cât și spre caudal pentru a forma tubul neural și a încheia procesul de neurulație. Celulele crestei neurale formează spațiul dintre tubul neural și ectodermul supraiacent. Celulele crestei neurale devin celule mezenchimale prin migrare activă din neuroectoderm în mezoderm6.

Celulele crestei neurale își încep deplasarea către mezoderm înainte de închiderea tubului neural în extremitatea cefalică, iar la nivelul trunchiul, precum și în restul organismului, după acest eveniment. Acestea migrează pe trasee definite, în diferite regiuni embrionare, în funcție de localizarea pe axul cranio-caudal6.

Inițial, celulele crestei neurale sunt multipotente, având o capacitate crescută de diferențiere celulară. Ulterior, în timpul deplasării, această capacitate se reduce sub influența factorilor locali, cum ar fi: hormonii, factorii de creștere, alte celule6.

Migrarea celulară cuprinde trei etape: inițierea, dispersia și terminarea. Inițierea reprezintă transformarea epitelial-mezenchimală a celulelor crestei neurale și declanșează detașarea de tubul neural a acestora. Factorii determinanți ai migrării celulare sunt: (1) modificarea adeziunii celulare; (2) înmulțirea joncțiunilor celulare și a matricii extracelulare prin augmentarea integrinelor de suprafață; (3) creșterea țesutului intercelular; (4) sporirea mobilității sub acțiunea factorilor de mediu. Dispersia poate fi definită ca deplasarea coordonată a celulelor în matricea extracelulară spre locația definitivă, urmată de proliferare celulară. Posibilele mecanisme de control implicate sunt: (1) inhibiția de contact (mecanism principal) – stoparea migrării după întâlnirea altor tipuri celulare; ghidarea către zone cu celularitate scăzută; (2) ghidajul de contact – anumite structuri embrionare (vase de sânge, axoni) orientează migrarea celulară. Terminarea este etapa în care procesele de inițiere sunt inversate: (1) modificarea adeziunii celulare; (2) reexprimarea integrinelor de suprafață cu reglare redusă; (3) scăderea spațiului extracelular; (4) diminuarea moleculelor care favorizează disponibilitatea substratului pentru migrare6.

Celulele crestelor neurale provin din zonele învecinate ale neuroectodermului și ectodermului. Înaintea inițierii procesului de migrare, toate celulele sunt multipotente, dar odată cu acesta încep să se diferențieze, să adopte caracteristicile necesare regiunii în care au migrat6.

Mezenchimul cranial și facial se vor dezvolta din celulele crestei neurale craniale, care urmează un traseu de migrare dorso-lateral. Ulterior, din mezenchimul format, vor lua naștere țesutul cartilaginos, osos, neuronii, celulele gliale și țesutul conjunctiv facial. Formațiunile celulare de la acest nivel au capacitatea de a pătrunde în arcurile și pungile faringiene. Astfel, se vor dezvolta derivatele faringiene specifice6.

Celulele situate ventral de al VI-lea rombomer parcurg următoarele trasee: celulele corespunzătoare rombomerului al II-lea pătrund în primul arc faringian; cele corespunzătoare rombomerului al IV-lea pătrund în cel de-al II-lea; cele corespunzătoare rombomerului al VI-lea pătrund în al III-lea și al IV-lea arc; iar celulele corespunzătoare rombomerului al III-lea și al V-lea se deplasează prin intermediul rombomerelor vecine6.

La nivelul arcurilor și al pungilor faringiene, formațiunile celulare vor continua să se multiplice. Ulterior, se vor diferenția și vor forma derivatele faringiene specifice6.

Elemente componente ale arcurilor faringiene

Componentă vasculară arterială

Arcul aortic, vas de legătură între aorta dorsală și cea ventrală, este prima structură formată la nivelul unui arc faringian. Se dezvoltă succesiv dinspre cranial spre caudal. Primele două arcuri dispar în mare parte în momentul apariției celui de-al patrulea arc. Din primul arc se formează artera maxilară, din al doilea artera stapediană, următorul compune parțial artera carotidă comună și participă la formarea porțiunii proximale a arterei carotide interne. Arcul aortic al patrulea din partea dreaptă dă naștere segmentului proximal al arterei subclavii de pe aceeași parte, iar cel din partea stângă participă la formarea crosei aortei definitive. Artera derivată din penultimul arc faringian involuează, iar ultima pereche de arcuri aortice dă naștere trunchiului arterei pulmonare6.

Mezodermul va forma celulele endoteliale ale arterelor, iar celule crestale neurale țesuturile de suport, cum ar fi pericitele și celule musculare netede6.

Componentă nervoasă și musculară striată

Arcurile faringiene au nervi cranieni proprii, dezvoltați după componenta arterială. Astfel, nervul cranian V (trigemen) corespunde primului arc, nervul VII (facial) celui de-al doilea, nervul IX (glosofaringian) corespunde arcului cu numărul trei, iar nervul cranian X (vag) arcului faringian IV prin ramura laringiană superioară și ultimului arc prin ramura laringiană recurentă. Pe traiectul lor, de-a lungul arcurilor faringiene, se regăsesc celule musculare mezodermale transportate și inervate de aceștia6.

Inervația motorie și senzitivă a arcurilor faringiene, dar și a structurilor derivate din acestea este asigurată de nervii cranieni corespunzători. Nervii cranieni se ramifică rezultând astfel o ramură dorsală și una ventrală. Ramura ventrală, la rândul său, prezintă un ram pretrematic către arcul faringian situat superior, un ram postrematic către arcul respectiv și unul faringian către segmentul dorsal al arcului situat superior6.

Componentă cartilaginoasă

Cartilajele sunt componentele branhiale care apar la final. Acestea sunt reprezentate de bare cartilaginoase cu originea în celulele crestale neurale craniale pentru primele trei arcuri faringiene și în mezodermul lateral pentru ultimele două6.

Derivatele primului arc branhial (arc mandibular)

La nivelul arcului mandibular, din componenta cartilaginoasă provenită din ectomezenchimul celui de-al II-lea rombomer se dezvoltă doi muguri, unul maxilar în porțiunea posterioară, altul mandibular în cea anterioară. Mugurele maxilar conține cartilajul pterigo-palato-cvadrat din care se formează procesul scurt al nicovalei, iar mugurele mandibular are în componență cartilajul lui Meckel, care participă la formarea capului și corpului ciocanului (osificare encondrală), ligamentului sfenomandibular și anterior al ciocanului6.

Din componenta mezenchimală osteogenă a primului arc, printr-un proces de osificare desmală, se vor dezvolta următoarele oase: premaxilar și maxilar, parțial osul palatin, osul zigomatic, porțiunea scuamoasă a osului temporal și mandibula (mare parte)6.

Materialul celui de-al patrulea somitomer formează mezenchimul mezodermal al primului arc faringian, în care își au originea toți mușchii masticatori, mușchii tensor al vălului palatin și al timpanului, mușchiul milohioidian și pântecele anterior al digastricului. Musculatura poate să se atașeze sau nu de elemente osoase sau cartilaginoase derivate din același arc faringian fără să influențeze determinarea originii acestora, deoarece se păstrează inervația arcului corespunzător. Inițial, la sfârșitul celei de-a IV-a săptămâni, mușchii masticatori se dezvoltă sub forma unei singure mase musculare. Ulterior, pe parcursul lunii a II-a de viață intrauterină, din aceasta se vor diferenția grupele musculare masticatorii. Mușchiul pterigoidian medial este primul care se diferențiază. Maseterul și pterigoidianul lateral provin din mușchiul temporal primitiv, pterigoidianul lateral fiind ultimul care se formează. Originea în arcurile faringiene face ca cei patru mușchi masticatori să se deosebească de ceilalți mușchi striați9.

Nervul trigemen, nervul primului arc faringian, prezintă o ramură maxilară și una mandibulară care asigură inervația mugurilor maxilar și mandibulari. Din cea de-a treia ramură a nervului trigemen, nervul mandibular, se desprind nervul alveolar inferior cu un traiect lateral de cartilajul Meckel și nervul lingual cu traiect medial de acesta6.

Componenta arterială, arcul aortic, va dispărea aproape complet până în ziua 27. Din porțiunea care persistă după această dată se va forma artera maxilară6.

Morfogeneza mușchilor masticatori

Mușchii arcurilor branhiale sunt asociați oaselor maxilare, hioidului, structurilor scheletale branhiale caudale și omologilor acestora. Mult timp s-a crezut că au evoluat din mușchii branhiilor, aceștia fiind o componentă a aparatului musculo-scheletal branhial – trăsătură definitorie a vertebratelor. Cercetările ulterioare au infirmat această teorie, susținând faptul că primul arc branhial ar deține proprietăti structurale și moleculare unice. Suportul scheletic branhial a dispărut odată cu apariția vertebratelor terestre și astfel s-au produs modificări importante la nivelul mușchilor corespunzători arcurilor. La nivelul arcurilor caudale nu s-au mai format majoritatea structurilor musculare, iar la cele încă prezente nu se poate demonstra originea branhială. Musculatura dezvoltată din primele două arcuri branhiale reflectă modificările apărute de-a lungul evoluției datorită poziției articulației de la nivelul maxilarelor și a mișcărilor masticatorii10.

La o categorie largă de vertebrate, originea mușhilor extremității cefalice își are locusul inițial la nivelul unor condensări miogenice aparținând arcurilor branhiale, deci mioblastele își au originea în mezodermul lateral. Utilizând metode de identificare celulalară la embrioni de păsări și șoareci, s-a descoperit că toate mioblastele cefalice iau naștere în mezodermul paraaxial. Ulterior își modifică poziția, deoarece la acest nivel are loc condensarea și diferențierea finală10.

Precursorii mușchilor cranio-faciali scheletici se organizează fie sub forma unui primordiu muscular, fie sub forma unei populații de celule mioblastice la nivelul arcurilor branhiale, care se vor diferenția în diverse grupe musculare. Primordiile mușchilor cu origine branhială iau naștere din zonele superficiale ale mezodermului paraaxial. Astfel, inițial sunt în contact cu ectodermul de suprafață și la distanță de notocord sau endoderm faringian10.

Morfogeneza mușchilor cuprinde trei procese: schimbarea poziției precursorilor mușchilor de la situsul inițial la cel unde are loc diferențierea finală, gruparea și alinierea miotubulilor primari și separarea mușchilor individuali împreună cu țesutul conjunctiv înconjurător. Modalitățile prin care celulele musculare pot ajunge de la situsul inițial la cel definitiv sunt variate: migrarea mioblastelor la nivelul membrelor și feței, expansiunea straturilor sau a cordoanelor de precursori miogenici pentru a forma peretele anterior și mușchii cu origine branhială și schimbarea poziției unei condensări de celule musculare diferențiate. În unele cazuri, există o asociere între aceste procese10.

Migrarea mioblastelor este inițiată la nivelul unor situsuri specifice întâlnite în miotomele laterale (occipital, cervical, branhial). În general, sunt implicate în emigrarea celulelor gena pax-3, factorii de transcripție lbx1, paraxis și six1, dar și receptorii c-Met și CXCR410.

Toți mușchii craniofaciali părăsesc situsul inițial, dar acest proces nu include migrarea individuală a mioblastelor. Pe traiectul lor către arcurile branhiale, celulele crestei neurale acoperă precursorii musculari și împreună cu aceștia capătă o direcție ventrală. În cordonul celular se găsesc angioblaste dispersate, dar nu și vase de sânge. La scurt timp, axonii motori penetrează cordonul celular miogenic10.

Următoarea fază a morfogenezei musculare, segregarea mușchilor din populația progenitoare comună, este anticipată de alinierea diferită a miocitelor elongate și a miotubulilor primari de la nivelul condensărilor mezodermale. Platoul muscular de la nivelul primului arc branhial conține miotubuli, care au orientare diferită în funcție de localizare. Asimetriile morfologice identifică precursorii specifici fiecărui mușchi în parte, care, ulterior, se va separa de precursorul comun. Simultan cu această aliniere, țesutul conjunctiv derivat din crestele neurale penetrează țesutul muscular. Acest lucru are loc la interfața dintre miotubulii situați periferic și evidențiază situsul de separare al mușchilor. În această etapă, primordiul muscular inițial avascular este invadat de celule endoteliale. Baza moleculară a procesului de aliniere și separare nu este decât parțial cunoscută10.

Atât separarea țesutul muscular în structuri de sine stătătoare, care prefigurează viitorii mușchi craniofaciali, cât și formarea structurilor prin care se vor atașa scheletului branhial este coordonată de semnale de la nivelul țesutului conjunctiv derivat din creasta neurală10.

Morfogeneza mușchilor craniofaciali este un proces de lungă durată, prin care unele celule musculare realizează legături la distanță de locusul branhial inițial. Koentges și Lumsden, în anul 1996, au realizat o sinteză detaliată a deplasărilor celulare, în care au arătat că populațiile celulare miogenice și ale crestei neurale mențin o poziție apropiată de cea inițială, chiar și după ce părăsesc arcul din care se dezvoltă. Acestea realizează legături cu structura de suport scheletică din arcurile branhiale, mezodermul cartilaginos laringeal, neurocraniu și umăr. Această asociere între celule cu potențial miogenic și precursorul țesutului conjunctiv provenit din celulele crestei neurale se realizează doar după ce arcul branhial a fost impregnat complet de celulele crestale, care au circumscris fiecare platou muscular în parte10.

Remodelarea ulterioară a structurilor musculare de legătură se realizază indepent de creasta neurală. Mecanismele prin care musculatura se desprinde, pentru ca apoi să se reatașeze de alte structuri scheletale nu sunt cunoscute10.

Creșterea și dezvoltarea mușchilor masticatori

Diferențierea musculaturii scheletice începe în săptămâna a VII-a de sarcină și se termină în săptămâna a XXII-a, când fibrele musculare ajung să aibă structura lor tipică. La scurt timp de la debutul diferențierii, de-a lungul fibrelor musculare striate se formează conexiuni nervoase. Cu toate acestea, maturarea plăcii motorii și dobândirea activității funcționale normale au loc abia la sfârșitul lunii a VII-a. Filetele nervoase senzitive se dezvoltă și se diferențiază înaintea plăcii motorii. Mai mult, contracțiile musculare reflexe declanșate de stimulii de la suprafața corpului pot fi observate înaintea maturizării complete a plăcii motorii11.

Harrison susține că diferențierea inițială a fibrelor musculare are loc și în absența inervației, dar Eastlick demonstrează într-un studiu mai recent că diferențierea completă și grupare în fascicule are loc numai în prezența filetelor nervoase. În absența inervației, fibrele musculare nu se mai dezvoltă de la un anumit punct și încep să sufere un proces de degenerare11.

Inițial, dezvoltarea are loc independent de elementele scheletale de suport de care se atașează în stadiile următoare. Dezvoltarea mușchilor scheletici are loc chiar și în absența structurilor de suport, pe care, ulterior, ar trebui să se insere. Hall susține și demonstrează ipoteza conform căreia dezvoltarea structurilor cartilaginoase adiacente influențează primele stadii ale diferențierii ale mușchilor masticatori. La mamifere se observă că dezvoltarea mușchilor masticatori se face în funcție de cartilajul lui Meckel și abia apoi apar conexiunile cu osul mandibular11.

La începutul perioadei fetale, mușchii striați cresc fie prin diviziunea fibrelor aflate în dezvoltare, fie prin diferențierea celulelor generatoare de țesut muscular. După luna a IV-a de sarcină, creșterea musculară se realizează pe baza hipertrofiei fibrelor, care își măresc lungimea și diametrul. Până în perioada adultă, mușchiul maseter ajunge să aibă o grosime de 4 ori mai mare și o secțiune transversală chiar de 8 ori mai mare decât o avea individul la vârsta de 1 an. Această creștere se datorează pe de-o parte hipertrofiei fibrelor individuale, iar pe de altă parte dezvoltării țesutului fibros și substanței tendinoase care separă fasciculele între ele. În perioada adultă, fiecare fibră ajunge să aibă o grosime de 2-3 ori mai mare decât la vârsta de 1 an. În timpul copilăriei, fibrele prezintă o variabilitate mai mare a dimensiunilor, deoarece o parte rămân ca în perioada fetală. Tot în această perioadă, creșterea musculară se realizează prin 3 procese: dezvoltarea fibrelor de dimensiuni fetale realizată cel mai probabil prin maturizarea completă a conexiunilor nervoase; dezvoltarea anumitor fibre de dimensiuni normale până la valorile din viața adultă; creșterea cantității de țesut fibros între și în jurul fasciculelor musculare11.

Haines consideră că fibrele musculare cresc longitudinal proporțional cu dezvoltarea osului pe care este atașat. De asemenea, consideră că surplusul de substanță se transformă în tendon. Speidel susține teoria enunțată de Haines, considerând că tendonul este un derivat al celulelor musculare11.

Creșterea în lățime și cea în lungime a mușchilor masticatori sunt două procese diferite. Suprafața mare a originii mușchiului temporal și a inserției mușchiului maseter se datorează creșterii în lățime a masei musculare. Inserția mușchiului temporal și a pterigoidianului extern se realizează, în principal, prin intermediul tendonului, suprafața pe care se atașează fiind mult mai redusă. Creșterea longitudinală a mușchilor masticatori, prin hipertrofia fibrelor individuale sau prin substanța tendinoasă, este în strânsă legătură cu două cartilaje de la nivelul craniului. Astfel, cartilajul condilian separă originile și inserțiile mușchiului maseter, pterigoidianului intern și ale fibrelor verticale ale mușchiului temporal, iar cele ale pterigoidianului extern și ale fibrelor orizontale ale mușchiului temporal sunt separate de sincondroza sfeno-occipitală. Dezvoltarea continuă a acestei sincondroze creează spațiu pentru creșterea mușchilor masticatori între coloana vertebrală și masivul facial. Dezvoltarea laterală a arcadei zigomatice face același lucru11.

Se cunoaște faptul că dezvoltarea musculară este strâns legată de inervația motorie. Aceasta, la rândul ei, se dezvoltă sub influența fibrelor senzoriale. În cazul mușchilor masticatori, impulsurile senzoriale care acționează asupra celulelor nervoase motorii provin de la nivelul tegumentului feței și mucoasei orale, de la mușchi în sine prin fibre proprioceptive, de la dinții și structurile de suport parodontal. Sherrington a realizat un studiu pe pisici decerebrate, prin care a demonstrat că stimuli aplicați pe gingie, palat dur și dinți au declanșat mișcări de deschidere și închidere a gurii. Ariile reflexe musculare susțin implicarea mușchilor în dezvoltarea feței și a dentiției. Mai mult de atât, acestea se află în legătură cu tiparul dentiției11.

Anatomia mușchilor masticatori

Mușchii masticatori aparțin aparatului dento-maxilar, fiind localizați în zona laterală a extremității cefalice, cu dispunere între mușchii paravertebrali și cei ai mimicii. Aceștia sunt mușchi mobilizatori ai mandibulei implicați în majoritatea mișcărilor: propulsie, retropulsie, ridicare, lateralitate, chiar și în cea de coborâre prin mușchiul pterigoidian lateral care o inițiază12.

Cei mai importanți mușchi implicați în masticație sunt cunoscuți sub denumirea de mușchi masticatori: mușchii maseter, temporal, pterigoidian medial și pterigoidian lateral. Aceștia prezintă anumite caracteristici comune: (a) au origine branhială, deoarece se formează din primul arc, numit arc mandibular; (b) primesc inervație din nervul arcului mandibular, nervul mandibular, cea de-a III-a ramură a trigemenului; (c) sunt mușchi multipenați, excepție făcând pterigoidianul lateral (fibre paralele)12.

Mușchiul maseter

Mușchiul maseter este situat pe fața externă a ramului mandibular, dispus între osul zigomatic, arcada zigomatică și marginea inferioară a ramului. Este un mușchi pentapenat, suprasuficient. Dispoziția fibrelor sale duce la apariția unei părți superficiale și a uneia profunde12.

Partea superficială a mușchiului maseter este puternică, lungă și dispusă oblic infero-posterior. Din punct de vedere structural, prezintă trei planuri de penație, care realizează originea pe osul și arcada zigomatică. Originea mușchiului se află pe marginea postero-inferioară a osului malar (marginea maseterină), marginea inferioară și fața internă a procesului temporal al malarului până la sutura temporo-zigomatică și este realizată printr-o aponevroză lată, groasă, puternică, fasciculată, a cărei față internă asigură origine fibrelor musculare. Inserția maseterului este una mixtă: fibrele anterioare au inserție musculară directă pe fața externă a ramului mandibular până la marginea inferioară a acestuia, iar cele posterioare prezintă o inserție aponevrotică pe fața externă a unghiului mandibular, unde formează creste osoase oblice. Porțiunea superficială este implicată în mișcările de ridicare și propulsie12.

Partea profundă este dispusă vertical și depășește partea superficială înspre posterior. În ceea ce privește structura, are două planuri de penație. Originea este pe arcada zigomatică, pe fața internă a acesteia, adiacent marginii inferioare. Un număr redus de fibre musculare se atașează pe aponevroza temporală, pe fața profundă. Inserția este influențată de originea fibrelor astfel: (1) inserare pe fața externă a ramului mandibular până la incizură, deasupra părții superficiale, a fibrelor care pornesc de pe arcada zigomatică; (2) inserare pe baza procesului coronoid, pe fața externă a acesteia, a celor care pornesc de la nivelul feței profunde a aponevrozei temporale. Porțiunea profundă maseterină participă doar la mișcarea de ridicare a mandibulei12.

Mușchiul maseter prezintă dublă înclinație: una raportată la planul parasagital, cealaltă la o linie verticală dusă prin marginea anterioară a ramului mandibular12.

Musculatura maseterină realizează un unghi de 10° cu planul parasagital, care străbate ramul maxilarului inferior. Acesta împreună cu mușchiul pterigoidian medial, mușchi masticator cu inserție pe fața internă a ramului, care prezintă o înclinație de 30° față de planul menționat mai sus, formează chinga pterigomaseterină, care poate dezvolta o forță musculară de 43 de kg12.

Cea de-a doua înclinație este raportată la linia verticală dusă prin marginea anterioară a ramului, care pornește de la planul zigomatic, formează un unghi de 8° cu planul orizontal, apoi coboară și face un unghi drept cu planul ocluzal. Această înclinație realizează un unghi de 90° cu planurile zigomatic și masticator și unul de 15° cu rezultanta musculară maseterină, care poate fi descompusă în două componente: protracție și elevație12.

Musculatura maseterină este una de forță, cu o lungime a fibrelor de 26,7 mm și o secțiune fiziologică de 2,76 cm². Astfel, este implicată în deplasarea mandibulei în trei direcții: (1) în mișcarea de ridicare cu o forță egală cu 27,6 kg; (2) în cea de propulsie cu o forță de 7,4 kg, realizată doar prin fibrele superficiale; (3) în mișcarea de lateralitate cu o forță de 4,9 kg, realizată de contracția unilaterală a mușchiului12.

Inervația este asigurată prin nervul maseterin, care se desprinde din trunchiul anterior al nervului mandibular în spațiul interpterigoidian, trece prin orificiul lui Hyrtl, își continuă traiectul între fața superioară a mușchiului pterigoidian lateral și exobază, apoi traversează incizura mandibulei ajungând între partea superficială și profundă a mușchiului maseter. Vascularizația este realizată de artera maseterină, ramură desprinsă din artera maxilară și venele care îi corespund12.

Raporturi

La exteriorul feței laterale se găsește fascia maseterină atașată de marginea inferioară a arcului zigomatic și de ramul mandibular la nivelul marginilor inferioară, anterioară și posterioară. Pe fața superficială a fasciei își au originea mușchiul rizorius, fibre din mușchiul zigomatic mare și platysma. Fascia se dedublează, cuprinzând în acest spațiu ductul parotidian Stenon și uneori vasele transverse ale feței. Porțiunea posterioară a acestei fețe are raport cu lobul superficial al glandei parotide12.

Fața medială are raport direct cu fața externă a ramului mandibular și cu mănunchiul vascular și nervos maseterin12.

Marginea anterioară este intersectată de ductul Stenon, care ajunge profund de corpul adipos al obrazului, unde va perfora fața externă a mușchiului buccinator12.

Marginea posterioară are raport cu glanda parotidă și doar în porțiunea inferioară cu bandeleta interglandulară, care separă cele două glande salivare mari, glanda parotidă și submandibulară12.

Mușchiul temporal

Mușchiul temporal se întinde de la planul temporal până la ramul mandibular, având un traiect descendent între creasta infratemporală și arcada zigomatică12.

Planul temporal este reprezentat de elemente osoase, care se articulează între ele prin suturi: fața externă a parietalului și a scuamei temporale, fața temporală a frontalului și a aripii mari sfenoidale. Acest plan este delimitat de linia temporală superioară și cea inferioară, linia temporală a osului frontal, sutura sfenozigomatică, creasta infratemporală și creasta supramastoidiană12.

Originea mușchiului temporal este osoasă și fascială. Originea osoasă se regăsește pe planul temporal până la linia temporală inferioară, reprezentând limita sa superioară. Fibrele se pot atașa direct sau cu ajutorul unor fascicule tendinoase scurte, care se găsesc în special la nivelul crestei infratemporale și al porțiunii inferioare a aripii mari sfenoidale. Fibrele care trec în grosimea mușchiului la nivelul feței profunde a lamei tendinoase, responsabilă de structura bipenată, ajung apoi împreună până la procesul cronoid. Originea fascială cuprinde fibre scurte prinse pe fața profundă a fasciei temporale12.

Inserția se realizează prin lama tendinoasă puternică, reprezentând tendonul terminal al mușchiului, care se prinde la nivelul: (a) feței interne a procesului coronoid, pe care o depășește spre inferior; (b) fosei retromolare a lui Bünthe—Morand—Fischer; (c) crestei temporale; (d) marginii anterioare a ramului mandibular, întinzându-se uneori până la limita posterioară a liniei oblice. Fibrele care își au originea pe porțiunea inferioară a planului temporal și creasta infratemporală pot să formeze un fascicul separat cu inserție pe fața internă a procesului coronoid și a ramului mandibular12.

Mușchiul temporal are aspect de evantai dat de origine și inserție, cu o dispoziție oblică postero-inferioară a fibrelor anterioare, verticală a celor mijlocii și oblică antero-inferioară a celor posterioare, orientate aproape orizontal12.

Fibrele anterioare realizează un unghi de 10° deschis inferior cu planul sagital și un unghi cu aceeași valoare, dar deschis superior cu planul frontal. Astfel, pot fi efectuate mișcările de ridicare și propulsie a mandibulei 12.

Fibrele mijlocii, cu dispoziție verticală, sunt implicate în mișcarea de ridicare a mandibulei, iar cele posterioare în retropulsia acesteia12.

Mușchiul temporal este, de asemenea, unul de forță cu o lungimea fibrelor de 36,1 mm și o secțiune fiziologică de 3,6 cm². Astfel, are posibilitatea de a dezvolta o forță musculară egală cu 36 kg. Rezultanta musculară poate fi descompusă în următoarele componente: ridicare cu o forță de 26 kg; propulsie cu o forță de 2 kg; lateralitate, care printr-o contracție sinergică cu a mușchiului pterigoidian medial ipsilateral, duce la deplasarea medială a mandibulei cu 3 kg forță12.

Inervația este realizată de nervii temporali profunzi: anterior, mijlociu și posterior, ramuri desprinse din trunchiului anterior al nervului mandibular. Aceștia se orientează către lateral, trec prin orificiul lui Hyrtl, apoi între exobază și fața superioară a mușchiului pterigoidian lateral ajungând până la creasta infratemporală, iar după o schimbare bruscă a direcției urcă pe fața internă a mușchiului temporal12.

Raporturi

Mușchiul temporal este dispus atât în regiunea temporală, cât și în cea infratemporală, astfel, va avea raporturi superficiale și profunde în ambele zone12.

Regiunea temporală are raporturi superficiale și profunde:

Raporturi superficiale: (1) tegument cu o parte antero-inferioară neacoperită de păr și una postero-superioară, cu mobilitate redusă pe planurile profunde, acoperită de păr; (2) strat redus de țesut conjunctivo-adipos care cuprinde artera temporală superficială, ramurile sale terminale – ramura anterioară, frontală și posterioară, parietală și un ram colateral, artera zigomatico-orbitală; pe lângă vase arteriale se găsesc și venele temporale superficiale, vase limfatice, nervii auriculo-temporal desprins din nervul mandibular și trunchiul temporo-facial al nervului cranian VII; (3) aponevroza epicraniană la nivelul căreia își au originea mușchii auricular anterior și superior, parieto-temporal; (4) strat de țesut adipos care separă aponevroza de fascia temporală; (5) fascia temporală – membrană tendinoasă, alb-sidefie, care are o rezistență rezultată din dedublarea periostului în dreptul liniei temporale superioare; se atașează inferior pe arcada zigomatică, se dedublează și reprezintă parțial sediul mușchiului temporal12.

Raporturi profunde cu planul vasculo-nervos: artere, vene și nervi temporali profunzi; periost; plan osos temporal12.

Regiunea infratemporală, la rândul său, prezintă raporturi superficiale și profunde:

Raporturi superficiale în regiunea infratemporală: (1) lateral: arcada zigomatică și m. maseter; (2) posterior: incizura mandibulei, traversată de mănunchiul vasculo-nervos maseterin; (3) anterior: o prelungire a corpului adipos al obrazului insinuată în partea inferioară a fosei temporale, între mușchiul și fascia temporală12.

Raporturi profunde în regiunea infratemporală cu mușchiul pterigoidian lateral12.

Mușchiul pterigoidian medial

Mușchiul pterigoidian medial se întinde între fosa pterigoidiană și fața medială a unghiului mandibular. Este un mușchi hexapenat, suprasuficient, gros, cu formă patrulateră. Are orientare oblică de sus în jos, dinainte înapoi și de la medial către lateral. Prin această dispunere formează un unghi de 30° cu ramul mandibular12.

Originea complexă este realizată prin: (1) două lame aponevrotice atașate pe fețele care se privesc ale lamelor procesului pterigoidian (mai puțin pe cea medială); de la acest nivel pornesc fibre musculare cu o dispoziție oblică; (2) un tendon rezultat din unirea anterioară a lamelor aponevrotive, care se va insera pe fața posterioară a procesului piramidal al osului palatin; (3) altă lamă aponevrotică, subțire, care pornește de pe tuberozitatea maxilară, în vecinătatea suturii cu osul palatin12.

Inserția mușchiului pterigoidian medial se realizează pe fața medială a ramului mandibulei, limitată anterior de șanțul milohioidian și superior de gaura mandibulară, direct prin fibre musculare și trei lame aponevrotice atașate pe crestele tuberozității pterigoidiene. Originea comună a mușchilor masticatori explică existența fibrelor musculare care trec din pterigoidianul medial în maseter și invers12.

În structura mușchiului pterigoidian medial sunt șase lame aponevrotice: trei de la origine, trei de pe ramul mandibular. La acest nivel, fibrele musculare se prind oblic, realizând un unghi de 10°12.

Mușchiul prezintă dublă oblicitate: una laterală prin care formează un unghi de 30° deschis superior cu ramul mandibulei și una posterioară de 10° față de planul frontal traversat de originea mușchiului12.

Pterigoidianul medial este un mușchi de forță, suprasuficient, cu o lungime a fibrelor de 17,7 mm și o secțiune fiziologică de 1,5 cm², care poate dezvolta o forță musculară de 15 kg. Rezultanta musculară are următoarele componente: mișcarea de ridicare realizată cu o forță egală cu 15,4 kg; mișcarea de propulsie realizată cu o forță egală cu 2,7 kg; mișcarea de lateralitate în contracție unilaterală cu o forță de 8,9 kg. Pterigoidianul medial este sinergic cu mușchiul maseter contralateral și antagonist cu cel ipsilateral 12.

Inervația este asigurată de ramul pterigoidian medial din trunchiul anterior al nervului mandibular, care se orientează către medial și străbate orificiul lui Civinini pentru a pătrunde în mușchi pe fața sa externă12.

Raporturi

Fața antero-laterală a mușchiului se află în raport cu aponevroza interpterigoidiană care este strâns legată de fascia mușchiului. Aponevroza este patrulateră, cu o grosime variabilă. Aceasta are o dispoziție oblică, patru margini și două fețe: (a) marginea superioară se prinde de baza craniană, pe marginea posterioară a scizurii pietrotimpanice, pe fața internă a procesului spinos al sfenoidului, medial de gaura ovală și rotundă mică; la acest nivel se interpune între originea m. pterigoidian medial și cea a m. tensor al vălului palatin. În porțiunea anterioară, aponevroza prezintă o îngroșare numită ligamentul pterigospinos Civinini, relicva fibroasă a mușchiului pterigospinos. Între ligamentul pterigospinos și fața infratemporală a aripii mari sfenoidale, există o prelungire, o lamă fascială subțire numită fascia cribrosa; (b) marginea anterioară, dinspre superior către inferior prezintă un segment cu inserție pe marginea posterioară a lamei laterale pterigoidiene, un segment liber și unul scurt atașat pe extremitatea inferioară a crestei temporale, înapoia ultimului molar; (c) marginea posterioară se întinde între buza posterioară a fisurii pietrotimpanice și limita posterioară a crestei pterigoidiene de pe fața internă a ramului mandibular. Aproape de această margine, aponevroza interpterigoidiană prezintă două condensări: ligamentul sfeno-mandibular și cel timpano-mandibular Juvara. (d) marginea inferioară are orientare antero-inferioroară și inserție pe fața medială a ramului mandibular, superior de inserția m. pterigoidian medial; (e) fața postero-medială are raport cu mușchii pterigoidian medial și tensor al vălului palatin; (f) fața antero-laterală are raport cu mușchiul pterigoidian lateral, cu aponevroza pterigo-temporo-mandibulară, care îi căptușește fața internă12.

Fața postero-medială participă la formarea peretelui lateral al regiunii paraamigdaliene și are raport cu elementele acestei regiuni: n. glosofaringian, a. faringiană ascendentă, a. palatină ascendentă și ramuri tonsilare, cotul a. faciale, polul posterior al glandei submandibulare și prelungirea faringiană a glandei parotide, uneori și cu ramul lingual al facialului care are traiect pe sub polul inferior al amigdalei palatine12.

Mușchiul pterigoidian lateral

Mușchiul pterigoidian lateral se întinde de la procesul pterigoidian și aripa mare a sfenoidului până la procesul condilar mandibular și discul ATM. Este un mușchi conic, scurt, gros, fără structură penată, cu fibre musculare paralele, care formează un fascicul superior și unul inferior12.

Originea este realizată prin fibre musculare și lame tendinoase astfel: fasciculul superior pe fața infratemporală a aripii mari a sfenoidului și creasta infratemporală; fasciculul inferior pe 2/3 inferioare ale lamei laterale pterigoidiene, pe procesul piramidal al osului palatinul și regiunea apropiată tuberozitară12.

Inserția celor două fascicule se realizează separat: fasciculul superior, orizontal, cu direcție postero-laterală, se inseră pe partea anterioară a discului articular și în foseta pterigoidiană a procesului condilian mandibular; fasciculul inferior, ale cărui fibre sunt orientate oblic ascendent, are direcție postero-laterală și se inseră prin fibre aponevrotice pe foseta pterigoidiană; între fascicule se creează un spațiu triunghiular traversat de artera maxilară12.

Mușchiul pterigoidian lateral este unul bifascicular, având fibre paralele în fiecare fascicul, cu o lungime medie de 22,8 mm și o secțiunea fiziologică de 1,5 cm², datorită căreia poate dezvolta o forță musculară de 15 kg12.

Rezultanta musculară este compusă din: (1) mișcarea de propulsie 13,2 kg: fasciculul superior 3,2 kg, iar cel inferior 10 kg; (2) inițierea coborârii mandibulei 3,6 kg; (3) mișcarea de lateralitate spre medial, în contracție unilaterală 10 kg: fascicul superior 2,1 kg, iar cel inferior 7,5 kg12.

De inervație este responsabil nervul cu același nume, ram din n. mandibular, desprins odată cu nervul bucal și temporal anterior profund dintr-un trunchi comun. Prezintă un filet pentru fiecare fascicul12.

Raporturi

Fața medială are raport, prin intermediul aponevrozei pterigo-temporo-mandibulare, cu spațiul interpterigoidian și conținutul său. Aponevroza este patrulateră, mai subțire decât cea interpterigoidiană, tapetează fața internă a pterigoidianului lateral si formează peretele antero-lateral al spațiului interperigoidian. Cele patru margini ale aponevrozei se atașează de structurile vecine astfel: (1) marginea anterioară se prinde pe marginea posterioară a lamei laterale pterigoidiene; (2) marginea posterioară se prinde pe procesul condilian al ramului mandibular; (3) marginea inferioară se confundă cu fascia de pe fața internă a m. pterigoidian lateral; (4) marginea superioară prezintă un segment postero-lateral lung fixat la baza craniului de la tuberculul articular al temporalului până la gaura ovală și un segment antero-medial, liber, condensat, între gaura ovală și apofiza lui Hyrtl de pe marginea posterioară a lamei laterale pterigoidiene12.

Fața laterală, din spate în față, are raport cu: (1) articulația temporomandibulară; (2) mănunchiul vasculo-nervos-maseterin; (3) fața medială a procesului coronoid cu inserția mușchiului temporal; (4) vasele transverse ale feței; (5) corpul adipos al obrazului12.

Histologia țesutului muscular striat

Celulele sau fibrele musculare poartă denumirea de miocite. Ele se diferențiază pentru a forma unul dintre cele trei tipuri de mușchi: scheletic, cardiac sau neted. Musculatura cardiacă și cea scheletică mai sunt cunoscute sub denumirea de musculatură striată datorită aspectului de pe imaginile microscopice. Aspectul striat se datorează organizării actinei și miozinei sub forma unor structuri repetitive, regulate, numite sarcomere. Aceste striații lipsesc în musculatura netedă deoarece actina și miozina nu formează sarcomere13.

Mușchiul scheletic este format din mănunchiuri de celule alungite, multinucleate învelite într-o teacă de colagen. Tipul de organizare îi permite țesutului striat să genereze contracții puternice de 100 W/kg de țesut, dar limitează variațiile dimensionale din timpul contracției, permițând o scurtare a fibrelor de maxim 30%. Pentru mișcări de contracție mai ample este necesar să se realizeze un sistem de pârghii, care să o facă posibilă. Mușchiul scheletic primește inervație din nervi motori și este catalogat ca mușchi voluntar, deoarece contracțiile sunt, în general, sub control voluntar13.

Fiecare fibră musculară este înconjurată de o teacă subțire de țesut conjunctiv formată, în principal, din lamina bazală și fibre de reticulină, numită endomisium. Fibrele musculare se grupează în fascicule, care, la rândul lor, sunt acoperite de un strat de țesut conjunctiv – perimisium. La exterior, mușchiul este înconjurat de o teacă groasă, densă de țesut conjuctiv numită epimisum, care se continuă la exterior cu fascia musculară și la interior cu peri și endomisium14.

Fibrele musculare sunt, de fapt, celule multinucleate gigante rezultate din fuziunea mioblastelor. Fibrele sunt alungite, cilindrice cu o dimensiune constantă în cadrul aceluiași mușchi, dar care variază de la un mușchi la altul. Diametrul poate avea valori de la 10-100 µ, iar lungimea de la mm la cm. Celulele musculare sunt așezate paralel cu axul lung, orientat de-a lungul direcției de mișcare a mușchiului respectiv13.

Celulele musculare au formă cilindrică, sunt neramificate si așezate paralel unele cu altele. Prezintă numeroși nuclei care sunt asezați la periferia celulei, în apropierea membranei celulare. Aceștia au o dispoziție ordonată, fiind dispuși alternativ. Nucleii sunt ovalari, eucromatici și se evidențiază între sarcolemă și miofibre. Se pot observa în abundență în jurul joncțiunii neuromusculare14.

Fiecare fibră are o membrană plasmatică, numită sarcolemă, care înconjoară sarcoplasma (citoplasma). În sarcoplasmă se regăsește sistemul contractil, organizat în miofibrile cu un diametru de 1-2 microni, care asigură alungirea fibrei. Cea mai mare parte a citoplasmei este ocupată de miofibrile, organitele specifice celulei musculare, care dau aspectul striat al citoplasmei. Între sarcolemă și membrana bazală se regăsește un tip special de celule – celule satelite miogene14.

Pe o secțiune transversală celulele musculare au un aspect poligonal. În funcție de nivelul la care s-a efectuat secțiunea, numărul de nuclei poate varia, putând fi observați unu, doi sau trei nulei. Pe aceeași secțiune, miofibrilele vor apărea, la nivel citoplasmatic, sub forma unor puncte separate de fante citoplasmatice Pe o secțiune tranversală se evidențiază un număr redus de nuclei, dar pe una longitudinală se pot observa și câteva sute14.

Structuri specifice

Miofibrilele sunt organite specifice țesutului muscular, reprezentând forma de organizare a sistemului contractil. Au formă cilindrică, diametru de 1-2 µ și traiect paralel cu axul lung al fibrei musculare. Miofibrilele prezintă aspect heterogen, o alternanță de benzi clare (banda I) și întunecate (banda A), care dau striațiile transversale caracteristice mușchiului scheletic13.

La nivelul miofibrilei se pot observa: (1) banda întunecată, banda A sau anizotropă; (2) la jumătatea acestei benzi există o regiune mai palidă, banda H, care la rândul ei are în mijloc banda M; (3) banda clară sau banda I, izotropă și la mijlocul ei banda Z, care delimitează sarcomerele. Un sarcomer este alcătuit dintr-o bandă A întreagă și câte o jumătate din benzile I adiacente la capete. Banda I este cea care se scurtează în timpul contracției14.

Miofilamentele reprezintă agregate de complexe supramoleculare formate din proteine contractile și reglatoare, la care se daugă alte structuri de suport. Miofilamentele pot fi subțiri formate din actină sau groase formate din miozină. Filamentele subțiri sunt formate din actină și proteine reglatoare (tropomiozina și troponina). Fiecare monomer de actină posedă un loc de interacțiune cu miozina. Filamentele groase conțin doar molecule de miozină. Moleculele de miozină sunt asamblate pentru a da naștere unor filamente groase în seturi antiparalele (jumătate orientate într-o direcție, iar cealaltă jumătate în direcție opusă)14.

Organite comune Fibrele musculare scheletice conțin pe lângă miofibrile alte organite cu importanță funcțională. Printre acestea se numără ribozomii, aparatul Golgi și mitocondriile. Acestea sunt localizate predominat în jurul nucleilor, între miofibrile și sarcolemă13.

Vascularizație

Mănunchiul vasculo-nervos pătrunde în profunzimea mușchiului. De la acest nivel, vasele sanguine se ramifică în țesutul conjunctiv, dau naștere arterelor de calibru mic și arteriolelor către septurile perimisiumului și apoi capilarelor în endomisium. Vasele mici au traiect paralel cu fibra musculară, în principal, dar formează și anastomozeze sub forma unei rețele elongate13.

În funcție de vascularizație, mușchii se împart în 5 categorii: tip I – un singur pedicul vascular la nivelul pântecelui muscular; tip II – pedicul vascular dominant și câțiva pediculi cu calibru mic; tip III – doi pediculi dominanți care provin din artere diferite; tip IV – pediculi mici multipli, care separat, fiecare în parte, nu pot asigura necesarul vascular; tip V – pedicul vascular dominant și pediculi secundari segmentari mulipli13.

Numărul de capilare din vecinătatea fibrelor variază de la 0 la 3 pe o secțiune transversală. Variabilitatea numerică de la un mușchi la altul este influențată de funcțiile și solicitările la care este expus13.

Venele se ramifică în același fel ca arterele pe care le însoțesc13.

Drenajul limfatic începe prin capilarele limfatice care se evidențiază în epimisium și perimisium, dar nu și în endomisium. Ulterior, aceastea fuzionează și formează vase limfatice de calibru mai mare, care însoțesc rețeaua venoasă și care drenează în ganglioni limfatici regionali13.

Inervație

Inervația este asigurată de unul sau mai mulți nervi motori. Aceștia trec printre epimisium și perimisium în drumul lor către țesutul endomisial, care înconjoară fibrele. De-a lungul traseului pe care îl străbat, se ramifică, iar ramurile terminale formează cu fibra musculară o sinapsă specializată, numită joncțiune neuromusculară. O ramură terminală corespunde unei singure fibre musculare, astfel potențialul de acțiune este transmis la toate fibrele musculare, pe care neuronul le inervează. În acest fel, putem vedea ramificațiile nervoase și fibrele corespunzătoare ca o structură funcțională unitară, numită unitatea motorie. Acest aspect poate explica contracția mai mult sau mai puțin simultană a fibrelor aparținând aceluiași mușchi13.

Ultrastructura fibrei musculare scheletice

În secolul XVII, Anton van Leeuwenhoeh prezintă primul său microscop optic și pune bazele studiilor structurale microscopice. Prin intermediul microscopului creat de el, ale cărui lentile aveau o putere de mărire de trei ori, descrie structura celulelor sanguine și a fibrelor musculare. Cercetările și descoperirile în acest domeniu au continuat, iar trei secole mai târziu, Ernst August Friedrich Ruska prezintă microscopul electronic și deschide drumul către cunoșterea ultrastructurii celulare.

Conceptele moderne în ceea ce privește structura musculaturii striate s-au dezvoltat pe baza pe cercetărilor realizate de Bennett și Porter, Bennett și colab. Numeroase publicații recente din domeniul științific au abordat ultrastructura țesutului muscular striat la mai multe specii de animale. Printre acestea se numără și lucrarea lui Van Breemen, care a analizat țesut muscular uman normal utilizând microscopia electronică, pentru a completa datele citologice comparative și a oferi un punct de plecare pentru alte studii ultrastructurale de țesut muscular normal, dar și patologic.

Astfel, van Breeman în lucrarea sa, utilizând microscopia electronică, de-a lungul unei perioade de 5 ani, a analizat 55 de fragmente, dintre care 10 fără modificări patologice, de țesut muscular prelevate de la om. În sala de operație, imediat după excizie, s-a realizat imersia în soluție de fixare a fragmentelor musculare prelevate. Din piesa musculară recoltată, o parte a fost pregătită pentru microscopul optic, prin fixare cu formalină, iar o parte pentru cel electronic, prin fixare cu tetraoxid de osmiu. Fragmentul care a fost studiat prin microscopie electronică, mai exact la microscopul electronic Philips 100A și 100B, a fost deshidratat, înglobat în metacrilat și secționat la 0.025 µ cu un ultramicrotom Porter-Blum. Pentru realizarea imaginilor microscopice a utilizat o piesă bioptică prelevată din mușchiul gastrocnemian aparținând unei persoane de sex masculin, în vârstă de 5 ani. Ulterior, aceasta a fost fixată cu tetraoxid de osmiu 1% timp de 2 ore și jumătate. Examinarea la nivel ultrastructural a probelor musculare recoltate de la pacienți cu o vârstă mai mare de 5 ani a condus la rezultate similare. Cei 10 pacienți de la care s-au prelevat mostrele de țesut muscular normal aveau vârste cuprinse între 5 și 45 de ani, cu o medie de 11 ani15.

Fibrele mușchiului gastrocnemian sunt formate din miofibrile, care prezintă proprietăți comune cu alte specii: miofilamente, benzi Z de legătură între sarcomere și benzile M, A, I vizualizate în miofibrile relaxate. Miofibrilele necontractate prezintă striații care sunt aproape la același nivel de la o fibrilă la alta. Acest lucru a putut fi observat și în diferite stadii ale contracției musculare. Benzile Z sunt dense și relativ late. Miofilamentele par să fie una în continuarea celeilalte la nivelul lor, lăsând impresia că densitatea benzilor Z provine din aglomerarea de miofilamente. Miofilamentele sunt dense, eventual cu diametru crescut, la nivelul benzilor Z, dar și la nivelul benzilor M într-o proporție mai redusă. Examinările miofilamentelor în diferite planuri evidențiază o variație a dimensiunilor benzilor A15.

Variația dimensională a miofilamentelor în perioada de relaxare susține ipoteza dublei organizări a filamentelor în mușchii striați enunțată de Huxley. Chiar dacă nu este complet elucidat mecanismul prin care miofilamentele participă la contracția musculară, se consideră că acestea și adenozin-trifosfatul sunt strâns legate de procesul contractil15.

Clasificarea fibrelor musculature scheletale

Musculatura striată a mamiferelor este foarte diversificată, acest lucru creând dificultăți în realizarea unei clasificări a fibrelor componente. Mult timp s-a utilizat o clasificare simplă: fibrele lente erau considerate roșii, iar cele rapide albe. Aceasta nu era nici pe departe aproape de situația reală, în care fibrele musculare pot fi separate în multe categorii16.

S-a încercat de nenumărate ori să se găsească o asociere între clasificările realizate de fiecare disciplină pentru a le îngloba pe toate într-una singură. Astfel, Peter și colab., au studiat țesut muscular care conținea aproape în totalitate un singur tip histochimic de fibre și au corelat proprietățile lor histochimice cu cele biochimice și contractile. Eisenberg și colab. au utilizat același tip de mușchi scheletic prelevat de la porcușori de guineea pentru a compara ultrastructura cu proprietățile biochimice și contractile. Burke și colab. au studiat un alt tip de țesut muscular, un mușchi mixt, pentru a compara proprietățile fiziologice cu cele histochimice. Ei au făcut următorul experiment: au stimulat neuronul motor care inervează mușchiul mixt pentru a identifica modificările histochimice – depleția glicogenului- care apar la nivelul unității motorii. Studiul și clasificarea fibrelor musculare, mai ales din punct de vedere histochimic, au aplicație practică, putând fi utilizate în diagnosticare patologiei neuromusculare16.

În ultima perioadă, cercetările s-au concentrat asupra modificărilor care apar la nivelul țesutului normal în diferite situații clinice: stres patologic, efort fizic, stimulare cronică, inervație încrucișată, denervare și în timpul bolilor. Multitudinea de situții în care apar aceste modificări îngreunează foarte mult realizarea unei clasificări, care să cuprindă toți parametrii. În legătură cu acest subiect, Huxley spunea că este mai mult decât evident că la mamifere se găsesc mai mult de două tipuri de fibre și că trebuie investigat dacă există totuși un număr finit de categorii sau un întreg spectru a cărui variație este continuă. Variabilitatea se referă la structură, viteza de contracție, tipul de inervație și de răspuns electric16.

Țesutul muscular striat acoperă un întreg spectru funcțional din punct de vedere al proprităților mecanice, deci ar fi normal ca acest lucru să se întâmple si din punct de vedere anatomic, adică fibrele componente să acopere un spectru, nu să fie grupate în categorii diferite. Organitele celulare pot să aibă un număr mai crescut sau mai scăzut la nivelul unei celule musculare, din această variație numerică, rezultând o infinitate de celule musculare diferite între ele. Pentru a stabili cu certitudine existența acestui spectru, se realizează histograme pe baza datelor colectate din celulele fiecărui sistem16.

Componentele fibrei musculare

Sarcolema

În anul 1840, Bowman folosește pentru prima dată termenul de sarcolemă pentru a denumi membrana care înconjoară fibra musculară16.

Sarcolema a fost vizualizată pentru prima dată la microscopul electronic de către Bennett și Porter. Ca urmare a examinării a fost descrisă ca fiind o membrană fină atașată de fibra musculară, înconjurată, la rândul ei, de un strat de colagen aderent, neregulat. Ultrastructura sarcolemei este cel mai bine vizualizată prin tehnica „freeze fracture” sau prin scanarea la microscopul electronic, ambele metode evidențiind mai multe aspecte decât secțiunile plate utilizate în microscopia electronică. Replicarea și scanarea la electronomicroscop permit să fie vizualizat stratul superficial și orificiile de deschidere ale sistemului transversal de tubuli. Prin tehnica „freeze fracture” se pot vizualiza particulele invaginate în interiorul membranei. Totuși, utilizând tehnicile clasice ale microscopiei electronice, se pot vedea, imediat sub membrana celulară, numeroase depresiuni sferice, denumite, de Dulhunty și Franzini-Armstrong, caveole. Nu se cunoaște încă rolul lor. Cu ajutorul unor markeri s-a verificat implicarea lor în pinocitoză, dar rezultatul a fost unul negativ, deoarece aceștia nu au fost absorbiți ulterior16.

Aspectul sarcolemei care înconjoară fibrele musculare sănătoase este omogen. Această imagine omogenă este întreruptă doar la nivelul joncțiunilor neuromusculare și la nivelul inserțiilor tendinoase. La nivelul joncțiunii neuromusculare, sarcolema prezintă depresiuni adânci la nivelul cărora variază dispoziția particulelor intramembranoase16.

Grosimea sarcolemei umane este de aproximativ 8 µ. Pe secțiune, aceasta apare ca o linie fină, neregulată, care se modifică în funcție de contracția miofibrilelor. Sarcolema este acoperită de un strat omogen cu densitate redusă, a cărui grosime poate varia de la 0-1 µ până la 30 µ. Acest strat extern al sarcolemei are o limită exterioară imprecis delimitată. Fibrele reticulare ale endomisiumului se află în continuarea stratului extern, putând fi chiar fixate la acest nivel. Stratul extern a fost denumit „strat cuticular” și este similar membranelor bazale15.

Sarcoplasma

Fibrele musculare multinucleate prezintă la exterior sarcolema, membrana care le separă de mediul extracelular. Sarcolema este formată din două structuri aflate în contact strâns: membrana plasmatică și lamina bazală. Membrana plasmatică este orientată către interiorul fibrei, iar lamina bazală se găsește la exteriorul ei17.

Lamina bazală, secretată de celulele musculare, apare ca un strat amorf sau fin granular, de 20-30 nm grosime. În compoziția ei intră glicoproteine, colagen, laminine și proteoglicani sulfatați. Sub lamina bazală (lamina densa) se observă lamina lucida, care asigură legătura cu plasmalema prin punți fine17.

Plasmalema este o membrană excitabilă alcătuită dintr-un bistrat lipidic la nivelul căruia se observă canale ionice și structurale, receptori și proteine implicate în metabolism. Plasmalema pătrunde în fibra musculară sub forma sistemului tubular transvers, astfel transportând potențialul de acțiune în interiorul acesteia. La acest nivel se observă filamentele intermediare care înconjoară și leagă miofibrielele între ele și de sarcolemă la nivelul liniei Z. Prin tehnica de criofracturare, se poate examina detaliat distribuția proteinelor de la nivelul plasmalemei. La o astfel de examinare, proteinele apar ca particule intramembranare sau pori pe fața internă și externă a membranei. Prin aceeași tehnică de criofracturare, se observă că plasmalema prezintă pe fața internă invaginații de dimensiuni reduse numite caveole. La microscopia electronică de transmisie, caveolele sunt descrise ca o aglomerare de vezicule mici aflate în continuarea feței interne a plasmalemei și care se deschid în spațiul extracelular. Caveolele se observă în special la nivelul benzii clare I17.

Sarcolema prezintă variații morfologice în zone specializate ale fibrei musculare. La nivelul joncțiunii miotendinoase devine plicaturată și fuzionează cu linia Z, iar la nivelul joncțiunii neuromusculare pătrunde în fanta postsinaptică, iar lamina bazală separă placa motorie de axonul terminal. Plasmalema prezintă invaginații și la nivelul celulelor satelite, celule mononucleate nediferențiate cu atribute de celule stem17.

Nucleu

În general, celulele musculare umane au majoritatea nucleilor localizați sub sarcolemă, un număr redus găsindu-se în interiorul fibrei. Nucleii sunt structuri alungite, ovalare, paralele cu miofibrilele, de aproximativ 5 µ lungime. Membrana nucleară este dublă, prezintă numeroase pliuri și pori membranari prin care se realizează transportul bidirecțional al ARN-ului și al proteinelor. Nucleolema se continuă cu reticulul endoplasmic, care, la rândul său, se continuă cu reticulul sarcoplasmic. Cromatina, cunoscută sub denumirea de heterocromatină, este condensată, cu aspect granular și conține materialul ADN. Heterocromatina se atașează de membrana nucleară. Eucromatina, cromatina activă metabolic, este localizată în zonele interne mai palide împreună cu matricea nucleară. Fiecare nucleu prezintă unu sau doi nucleoli17.

Miofibrile

Miofibrilele reprezintă componenta majoră a fibrei musculare, ocupând 85-90% din volumul ei. Miofibrilele sunt organite specifice țesutului muscular, forma de organizare a sistemului contractil. Au formă cilindrică, diametru de 1-2 µ și traiect paralel cu axul lung al fibrei musculare. Miofibrilele prezintă aspect heterogen, o alternanță de benzi clare și întunecate care dau striațiile transversale caracteristice mușchiului scheletic13.

Miofibrele nu pot fi evidențiate la un examen de microscopie optică de rutină, dar pot fi intuite din striațiile tranversale. Mai mult prezența lor poate fi demonstrată prin utilizarea coloranților speciali sau a luminii polarizate care poate diferenția benzile întunecate (benzile A) de cele luminoase (benzi I). Pe o secțiune transversală, fibrele sunt poligonale cu aspect punctat dat de miofibrilele secționate. Densitatea fibrelor musculare variază foarte mult, este redusă în mușchii extrinseci ai laringelui și crescută în mușchii ridicători ai mandibulei. Pentru o examinare detaliată a miofibrilelor la nivel ultrastructural se utilizează microscopia eletronică de transmisie13.

Pe o secțiune longitudinală vizualizată electromicroscopic, miofibrilele prezintă întreruperi regulate datorate unor linii întunecate transversale fine, cunoscute sub denumirea de linii sau discuri Z, care împart miofibrila în sarcomere. Sarcomerele sunt unități contractile care se repetă regulat la nivelul unei miofibrile, cu o lungime de 2.2 μ în repaus. Sarcomerele sunt formate din filamente subțiri și groase. Filamentele subțiri sunt compuse, în principal, din actină, iar cele groase din miozină. Filamentele subțiri și groase se suprapun parțial, dar pot fi diferențiate unele de celelalte datorită conținutului proteic diferit, a cărui densitate electronică este variabilă. Banda A este compusă din filamente groase printre care pătrund filamente subțiri la oricare dintre capete. Porțiunea ei centrală este nepătrunsă de filamente subțiri, are un aspect mai palid și poartă denumirea de zona H. Filamentele groase cu localizare centrală sunt legate între ele de linia M – material cu dispoziție transversală. Banda I este formată doar din filamentele subțiri aparținând sarcomerelor adiacente. Filamentele subțiri sunt ancorate în discul Z, linia de demarcație dintre două sarcomere13.

Pe secțiune transversală, filamentele de miozină formează o rețea hexagonală printre care pătrund filamente de actină în zonele periferice. Pe măsură ce ne apropiem de linia Z, aspectul rețelei formate numai din filamente de actină devine din hexagon pătrat13.

Mitocondrii

Mitocondriile sau „uzinele energetice” ale celulei sunt organite la nivelul cărora au loc procesele de oxidare.

În musculatura striată, mitocondriile pot fi localizate la periferia celulelor musculare, imediat sub membrana sarcolemală – mitocondrii subsarcolemale – sau în profunzimea lor, printre miofibrile – mitocondrii intermiofibrilare. Mitocondriile subsarcolemale reprezintă o populație bine dezvoltată implicată în preluarea O2 din circulația arterială. Se consideră că acestea sunt responsabile de furnizarea energiei necesare menținerii integrității membranei sarcolemale. De asemenea, mitocondriile subsarcolemale sunt implicate în schimburile de ioni și metaboliți de la nivelul sarcolemei. Cea de-a doua populație de mitocondrii, cea intermiofibrilară localizată în profunzimea celulelelor musculare printre elementele contractile, are activitate mai intensă per unitate decât cea subsarcolemală, având un rol important în asigurarea necesarului de ATP din timpul contracției musculare18.

O lungă perioadă de timp s-a crezut că mitocondriile sunt organite cu aspect capsular discret, idee bazată pe imagini de microscopie electronică în secțiuni transversale și pe imaginea mitocondriilor izolate. Ulterior această ipoteză a fost contrazisă. În anul 1978, cercetătorii ruși Bakeeva, Chentsov și Skulachev publică un articol pe baza unei analize realizate pe mușchi diafragmatic în care susțin că mitocondriile formează o rețea, un reticul mitocondrial asemănător cu cel sarcoplasmic. Aceștia consideră că o celulă musculară are un număr redus de mitocondrii subsarcolemale și intermiofibrilare cu multe ramificații care le conectează și nu sute de mitocondrii. Același lucru a fost observat de Bekerly și Babraham analizând o serie de secțiuni transversale ale mușchiului solear de șobolan. Cercetările au fost extinse pe biopsii de țesut muscular uman, iar rezultatele au arătat prezența reticulului mitocondrial pe secțiuni transversale18.

Cercetătorul Hans Hoppeler și colab. realizează o analiză ultrastructurală a țesutului muscular prin care evidențiază schimbul de O2 între capilare și reticulul mitocondrial. Mai mult, aceștia susțin ideea că cele două componente ale reticulului mitocondrial – subsarcolemală și intermiofibrilară – ocupă aproximativ același volum într-o celulă musculară18.

Reticul sarcoplasmic

Într-un articol realizat de Eisenberg și colab., reticulul sarcoplasmic este vizibil, pe secțiuni fine, sub forma unor vezicule sau a unor tubuli disecați transversal. Aceste contururi se evidențiază oriunde de-a lungul miofibrilei, dar localizarea lor tipică este la capetele benzilor A. Tubulii nu pot fi văzuți pe toată lungimea lor pe nicio secțiune. Cu toate acestea, analiza secțiunilor consecutive recoltate evidențiază faptul că veziculele sunt conectate între ele prin tubuli foarte subțiri și că legăturile laterale din jurul miofibrilelor au diametru mai mare și sunt mai numeroase decât cele longitudinale. Conexiunile dintre reticulul sarcoplasmic și striațiile miofibrilelor, benzile M și Z, sunt de dimensiuni foarte mici, aspect care a îngreunat evidențierea lor. De aici rezultă necesitatea unor investigații ulterioare, deoarece până în prezent nu s-au realizat studii amănunțite16.

Membrana reticulului sarcoplasmic neted, agranular seamănă mai mult cu cea a aparatului Golgi decât cu cea a reticulului endoplasmic din alte celule. Aceeași mențiune a fost făcută si de Andersson în cercetările sale. Primii care au enunțat ideea conform căreia ar exista o conexiune între cele două organite celulare, aparatul Golgi și reticulul endoplasmic, au fost Ramon y Cajal și Fusari, aceasta fiind susținută ulterior de mulți alți cercetători. Bowen a susținut teoria lui Ramon y Cajal și Fusari fiind de părere că reticulul endoplasmic neted reprezintă apartul Golgi în țesutul muscular striat. Alți cercetători, Beams și Macdougald, de exemplu, au infirmat ipoteza Cajal-Fusari considerând că nu poate fi făcută nicio legătură între aparatul Golgi și reticulul endoplasmic din mușchii striați. Revizuirea ideii unei posibile asocieri între cele două organite ar putea fi benefică pentru biochimia țesutului muscular striat. Totuși, teoria enunțată de Ramon y Cajal și Fusari trebuie menționată atunci când există o discuție despre reticulul sarcoplasmic16.

Sistemul membranar al reticulului sarcoplasmic înalt specializat este conectat cu sistemul contractil cu înaltă specializare al miofibrilelor din compoziția țesutului muscular striat. Reticulul sarcoplasmic a fost vizualizat ca un sistem de vezicule limitate de membrane, tubuli și cisterne care formează o structură reticulară continuă, ca o mânecă de dantelă care înconjoară miofibrilele. Numeroase studii susțin că sistemul membranar reticular este în strânsă legătură cu benzile Z și M, dar și că sarcolema este conectată cu benzile Z. Aceste afirmații au dat curs speculațiilor în ceea ce privește funcția lui16.

Au existat ipoteze care au susținut că reticulul sarcoplasmic este implicat în schimburile dintre miofibrile și sarcoplasmă și că se comportă ca un sistem intern de conducere. Pornind de la combinarea afirmațiilor menționate mai sus, Edwards, Ruska, Santos și Vallejo-Freire au dezvoltat următoarea teorie: reticulul sarcoplasmic, cel mai probabil împreună cu sistemul acid adenilic–Mg²⁺, este implicat în schimbul ionic, în conducerea excitației intracelular și, din punct de vedere funcțional, influențează cantitatea și scurtarea sarcomerelor. Porter și Palade au luat în considerare ambele posibilități: reticulul sarcoplasmic acționează sub influența unei excitații adecvate sau în funcție de necesarul de metaboliți al miofibrilelor. Au afirmat că ambele variante sunt posibile, dar au dat mai mult credit celei din urmă, considerând că membrana reticulului sarcoplasmic asigură mai degrabă conducerea impulsurilor excitatorii decât difuzia metaboliților la nivel celular. Celula musculară a fost utilizată de Ruska, Edwards și Caesar pentru a demonstra rolul endomembranelor în trasmiterea excitației și pentru a crea o ipoteză general valabilă a conducerii impulsurilor excitatorii intracelulare16.

Organite veziculo-vacuolare

Microcirculația, prin intermediul rețelei vaste de capilare, asigură schimbul de substanțe nutritive și de produși de catabolism între sânge și țesuturi. Endoteliul capilarelor are o permeabilitate selectivă, care restricționează pasajul macromoleculeor, dar nu și pe cel al moleculelor mici. Moleculele, în funcție de caracteristici, pot urma diferite căi de traversare a peretului capilar: moleculele hidrofile sub 3 mm diametru trec printre joncțiunile endoteliale intacte, cele liposolubile difuzează prin membrana celulară, iar alte tipuri de molecule folosesc mecanisme de transport specifice. Macromoleculele, cum sunt proteinele plasmatice, au capacitatea de a străbate peretele capilarelor mult mai redusă și pot face acest lucru fie prin vezicule prezente în celulele endoteliale, fie prin spațiile prezente între celulele endoteliale19.

Ulterior s-a descoperit un nou tip de organite celulare endoteliale care au fost denumite organite veziculo-vacuolare. Se pare că acestea reprezintă principala cale de extravazare a macromoleculelor la nivelul zonelor cu permebilitatea vasculară crescută indusă de factor de permeabilitate vasculară sau factor de creștere endotelială. Acest lucru a fost observat de Dvorak și colab. în venule de la nivelul țesuturilor tumorale obținute experimental. Aceeași echipă a evidențiat prezența organitelor veziculo-vacolare la animale de laborator în endoteliul venular ocular care prezenta o reacție alergică inflamatorie. Cercetări ulterioare realizate pe țesuturi umane bioptice la nivel ultrastructural au evidențiat prezența acestor organite în celulele endoteliale umane din vase de calibru mic. Existența lor a fost observată în țesuturi sănătoase, dar și patologice. Ca urmare a acestor descoperiri, s-au realizat numeroase studii bazate pe metode ultrastructurale în încercarea de a afla cât mai multe informații în legătură cu substructura și conținutul, modalitatea de formare și mecanismele de reglare a funcției lor19.

Formarea VVO

Asemănările existente între caveole și veziculele/vacuolele care alcătuiesc VVO, au condus la ipoteza care susține că VVO ar putea lua naștere ca urmare a fuziunii caveolelor individuale. Mai mult, există posibilitatea ca veziculele și vacuolele de dimensiuni mari să fie, de fapt, caveole care au fuzionat. Pentru a demonstra prima ipoteză, Vasile și colab. au analizat, in vivo și in vitro, dacă VVO prezintă caveolină. Rezultatele obținute au arătata că VVO conțin caveolină, deci prima ipoteză a fost confirmată. Pentru cea de-a doua ipoteză enunțată, Feng și colab. au realizat analize morfometrice la nivel ultrastructural. Prin intermediul măsurătorilor, s-a observat că veziculele și vacuolele prezintă o mare heterogenitate dimensională. Mai mult de atât, s-a arătat că mărimea veziculelor/vacuolelor corespunde unui număr variabil de vezicule de dimensiunea caveolelor fuzionate. Din cele menționate, reiese că veziculele și vacuolele VVO se formează în urma fuziunii caveolelor. Mecanismele care stau la baza fuziunii nu au fost elucidate încă. Studii suplimentare sunt necesare în aceste sens19.

Structura

În citoplasma celulelor endoteliale, organitele veziculo-vacuolare se grupează sub forma unor ciorchini de strugure situați la distanță unul de celălalt. Aceste organite se localizează frecvent în apropierea marginilor laterale ale celulelor endoteliale, unde creează o legătură directă între lumenul vascular și mediul extern. Pe o singură secțiune de microscopie electronică de 80 nm se observă un procent redus de organite veziculo-vacuolare care se extind din lumen până în plasma abluminală, dar pe secțiuni succesive acest procent ajunge aproape de 100%19. Organitele veziculo-vacuolare sunt formate din vezicule si vacuole unite prin membrane. Acestea sunt conectate unele cu altele și cu mebrana plasmatică a celulelor endoteliale prin mici orificii (stomate) închise de diafragme fine. Diafragmele stomatale au diametru mai redus decât al veziculelor sau vacuolelor din componența organitelor. Pentru a evidenția comunicarea directă dintre veziculele și vacuolele alăturate s-a utilizat un indicator – feritina. Rezultatele obținute au susținut această ipoteză, deoarece au arătat prezența indicatorului la nivelul organitelor și al stomatelor. Stomatele de legătură dintre vezicule și vacuole care erau închise de diafragme fine au restricționat pasajul macromoleculelor indicatoare și astfel au apărut și vezicule/vacuole fără urme de trasor. De aici se poate trage concluzia că diafragmele care separă stomatele pot restricționa trecerea moleculelor, fiind capabile să se închidă/deschidă individual19.

Structura organitelor veziculo-vacuolare nu a putut fi pe deplin studiată pe secțiuni standard de microscopie electronică (70-100 nm), motiv pentru care s-au realizat secțiuni ultrafine de 12-14 nm. Pornind de la seria de secțiuni ultrafine, Feng și colab. au realizat, printr-un program computerizat, reconstrucția 3D a rețelei de vezicule și vacuole interconectate. Pe reconstrucție s-a putut observa că rețeaua are un traseu continuu, sinuos de-a lungul endoteliului venulei, care prezintă extinderi atât luminal, cât și abluminal. Cercetările au continuat și s-a observat că organitele veziculo-vacuolare adiacente celulelor endoteliale prezintă un orificiu de deschidere către fanta interendotelială, uneori existând chiar conexiuni între organite la acest nivel. Din cele enunțate, poate rezulta ideea că plasma se poate extravaza prin rețeaua de organite veziculo-vacuolare19.

S-au realizat numeroase secțiuni electronomicroscopice ultrafine pentru a putea observa dispunerea organitelor și a componentelor din alcătuirea lor, pentru a realiza măsurători ale dimensiunii lor. Aceste analize s-au realizat, pe de-o parte pentru a investiga caracteristicile organitelor veziculo-vacuolare, iar pe de altă parte pentru a putea vedea dacă veziculele din alcătuirea lor pot fi considerate a fi corespondenți venulari ai caveolelor capilare19.

Organitele veziculo-vacuolare cutanate sunt structuri sesile, complexe, de dimensiuni mari ale căror componente nu își modifică poziția, nu se deplasează în citoplasmă, așa cum se întâmplă în cazul caveolelor capilare descrise de Palade. După examinarea numeroaselor secțiuni ultrafine, s-a ajuns la concluzia că >99% din vezicule erau atașate altor vezicule sau vacuole care intrau în componența organitelor veziculo-vacuolare, mai puțin de 1% fiind entități individuale19.

Dvorak și Feng împreună cu colaboratorii lor au realizat măsurători morfometrice, în urma cărora s-a arătat că organitele veziculo-vacuolare ocupă aproximativ 20% din citoplasma endotelială a venulelor și că organitele individuale se află la 1-2 µm unele de altele. Cu ajutorul secțiunilor seriate și al reconstrucției 3D, s-a văzut că un organit veziculo-vacuolar tipic este alcătuit din 124 de vezicule și un număr variabil de vacuole, care pornește de la 79 și poate trece de 400. S-a observat că veziculele din organite care aveau dimensiuni mici semănau cu caveolele descrise la nivel capilar. Veziculele și vacuolele aveau un diametru intern mediu de 108 +/- 32 nm. Prin comparație cu dimensiunile caveolelor capilare, se poate afirma că dimensiunile lor sunt mult mai mari și prezintă o variabilitate mai mare19.

Concluzionând, veziculele și vacuolele din organite se diferențiază de caveolele endoteliale prin mai multe aspecte: dimensiune medie mult mai mare, heterogenitatea dimensiunilor mult mai mare, organizarea lor sub forma organitelor veziculo-vacuolare care ocupă mare parte din citoplasma vacuolară și care conectează lumenul vascular de zona abluminală19.

Funcții

Venulele din țesuturile sănătoase permit o extravazare minimă a macromoleculelor circulante. Indiferent de tipul de țesut, normal sau patologic, organitele veziculo-vacuolare din venule au aceeași structură. Diferențele apar la nivel funcțional, deoarece organitele din celulele endoteliale sănătoase limitează trecerea macromoleculelor circulante spre deosebire de cele tumorale. Studiile realizate până în prezent au enunțat ipoteza conform căreia diferența de funcționalitate are la bază implicarea unor mediatori chimici vasoactivi: factor de permeabilitate vasculară/creștere endotelială vasculară în cazul tumorilor, histamina și serotonina în cazul reacțiilor alergice. Mediatorii menționați cresc permeabilitatea vasculară prin favorizarea deschiderii stomatelor de la nivelul organitele veziculo-vacuolare, dintre vezicule și vacuole, dar și a celor care creează o legătură luminal-abluminală. Prin studii experimentale, s-a demonstrat că injectarea în țesut sănătos a oricăruia dintre mediatorii de mai sus a crescut permeabilitatea vasculară pentru macromoleculele circulante la fel ca în cazul celulelor tumorale. Ulterior s-au realizat secțiuni pentru microscopul electronic în care s-a observat că stomatele dintre componentele organitelor și dintre membranele luminale și abluminale s-au deschis lăsând să treacă feritina (trasorul utilizat). S-a mai observat că o parte din diafragme s-au închis și că moleculele de feritină s-au acumulat în veziculele/vacuolele situate înaintea lor, ceea ce sugerează că diafragmele pot reprezenta o barieră în calea pasajului transcelular al macromoleculelor. Joncțiunile dintre celulele endoteliale nu au fost afectate și nu s-au observat macromolecule de feritină la acest nivel. Toate cele menționate conduc la ideea că organitele veziculo-vacuolare reprezintă principala cale prin care proteinele plasmatice solubile se extravazează din venule ca urmare ca hiperpermeabilității induse de mediatorii vasoactivi. Studii suplimentare sunt necesare pentru a elucida mecanismele biochimice prin care mediatorii vasoactivi duc la creșterea permeabilității vasculare la nivelul organitelor veziculo-vacuolare. Până în momentul de față se știe că aceștia intervin la nivelul stomatelor și al diafragmei stomatale19.

Celule stem

Celulele stem: definiție, caracteristici, clasificare

Definiție

Celulele stem sunt, prin definiție, celulele care dețin capacitatea de autoreînnoire și diferențiere într-o gamă largă de celule. Acestea sunt considerate a fi indispensabile pentru creșterea și dezvoltarea din perioada embrionară. Rolul lor nu se termină aici, deoarece acestea reprezintă resursă importantă pentru celulele diferențiate în perioada adultă20.

Conform Arun Kumar și colab., celule stem posedă capacitatea de a genera numerose linii celulare, de a se diferenția într-o multitudine de tipuri celulare și de a se autoreplica continuu de-a lungul vieții. Reprezintă un sistem de reparare internă a țesuturilor realizat prin capacitatea lor de a se diviza fără o limită, proprietate care le permite să furnizeze necesarul celular pe tot parcursul vieții. O populație stem nouă, prin proliferare pe parcursul a mai multor luni, poate să ducă la apariția a milioane de noi celule. De asemenea, se consideră că celulele rezultate care rămân nespecializate, așa cum au fost celulele din care au luat naștere, posedă capacitatea de reînnoire pe termen lung21.

Celule stem embrionare și adulte

Celulele stem își au originea în oul fecundat, o structură totipotentă capabilă să inducă formarea atât a țesuturilor intraembrionare, cât și a celor extraembrionare în timpul proceselor de creștere și dezvoltare. În perioada de maturare din cadrul embriogenezei, are loc determinarea, în urma căreia rezultă o varietate largă de celule cu proprietăți specifice, capabile să dea naștere diferitelor țesuturi și organe. De exemplu, celulele stem embrionare sunt pluripotente, adică au capacitatea de a da naștere tuturor structurilor intraembrionare, dar nu și a celor extraembrionare (placenta). În perioada de maturare embrionară, apar celulele stem multipotente cu o capacitate crescută, dar mai restrânsă decât a celor pluripotente de a produce celule diferențiate. Un exemplu de celule stem multipotente ar putea fi cele hematopoietice, care dau naștere fluxului sanguin în perioada intrauterină, au capacitatea de a se diferenția în orice tip de celulă sanguină pe parcursul vieții, dar nu pot da naștere unor celule care să formeze alte organe. Această capacitate de diferențiere limitată ne duce cu gândul la faptul că sunt celule stem adulte la origine. Din cele prezentate rezultă că celulele stem sunt indispensabile pentru dezvoltarea embrionului și pentru susținerea țesuturilor adulte, acest rol esențial datorându-se proprietăților mitotice20.

Proprietățile celulelor stem

Celulele stem sunt definite prin propritățile lor fundamentale: capacitatea de a se autoregenera, de a prolifera și de a se diferenția. La baza acestora stă un proces de diviziune asimetric: dintr-o celulă stem rezultă o copie identică și o celulă progenitoare. Celula fiică identică cu celula mamă susține capacitatea de autoregenerare, iar celula progenitoare pe cea de diferențiere. În acest fel se menține constant numărul de celule stem. La baza diviziunii asimetrice stau două procese, unul intrinsec – separarea asimetrică a componentelor intracelulare și altul extrinsec – rolul pe care trebuie săîl îndeplinească în afara nișei stem22.

Celulele stem sunt relativ nediferențiate, nu posedă proprietățile funcționale specifice celulelor progenitoare care iau naștere urma diviziunii22.

Celulele stem reprezintă punctul de pornire al regenerării tisulare. Printr-un proces unidirecțional de multiplicare și diferențiere acestea asigură necesarul celular.Se consideră că celulele stem au capacitate crescută de a da naștere clonelor, dar posedă un ciclu celular lent. Dintr-o celulă stem iau naștere un număr limitat de progenitori, care își mențin capacitatea de proliferare până în momentul când vor ajunge celule mature, diferențiate22.

Componentele mediului în care se află, ale nișei stem, influențează diviziunea asimetrică a celulelor stem prin intermediul unor mecanisme fizice directe și paracrine. Celulele sunt ancorate în acest micromediu prin intermediul unor joncțiuni specializate al căror centrozom, prin orientarea sa determină direcția fusului mitotic – viitoarea locație a celulei fiice și acces la semnalele extrinseci existente la nivelul nișei22.

Pe lângă caracteristicile definitorii ale celulelor stem, capacitatea de autoreînnoire și diferențiere, recent se încearcă să se demonstreze că acestea prezintă și proprietatea de transdiferențiere, adică celulele dintr-un organ sau țesut să se diferențiere și să dea naștere unor celule/țesuturi cu totul diferite de cele inițiale. În acest sens, trebuie să se evidențieze celulele stem specifice unui țesut, apoi să se izoleze celule stem, progenitorii lor, dar și celulele fiice din țesutul/organul transdiferențiat. Numeroase studii clinice și articole de specialitate au fost realizate pe această temă până în prezent,dar încă există neconcordanțe și teoria nu a fost confirmată23.

O lungă perioadă de timp s-a considerat că doar celulele stem embrionare pot da naștere oricărei linii celulare la mamifere, cele adulte având o capacitate limitată. Studii publicate recent susțin că celulele stem adulte hematopoietice și neurale pot da naștere celulelor sanguine, respectiv celulelor sistemului nervos central, dar și altor tipuri cum ar fi: celulele hepatice, intestinale, cardiace și musculare scheletale. Se consideră ca acest lucru se datorează procesului de transdiferențiere – extinderea potențialului de dezvoltare. Asta ne duce cu gândul la faptul că celulele stem adulte pot avea un potențial mult mai mare decât s-a crezut, poate chiar asemănător cu al celulelor embrionare. Dacă acest lucru se dovedește a fi adevărat, celule stem adulte ar putea fi utilizate terapeutic în locul locul celor embrionare făcându-le mult mai ușor de acceptat pentru societate24.

Ying ,Terada și colab.lorconsiderăcă fenomenul de transdiferențiere menționat mai suseste, de fapt, un proces de fuziune între celule stem adulte și embrionare prin care cele adulte preiau propritățile celor embrionare. Susțin că s-a creat o confuzie și că această fuziune a fost luată drept o transdiferențiere. Având în vedere numerosele aspecte încă necunoscute, se observă necesitatea unor studii suplimentare genetice pentru a putea confirma sau infirma ipotezele 24.

Clasificare

Clasificarea generală a celulelor stem cuprinde 3 categorii: (1) celule stem embrionare; (2) celule stem adulte sau somatice; (3)celule stem pluripotente induse sau iPSCs21.

Celulele stem embrionare își au originea în celulele totipotente sau în embrionii mamiferelor din stadiile timpurii. Acestea pot prolifera nelimitat și nediferențiat in vitro21.

Celulele stem adulte pot lua naștere din diferite părți ale corpului. Originea și locul apariției lor au mare influențează asupra funcțiilor. Sunt prezente în țesuturi precum emisferele cerebrale, măduva spinării și sânge21.

Celulele stem pluripotente induse sunt considerate a fi adevăratele celule stem deoarece au capacitatea de a se diferenția în aproape orice celulă din organism. Cu alte cuvinte, celulele stem pluripotente provenite din cele stem adulte prin intermediul unor factori embrionici de transcripție pot fi reprogramate21.

O altă clasificare a celulelor stem poate fi făcută în funcție de abilitatea lor de regenerare. Potențialul de autoregenerarea al celulelor stem variază de la totipotente la unipotente. Celule stem totipotente sunt zigotul și celulele rezultate în următoarele două diviziuni capabile să formeze embrionul și trofoblastul placentar. Acestea încep să se specializeze, să se dividă și să dea naștere unui grup de celule considerate a fi pluripotente. Celulele stem pluripotente au potențial mai restrâns decât cele totipotente, acestea fiind capabile să se diferențieze în orice tip celular care ia naștere din straturile embrionare (ecto, mezo, endoderm), dar nu pot da naștere placentei și țesuturilor de suport. Celulele stem embrionare își au originea în această masă celulară internă. Țesuturile adulte conțin celule stem multipotente care se pot diferenția doar în anumite linii celulare în funcție de localizarea lor în organism. La baza piramidei se află celulele stem unipotente care au capacitatea de a se diferenția într-un singur tip celular. Având în vedere experimentele recente în care celulele somatice pot reveni la stadiul de pluripotență prin adăugare unor gene ale celulelor embrionare rezultând celulestem pluripotente induse, clasificarea în funcție de potențial nu este una exactă22.

Localizarea celulelor stem adulte

Celulele stem sunt prezente în majoritatea țesuturilor adulte:

Măduva osoasă cuprinde 3 populații celulare stem: hematopoietică, mezenchimală și celule endoteliale progenitoare22.

Sistemul muscular scheletic deține surse de celule stem multipotente cunoscute sub numele de celule stem conjuctive (pericite, țesut adipos, osos trabecular, cartilaginos și măduva hematogenă). Sursa de celule miogene implicate în creșterea și vindecarea postnatală a mușchilor striați este reprezentată de celule satelite unipotente care reprezintă 5% din totalul nucleilor din interiorul fibrelor musculare, localizați la periferia miofibrelor, sub membrana bazală22.

Tractul digestiv prezintă diferite surse de celule stem în funcție de localizare: (a) esofag – strat bazal papilar și bazal interpapilar aplatizat; (b) stomac – la baza celulelor formatoare de mucus; (c) intestin subțire – nișă stem în jurul criptelorintestinale; (d) intestin gros – la baza criptelor; (e) ficat – compartiment facultativ de celule stem la nivelul arborelui biliar intrahepatic22.

La nivelul tegumentului, celulele stem se găsesc dispersate printre celulele stratului bazal al epidermului22.

Glandele mamare conțin celule stem la nivelul ductelor terminale lobulo-alveolare. Acestea sunt celule bipotente care se pot diferenția în două linii celulare: celule luminale și mioepiteliale22.

La nivelul sistemului nervos central se evidențiază astrocitele care îndeplinesc, în principal, funcția de celule stem la nivelul creierului uman adult 22.

În tractul respirator, mai exact în plămâni se găsesc celule stem regiospecifice: pneumocitele de tip II sunt considerate celulele stem alveolare, deoarece sunt capabile să dea naștere pneumocitelor tip I și II22.

Nișe stem

Generalități

Ideea de nișă celulară stem s-a conturat în decada a VIII-a secolului trecut. Prima menționare îi aparține cercetătorului Schofield care a definit-o ca un micromediu care asigură condițiile fiziologice de supraviețuire pentru populațiile stem25.De atunci, interesul pentru acest subiect a crescut exponențial, astăzi existând numerose studii și articole care fac referire și susțin această ipoteză apărută din cauza neconcordanțelor care apar între experimentele in vivo și in vitro.

Nișa stem celulară poate fi definită ca mediul înconjurător celulelor stem care trebuie să le asigure un sistem de reglare prin semnale, reprezentat de totalitatea factorilor celulari și moleculari26. Existența eipoate fi considerată vitală pentru întreg organismul, deoarece celulele stem adulte prezente în majoritatea țesuturilor sunt implicate în homeostazie și reactivitate la stimulinocivi26.

Conform lucrării lui Scadden, nișa stem trebuie văzută ca o locație anatomică specifică care intervine în reglarea proceselor de regenerare tisulară, menținere și vindecare în care sunt implicate celulele stem de la nivelul ei. Pe de-o parte nișa protejează celulele stem de la epuizare, iar pe de altă parte împiedică proliferarea lor în exces27.

Organizarea, localizarea nișei și a celulelor stem nu a fost complet elucidată la mamiferele adulte. Aspecte precum organizarea structurală a nișei și apariția variațiilor structurale ca răspuns la agresiuni rămân încă neclarificate26.

Funcția și mecanismele de reglare

Nișa stem trebuie să fie un mediu bine organizat și înalt diferențiat pentru a controla capacitatea de autoregenerare și diferențiere a celulelor stem. Procesele de reglare și menținere a celulelor stem de la acest nivel sunt complexe și integrate. Semnalele către celulele stem pot fi transmise prin interacțiune directă între celulele stem și cele rezidente ale nișei, prin intermediul moleculelor prezente în matricea extracelulară și prin molecule autocrine, paracrine și endocrine26.

Funcțiile nișei stem includ reglarea numărului de celule stem, a ciclului celular, a motilității și a diferențierii. Se consideră că proliferare celulelor stem este menținută sub control prin feedback pozitiv și negativ prin intermediul progenitorilor și factorilor autocrini și paracrini28.

Nișa stem este definită de două dimensiuni: anatomică și funcțională, ambele fiind necesare pentru a asigura viabilitatea celulelor stem. Celule stem adulte (somatice) sunt limitate funcțional în afara nișei. Cel mai bun exemplu îl reprezintă celulele hematopoietice: sunt capabile să dea naștere celulelor sanguine și imunitare, dar în afara nișei funcțiile lor sunt limitate. Nișa stem trebuie să asigure o bună funcționare a mecanismelor de control în condiții fiziologice și patologice28.

Proprietățile specifice stem pot fi activate în interiorul nișei prin diferite semnale în funcție de tipul celular la care ne raportăm. Există celule stem care pot fi activate prin declanșarea unei singure căide semnalizare, dar majoritatea necesită acționarea pe mai multe căi. Durata de acțiune a acestor semnale este de scurtă durată, motiv pentru care celulele stem trebuie să se localize în interiorul nișei pentru a asigura autoreînnoirea de lungă durată. Menținerea celulelor stem în cadrul limitelor nișei este realizată în primul rând prin molecule de adeziune26.

În procesul de modulare al funcțiilor celulelor stem intervin elemente ale matricei extracelulare, factori paracrini, dar și modul de organizare al nișei la nivel structural și ultrastructural. Factorii paracrini care intervin în reglarea funcțională: wingless-related proteins(Wnt), antagoniștii lor- modulatorii solubili Notch, sonic hedgehog (SHH). La nivelul nișei stem există celule și glicoproteine matriceale care formează spații 3D conferind ultrastructura acesteia. Astfel se crează posibilitatea unor interacțiuni moleculare implicate în reglarea funcției celulare stem. În acest sens există mecanisme de control paracrin mediate de proteine secretate, dar și mecanisme mediate de factori non-proteici – produși de metabolism27.

Nișă specifică și nespecifică

Pornind de la structura anatomică, putem considera că există două tipuri de nișe implicate în modularea funcțiilor celulelor stem: (1) nișă specializată alcătuită dintr-un număr redus de celule, adiacentă celulelor stem și implicată în reglarea locală și (2) nișă nespecializată formată din celule mezenchimale (celule stem mezenchimale, adipocite, fibroblaști, celule endoteliale, neuroni, celule sanguine)28.

Nișa specializată împreună cu celulele stem se află pe o membrana bazală considerată a fi implicată în mecanisme directe de reglare al ciclului și al polarității celulelor stem. Mecanismele de control de la nivelul nișei nespecializate sunt multiple, complexe, au acțiune directă, dar și indirectă. Totuși pentru a demonstra contribuția celor două nișe la modularea funcțiilor celulelor stem sunt necesare studii amănunțite la nivel molecular ale mecanismelor de reglare atât în perioade de repaus, cât și în cele dinamice28.

Nișa stem perivasculară

Nomenclatură

În anul 1960, Kubara și Cogan au observat un tip special de celule la nivelul capilarelor din retină pe care le-au numit „celule murale”. S-a considerat inițial că se regăsesc numai la acest nivel. Studii ulterioare au arătat că sunt prezente de-a lungul întregului sistem vascular și astăzi sunt cunoscute sub denumirea de pericite29.

În structura capilară se găsesc celule endoteliale și alt tip celular în contact cu peretele extern care a fost studiat încă din secolul al XIX-lea. Pe cele din a II-a categorie Rouget le-a denumit celule adventițiale nepigmentate cu funcție contractilă și le-a evidențiat la nivelul tuturor țesuturilor prin studii pe animale de laborator. Printr-o simplă comparație a celulelor ilustrate de Rouget și a celor murale descrise de Kubara și Cogan un secol mai târziu se poate observa că sunt identice. În anul 1923, Zimmermann le denumește pericite datorită localizării în jurul vaselor mici29.

Odată cu apariția microscopului electronic, s-au putut diferenția exact pericitele de alte tipuri celulare pericapilare. Prin examinarea atentă electronomicroscopică, s-aobservat că acestea sunt localizate din loc în loc în membrana bazală și au ramificații protoplasmice care înconjoară peretele extern al capilarului. Diferiți cercetători le-au descris în țesuturi variate animale și umane: retină, iris, creier uman embrionar, țesut conjunctiv și muscular etc. 29

Microscopia electronică a demonstrat că pericitele sunt de fapt celulele murale descrise de Kubara și Cogan: prezintă aceeași distribuție, structură și componente celulare29.

Ca urmare, celulele din mebrana bazală nu ar trebui să mai fie denumite pericite sau celule pericapilare/perivasculare deoarece creează confuzie și nu oferă suficiente informații descriptive. Totuși, se păstrează termenul de „pericite” care face referire atât la celule din peretele vascular – pericite intramurale, cât și la cele aflate la exteriorul acestuia – pericite extramurale29.

Pericitele: heterogenitate și funcții

Pericitele sunt o populație celulară heterogenă, cu origine embriologică neuroectodermală sau mezodermală, număr și distribuție care variază de la organ la organ și profil care poate diferi de la o subpopulație la alta. În funcție de raportul lor cu pereții capilarelor, pericitele se împart în 3 categorii: precapilare, capilare adevărate și postcapilare30.

Criteriile pe baza cărora se identifică un grup de pericite sunt localizarea în vecinătatea celulelor endoteliale și markerii de suprafață . Anumiți markeri de suprafață se găsesc doar la pericite, iar alții se întâlnesc și la alte tipuri de celule. Printre markerii utilizați pentru identificarea pericitelor se numără αSMA, PDGRFβ, CD13 (aminopeptidaza N), proteoglicanul NG230.

Pericitele sunt celule conjunctive nediferențiate prezente la nivelul pereților vaselor sanguine de calibru mic, din majoritatea țesuturilor și organelor, care participă la menținerea viabilității tisulare. Deoarece sunt prezente la nivelul nișei și prezintă markeri similari celulelor stem mezenchimale in vivo și in vitro, suntconsiderate a fi celule stem mezenchimale. Acest lucru este susținut și de experimente care au arătat că celulele stem mezenchimale au origine perivasculară. S-a demonstrat că pericitele sunt implicate în formare de os și cartilaj, țesut muscular scheletic, țesut dentar și în accelerarea proceselor de vindecare. Pot genera linii celulare neuronale prin transdiferențiere și pot fi implicate în procese de regenerare tisulară fiind prezente la nivelul nișelor stem30.

S-a considerat, până de curând, că singura funcție a pericitelor ar fi aceea de a stabiliza microvascularizația. Ulterior, prin apariția metodelor de investigare care permit analiza genetică și imunohistochimică, s-au putut evidenția și alte roluri ale acestora: asigurăstabilizarea vaselor sanguine, reglează fluxul sanguin, participă la procesele de dezvoltare,maturare și remodelare vasculară, influențează permeabilitatea, participă la formarea barierei hemato-encefalice, influențează coagularea și activarea limfocitelor, fagocitoză30.

Numeroase studii indică implicarea pericitelor în geneza musculaturii scheletice. Alte studii merg chiar până la a susține că pericitele generează celule stem musculare(celule satelite). După transplantarea de pericite, o mică parte din acestea se deplasează sub membrana bazală a miofibrilelor și exprimă markeri de suprafață specifici celulelor satelite, ceea ce sugerează că pot ocupa nișa satelită în mușchi striați.Această proprietate poate fi generalizată și la pericitele din alte țesuturi. S-a evidențiat existența a două tipuri de pericite, tip 1 și 2, dintre care doar cel de-al doilea participă la formare de țesut muscular striat postraumatic30.

Mai multe dovezi susțin ipoteza că pericitele pot fi progenitori ai adipocitelor: (1) experimentul realizat de Richardson și colab. pe șobolani prin care au arătat că pericitele din țesutul adipos supuse unui traume termice s-au transformat în adipocite in situ; (2) creșterea vascularizației asociată cu adipogeneza in vivo; (3) pericitele cultivate în condiții favorabile dezvoltării adipocitelor încep să acumuleze granule lipidice și să exprime un factor de transcripție specific adipocitelor (PPARγ) și (4) adipocitele noi se formează de-a lungul vaselor sanguine. În plus, numeroase studii sugerează că progenitorii adipogeni sunt perivasculari. Așa cum am menționat la miogeneză, există două tipuri de pericite: tipul 2 participă la formare de țesut striat muscular, iar tipul 1 se pare că este implicat în adipogeneza de la nivelul țesutului muscular lezat30.

Numărul de pericite de la nivel cerebral este mult mai mare în comparație cu alte organe datorită vascularizației crescute de la acest nivel. Potențialul neurogenic al pericitelor a fost evidențiat inițial în hipocampusul primatelor după un episod ischemic. Recent a fost evidențiat in vitro pentru pericitele derivate din creier uman. De asemenea, s-a observat că prin reprogramare directă, in vitro, pericitele pot deveni neuroni postmitotici funcționali. Acest proces nu s-a demonstrat încă in vivo decât pentru celule gliale. Pe lângă pericitele de la nivelul sistemului nervos central și cele din alte țesuturi se pot diferenția în linii celulare neuronale. Astfel de exemple sunt aorta, țesutul adipos și muscular striat30.

În concluzie, pericitele sunt o populație de celule stem multipotente, ale cărei subpopulații sunt oligopotente fiind capabile să genereze anumite linii celulare specifice. Cercetări suplimentare sunt necesare pentru a putea verifica rezultatele obținute și la om, iar în acest scop trebuie evidențiați markeri specifici30.

Nișe stem musculare

Generalități

Capacitatea de regenerare a țesutului muscular scheletic după naștere a fost asociată cu celulele satelite – precursori musculari inactivi localizați sub membrana bazală a fiecărei fibre. Regenerarea tisulară este un proces care nu are loc în condiții fiziologice, fiind necesară doar în cazul unei leziuni. În aceste condiții celulele satelite devin active, se diferențiază și formează mioblaste care, la rândul lor, se diferențiază și fuzionează pentru a forma mionucleii necesari înlocuirii fibrelor distruse. Intervenția celulelor satelite, respectiv a mioblastelor,este necesară deoarece mionucleii sunt structuri diferențiate terminal, incapabile de a se autoînlocui. Paradoxal, celulele satelite transplantate produc în țesutul gazdă un număr de mionuclei aproximativ egal cu cel al celulelor satelite nediferențiate. Acestă observație combinată cu existența unui potențial miogenic al celulelor nonsatelite pune sub semnul întrebării rolul esențial al celulelor satelite în procesele de regenerare. Acest lucru poate sugera că celulele satelite nu sunt o sursă auto-suficientă, ci doar un progenitor miogen al cărei rezervă este suplimentată de celule stem interstițiale și circulante. Astfel, devine evidentă necesitatea descoperirii sursei de regenerare a celulelor satelite pentru a înțelege mecanismele de regenerare ale țesutului muscular 31.

Celulele satelite

Ipoteza conform căreia celulele satelite sunt precursori miogeni are la bază un studiu în care s-a utilizat timidină marcată și în care s-a urmărit distribuția ei la nivelul mușchilor aflați în procese de creștere și regenerare. Rezultatul acestui studiu a arătat că prin diviziune celulele satelite produc mionuclei în fibrele aflate în dezvoltare. Bischoff, Konisberg și colab. au ajuns la concluzia că la nivelul fibrelor musculare izolate mioblastele iau naștere direct din celulele satelite. Pentru acest experiment, fibrele musculare împreună cu celulele satelite localizate sub membrana bazală au fost izolate prin digestie enzimatică. Celulele satelite au fost cultivate, au proliferat pe mediul de cultură și au dat naștere mioblastelor care s-au diferențiat și au produs miotubuli multinucleați. Trei secole mai târziu, în anul 2005, Collins și colab. au transplantat fibre musculare individuale în mușchi, iar rezultatul obținut a fost în concordanță cu cele inițiale: celulele satelite sunt capabile să dea naștere fibrelor musculare de novo,dar și celulelor satelite. Din cele menționate mai sus, reiese că celulele satelite îndeplinesc criteriile de bază care definesc o celulă stem: capacitatea de autoregenerare și de a genera celule diferențiate 32.

Înainte de apariția metodelor de investigare la nivel molecular se utiliza microscopia electronică pentru identificarea celulelor satelite. Astfel, toate celulele situate sub membrana bazală a miofibrelor erau considerate a fi celule satelite. Astăzi, cu ajutorul markerilor moleculari se pot separa celulele satelite de alte celule prezente sublaminal. Transgena 3F-nlacZ-E marchează toți nucleii miofibrelor rapide cu β-galactozidază, deci prezența sau absența acesteia ne permite să identificăm populația de celule satelite dintr-o fibră musculară indiferent de expresia antigenică. O celulă satelită dintr-un țesut muscular matur sănătos nu prezintă activitate mitotică. Printre markerii exprimați se numără Pax7, caderina-M, CD34-, Myf5nlacZ/+, lisenina și caveolina-1. Dintre cei menționați, Pax-7 este cel mai utilizat în identificare celulelor satelite inactive deoarece este posibilă folosirea anticorpului specific. CD34 nu este un marker specific, dar facilitează separarea lor de alte populații celulare CD34+ 32.

Celulele satelite trebuie să se activeze pentru a-și îndeplini rolul funcțional- implicarea în procese de hipertrofie și vindecare musculară. După activare încep să exprime un marker suplimentar, MyoD și să prezinte o schimbare izoformă a CD34, pe lângă markerii prezenți înainte de activare. Ulterior, începe procesul de diviziune însoțit de exprimarea genelor tipice acestui proces (PCNA) și de apariția miogeninei care declanșează diferențierea. Alături de miogenină intervin factori structurali și reglatori ai expresiei genice specifici miocitelor. Momentul apariției Mrf4 nu este încă elucidat deoarece s-a observat că poate fi evidențiat atât înainte, cât și după activarea miogeninei 32.

Material și metodă de studiu

În studiul de față au fost utilizați trei iepuri Europeni (Oryctolagus cuniculus), de sex masculin, de 2.5 până la 3 kg, cu vârsta cuprins între 6 și 12 luni. După o săptămână de adaptare, animalele de laborator au fost separate în cuști individuale unde au primit hrană fără restricții și au fost expuse la cicluri alternative lumină/întuneric de câte 12 ore fiecare. După 8 zile au fost omorâți prin administrarea unei injectii intravenoase letale cu fenobarbital.

Pentru explorare în TEM fragmentele tisulare de circa 1-2 mm3 au fost prefixate în glutaraldehidă 4% proaspătă rece în tampon de cacodilat de sodiu, pH 7.4, 4 ore la 4oC. După fixare țesuturile au fost spălate de 6 ori în tampon de cacodilat de sodiu 0.05M, pH 7.4 la 4oC, apoi au fost postfixate în tetroxid de osmiu 2% în cacodilat de sodiu 0.1M la temperatura camerei timp de 2 ore și jumătate, colorate în bloc cu acetat de uranil apos 0.5% peste noapte la 4oC și spălate cu cacodilat de sodiu 0.05M. După deshidratare în serii gradate de etanol și infiltrare cu oxid de propilenă, specimenele au fost incluse în eter Glycid (echivalent Epon 812) și în final au fost polimerizate la 60oC timp de 48 de ore. Secțiunile semifine au fost colorate cu albastru de toluidină 1% pentru examinare în microscopie optică. Secțiunile ultrafine (80-100 nm) au fost tăiate cu un cuțit de diamant și au fost colectate pe grile de cupru cu 200 de ochiuri și au fost dublu contrastate, cu acetat de uranil și apoi cu citrat de plumb. Grilele au fost examinate într-un microscop electronic Philips EM 208S operat la un voltaj de accelerare de 80 kV. A fost utilizat un sistem de achiziție a imaginilor compus dintr-o cameră video Veleta și un software, iTEM Olympus Soft Imaging System.

Rezultate

În microscopia electronică de transmisie am identificat elementele ultrastructurale caracteristice miofibrilelor, acestea din urmă reprezentând structura dominantă a fibrelor musculare.

Fig. 7-1 – Secțiune longitudinală prin mușchiul maseter. Se pot observa numeroase miofibrile organizate în sarcomere. Mitocondriile se găsesc la periferia fibrei musculare aglomerate sub membrana sarcolemală dar sunt și mitocondrii dispersate printre miofibrile. Se observă mitocondrii alungite izolate sau grupate câte două.

Pe secțiuni longitudinale ale miofibrilelor am identificat liniile Z sau discurile Z, care au împărțit fiecare miofibrilă în sarcomere. Fiecare sarcomer a prezentat o bandă A întunecată împărțită în două părți egale de o linie M. Discurile/liniile Z au divizat benzi I clare.

Fig. 7-2- Secțiune longitudinală prin fibra musculară de maseter. Numeroase mitocondrii aglomerate sub membrana sarcolemală. Printre miofibrile se observă mitocondrii dispersate de dimensiuni variabile.

Fig. 7-3 – Secțiune longitudinală prin fibra musculară de maseter. Se observă numeroase mitocondrii subsarcolemale la periferia fibrei musculare. Mitocondrii de dimensiuni și forme variabile separate de membrana mitocondrială care prezintă în interior criste mitocondriale.

Am identificat repetat pe preparate clustere/grămezi de mitocondrii subsarcolemale. acestea au fost fie aplicate una pe alta, cu membranele mitocondriale externe alipite sau separate prin spații cu conținut granular electronodens având o dispoziție periodică. La nivelul clusterelor mitocondriale subsarcolemale peste fibrele musculare erau aplicate capilare endomisiale, de regulă tudi endoteliali lipsiți de pericite; celulele endoteliale au fost separate de sarcolema fibrelor musculare prin laminele bazale endotelială și sarcolemală între care am decelat o cantitate redusă sau nulă de fibre de colagen.

Fig. 7-4 – Secțiune longitudinală prin fibra musculară de maseter. Se observă organizarea în sarcomere separate de benzile fine întunecate Z și alternanța benzilor întunecate A cu a celor luminoase I. Mitocondrii dispersate printre miofibrile, przente mai ales la nivelul benzii Z. În porțiunea inferioară se observă o pereche de mitocondrii – 2 mitocondrii cuplate.

La nivelul clusterelor mitocondriale subsarcolemale am identificat structuri veziculare cu conținut clar, dispuse atât intermitocondrial cât și intramitocondrial. De asemenea, am decelat între mitocondrii microtubuli având atașate structuri proteice care prezentau un aspect rugos, electronodens. Au fost prezente de asemenea cisterne de reticul sarcoplasmic – reticul endotelial neted, cele din vecinătatea nucleului prezentând comunicări cu spațiul perinuclear (de sub

Fig. 7-5 – Secțiune prin fibra musculară de maseter. Mitocondrii de forme și dimensiuni diferite în interiorul fibrei musculare, printre miofibrile (mitocondrii intermiofibrilare). În centrul imaginiise observă o coloană longitudinală de megamitocondrii intermiofibrilare, unite prin joncțiuni intermitocondriale și dispuse în paralel cu miofibrilele. În cadrul coloanei mitocondriale nu toate componentele se localizează în dreptul benzilor I.

anvelopa nucleară). Sarcolema a prezentat invaginări care realizau tubuli T care fie pătrundeau între mitocondriile subsarcolemale și miofibrile, fie realizau un desen vacuolar subsarcolemal. Între mitocondriile subsarcolemale am identificat rudimente de triade, cu aspectele caracteristice ale feet atașate la fragmente de tubuli T. Subsarcolemal am decelat și prezența lizozomilor și heterolizozomilor, cu eventuale figuri mielinice precum conținut.

Fig. 7-6 – Secțiune longitudinală prin fibra musculară de maseter. Mitocondrii rotund-ovalare dispersate în interiorul fibrei musculare, printre miofibrile, la nivelul liniei Z și benzii I.

La nivelul fibrei musculare am decelat la nivelul joncțiunilor A-I triade (transversale, perpendiculare pe miofibrile) realizate de tubuli T între două componente de reticul endoplasmic corbular (joncțional, joncțiuni terminale), acesta din urmă continuându-se cu reticulul sarcoplasmic longitudinal, dispus în lungul sarcomerelor. La nivelul triadelor (unitățile de eliberare a calciului) am remarcat grosimea structurilor de tip feet realizate de receptorii de rianodină ai reticulului corbular și materialul electronodens joncțional dintre acest reticul și tubulul T respectiv.

Fig. 7-7 – Cluster de mitocondrii subsarcolemale. Între mitocondrii se identifică joncțiuni electronodense (săgeți). Sunt indicate vezicule intermitocondriale (săgeți cu vârf dublu) și intramitocondriale (vârf de săgeată). Prin invaginare sarcolemală ia naștere un tubul T (săgeata cu vârf triplu) care comunică cu spațiul extracelular și se insinuează între clusterul mitocondrial și miofibrile.

Intermiofibrilar am pus în evidență coloane longitudinale compuse din mitocondrii sferice și/sau megamitocondrii, unite prin joncțiuni intermitocondriale care s-au prezentat sub două modele morfologice, fie contacte intermembranare strânse care confereau un aspect distinct, electronodens, joncțiunii, fie spații intermembranare între membranele mitocondriale externe în care am decelat prezența unor granule electronodense sferice, având o dispoziție cu o anumită periodicitate. În afara acestor coloane mitocondriale longitudinale intermiofibrilare am pus în evidență, la periferiile benzilor I, dublete mitocondriale, separate prin reticul sarcoplasmic sau alipite prin joncțiuni intermitocondriale, aceste dublete prezentând orientare transversală,

Fig. 7-8 – Mușchi maseter (iepure), microscopie electronică de transmisie. La nivelul unui capilar endomisial se identifică (vârfuri de săgeți) caveole (sub)plasmalemale. Sarcoplasma dispusă peste un cluster mitocondrial subsarcolemal prezintă invaginări cu gât îngust și volum mare, tubuli T (săgeți negre). La nivelul unei joncțiuni intermitocondriale (chenar, detaliu mărit digital) se identifică (săgeata albă) se observă între membranele mitocondriale externe structuri rotunde electronodense ce par a avea o dispoziție periodică.

perpendiculară pe miofibrile și prezentând centrifug, la nivelul joncțiunilor A-I, raport sau legături cu triadele respective (legăturile dintre mitocondrii și reticulul corbular se realizau prin pripoane/punți – tethers/bridges).

Punțile transversale, care traversau și peste două miofibrile vecine, au apărut astfel compuse dintr-un dublet mitocondrial flancat de două triade (unități de eliberare a calciului).

Fig. 7-9 – Mușchi maseter (iepure), microscopie electronică de transmisie. Joncțiune intermitocondrială la nivelul unei coloane longitudinale de mitocondrii, cele două mitocondrii fiind conectate prin pripoane/punți la o cisternă de reticul sarcoplasmic (chenar, detaliu mărit digital).

De asemenea, am identificat la nivelul anvelopei nucleare a nucleului fibrei musculare de maseter receptori, cu aspect tetrameric caracteristic, de rianodină.

Fig. 7-10 – Secțiune prin fibră musculară de mușchi maseter. Mitocondrii subsarcolemale aglomerate sub membrana sarcolemală. Între cele două conglomerate se evidențiază unvas capilar endomisial. Mitocondrii interfibrilare grupate câte două, dispuse la nivelul liniei Z.

Fig. 7-11 – Mușchi maseter, microscopie electronică de transmisie. Subsarcolemal, la nivelul unui depozit mitocondrial, se decelează prezența unui microtubul (chenar, detaliu mărit). 1.microtubul; 2.membrană mitocondrială externă; 3.membrană mitocondrială internă. Se identifică reticul sarcoplasmic corbular (reticul joncțional extins, săgeata albă) conectat (vârf de săgeată albă) cu reticul sarcoplasmic tubular liber.

Fig. 7-12 – Mușchi maseter (iepure), microscopie electronică de transmisie. Se identifică triade, astfel. În chenar (detaliu mărit digital) este indicat un tubul T (săgeți albe) în contact pe flancuri opuse (vârfuri de săgeți albe) cu reticul corbular (joncțional, extins, cisterne terminale). În imaginea generală se identifică un alt tubul T (săgeți negre) conectat pe flancurile opuse ale unei miofibrile cu reticul corbular (vârfuri de săgeți negre). Remarc faptul că tubulii T se localizează la nivelul joncțiunilor A-I ale sarcomerelor.m:mitocondrii.

Fig. 7-13 – Mușchi maseter (iepure). Microscopie electronică de transmisie. Cluster subsarcolemal mitocondrial cu mitocondrii lungi/megamitocondrii ( >1μm). SUnt identificate: joncțiuni intermitocondriale (săgeți), nucleul celulei musculare (N), discuri Z (vârfuri de săgeți) și linii M (săgeata cu vârf dublu).

Fig. 7-14 – Mușchi maseter (iepure). Microscopie electronică de transmisie. Cordon mitocondrial intermiofibrilar (săgeata). N: nucleul celulei musculare.

Fig. 7-15 – Mușchi maseter (iepure). Secțiune la nivelul joncțiunilor A-I. Se identifică două mitocondrii plasate perpendicular pe miofibrile (m) și nu aliniate longitudinal pe acestea. Între mitocondrii și reticulul sarcoplasmic corbular se recunosc elementele de legătură – pripoane/punți (vârfuri de săgeți). Elementele unei triade sunt indicate: un tubul T ce trece peste cele două miofibrile (2) flancat de reticul sarcoplasmic corbular (joncțional) (1), de asemenea perpendicular pe miofibrile. Sunt indicate discurile Z.

Fig. 7-16 – Mușchi maseter (iepure). Microscopie electronică de transmisie. Mitocondrii intermiofibrilare. Se identifică joncțiuni intermitocondriale (săgeți) localizate la nivelul discurilor Z (vârfuri de săgeți).

Fig. 7-17 – Mușchi maseter (iepure), microscopie electronică de transmisie. În chenar se detaliază (mărire digitală) receptori de rianodină prezenți la nivelul anvelopei nucleului (N) unei fibre musculare. Sunt indicate de asemenea feet la nivelul triadelor (săgeți) și tubuli T (vârfuri de săgeți).

Discuții

Discuții privind nișa stem musculară

În ultima perioadă, cercetătorii au prezentat un mare interes pentru celulele stem. Având în vedere că este un subiect relativ nou, încă există numeroase confuzii și neconcordanțe în ceea ce privește această populație celulară de o importanță vitală. O parte din aceste neînțelegeri își au punctul de plecare în definițiile acestor celule, metodele și procedurile utilizate pentru explica originea lor.

Celulele stem reprezintă o populație celulară caracterizată prin două proprietăți fundamentale: capacitatea de autoreînnoire și de diferențiere într-o variate de tipuri celulare mature. Numerose studii realizate de-a lungul timpului atestă prezența lor în majoritatea organismelor pluricelulare, dacă nu chiar în toate, și susțin implicarea și rolul lor esențial în procesele de dezvoltare embrionară și regenerare tisulară.

Populația celulară stem poate fi împărțită în două mari clase: celule stem embrionare și adulte. Celulele stem embrionare sunt pluripotente și au abilitatea de a se diferenția în toate tipurile celulare, pe când cele adulte au o capacitate de diferențiere mult mai redusă, care variază de la o populație stem la alta, de la multipotentță la unipotență. Fiind o populație aparte, acestea sunt localizate într-un mediu special diferit de la un țesut la altul cunoscut sub denumirea de nișă stem, care deține mecanismele necesare pentru a asigura echilibrul, buna funcționare a elementelor celulare existente la nivelul ei.

În prezenta lucrare am încercat să evidențiez prezența celulelelor stem adulte în mușchii masticatori, în particular, în mușchiul maseter de iepure pentru a susține implicarea acestora în regenerarea țesutului muscular striat adult. Fiind vorba de țesut muscular, am încercat să identificăm celule stem perivasculare (pericite) și celule stem musculare (celule satelite). Rezultatele obținute prin analiza la microscopul electronic au infirmat prezența oricărei populații stem în țesutul muscular studiat. Dacă în mușchiul maseter studiat nu există niciun fel de nișă stem care ar putea fi implicată în regenerarea tisulară de-a lungul vieții, potențialul regenerativ al mușchilor striați, evidențiat în cazul leziunilor, în special, poate fi pus doar pe seama vascularizației?

Cu toate că există numeroase studii care atestă existența unei nișe stem adulte perivasculare, a pericitelor, în toate țesuturile, în studiul de microscopie electronică realizat în prezenta lucrarea pe produse recoltate din mușchiul maseter nu am putut identifica nici măcar o celulă care să o confirme. Inevitabil, apar următoarele întrebări: nișa stem perivasculară este cu adevărat prezentă în toate țesuturile, inclusiv cele musculare? Există o variație de la o specie la alta? Prezența sau absența lor este legată de vârsta organsimului de la care s-a recoltat țesutul analizat?

În ultima perioadă s-au publicat numeroase articole în legătură cu celule stem multipotente și celule progenitoare, printre care se numără celule adulte progenitoare multipotente, celule stem mezenchimale și adipoase. Într-un studiu realizat de Zimmerlin și colab., acestea au fost descrise, în general, la nivelul unor nișe localizate în pereții vaselor sanguine de calibru redus. Pe lângă localizarea în vasele mici, celulele stem mezenchiale au fost evidențiate în artere și vene de calibru mare. Prin experimente realizate în vitro s-a dovedit că acestea sunt capabile să dea naștere mai multor linii celulare mezenchimale, având potențial osteogen, condrogen, adipogen și miogen. O parte din celulele studiate au dus la apariția liniilor celulare neuronal prin transdiferențiere. În perioada adultă, se consideră că principala sursă de MSC sunt pericitele33.

Mergând mai departe cu analiza mușchiului maseter, s-a încercat evidențierea celei de-a doua populații celulare stem musculare – celulele satelite. Nici acestea nu au putut fi identificate în mușchiul maseter de iepure.

Pannerec și colab. într-un studiu care abordează celulele satelite, le descriu ca celulele localizate sub lamina bazală, juxtapuse membranei plamatice. În condiții normale, celulele satelite sunt inactive și exprimă markerii Pax7 și α7-integrina, iar în condiții patologice (leziuni) exprimă factorii de reglare Myf5 și MyoD și își reiau activitatea. Mare parte din această populație participă la procesele de regenerare tisulară, ceea ce înseamnă că doar o mică fracțiune se inactivează, devenind progenitori musculari scheletici. Pe lângă acestea, există și populații non-satelite care exprimă potențial miogen după transplantarea în țesut muscular: celule ale măduvei osoase transplantate la șoreci expuși la o doză letală, subpopulația hematopoietică marginală, celulele hematopoietice umane CD133+ în prezența mioblastelor. Acestea au capacitatea de a genera linii celulare musculare în perioada de creștere postnatală, deci sunt încadrate ca fiind o populație stem. Momentan nu se cunoaște rolul lor în țesuturile adulte34.

Au fost realizate exprimente pe șoareci de laborator în încercarea de a demonstra că regenerarea musculaturii scheletice este posibilă și în absența celulelor satelite. În acest sens populația satelită a fost distrusă și s-a urmărit evoluția țesutului muscular postraumatic. Rezultatele obținute au arătat că celulele satelite sunt indispensabile în regenerarea țesutului muscular scheletic. Chiar dacă celule nonsatelite și pericitele, nu au fot distruse în acest experiment s-a observat că acestea nu sunt capabile să genereze noi fibre musculare. La baza acestui fenomen ar putea sta implicarea celulelor satelite în recrutarea celulelor progenitoare aparținând altor linii celulare și exprimarea potențialului miogen prin intermediul unor factori secretați de acestea34.

Proprietățile și variația numerică a celulelor satelite

Capacitatea de autoregenerare

Moss și Leblond susțin că prin capacitatea de autoregenerare a celulelelor satelite se înțelege că acestea suferă o diviziune asimetrică din care rezultă două celule fiice, una se va diferenția, iar cealaltă va prolifera sau va deveni inactivă32.

Experimente pe fibre musculare izolate, cultivate în suspensie, au arătat că celulele rezultate urmează căi diferite: celulele satelite exprimă Pax7 și MyoD și intră în diviziune, o parte din celulele rezultate inhibă Pax7 și încep diferențierea, iar cealaltă inhibă MyoD și continuă proliferarea sau se inactivează rămânând viabile pentru o ulterioară stimulare. Aceleași rezultate s-au obținut prin experimente realizate pe pui în perioada de formare, dar și pe șoareci în diferite etape ale dezvoltării. Din cele menționate, reiese că MyoD influențează calea pe care o urmează celulele postmitotice, implicit importanța în regenerare și că Pax7 are un rol esențial în funcționalitatea celulelor satelite. În absența Pax7, resursele de celule satelite ale șoarecilor mutanți se epuizează postnatal. Ideea că lipsa expresiei Pax7 inhibă capacitatea de autoregenerare este discutabilă, aceasta influențează mai degrabă apoptoza, implicit menținerea viabilității celulare32.

Pe lângă Pax7 și MyoD, semnalele Notch pot reprezenta un mecanism de control prin influențarea deciziei de a stopa sau nu proliferarea. Până în momentul de față, ceea ce se știe cu exactitate este că există o legătură între alterarea căilor Notch și reducerea eficienței regenerării musculare32.

Pentru a demonstra potențialul de autoreînnoire s-au transplantat celule satelite și s-a urmărit evoluția lor. Astfel, s-a observat că produc precursori miogeni care activați de o agresiune proliferează și se diferențiază ex vivo, ajungând să formeze mușchi de novo după mai multe transplanturi. Mai mult de atât, acești precursori vor rămâne nediferențiați și vor coloniza nișa satelită de unde vor putea prolifera la o stimulare ulterioară32.

Totuși, Beauchamp susține că doar o parte din celulele satelite au capacitatea de autoregenerare. Afirmația lui se bazează pe existența unui număr redus de celule satelite care prezintă BrdU din perioada perinatală în țesut muscular adult. Cercetătorul consideră că doar acestea sunt celule stem32.

În regenerarea tisulară se pare că sunt implicate celule satelite care iau naștere ca urmare a procesului de autoregenerare, dar și cele provenite din celule stem multipotente. Celulele satelite activate dintr-un țesut muscular sănătos urmează calea diferențierii miogene. Pentru a evita epuizarea lor este necesară suplimentarea constantă cu celule provenite de la un progenitor care nu este o celulă satelită. Astfel se conturează ideea că există progenitori multipotenți în afara nișei satelite capabili să genereze linii celulare diferite, printre care și cea a celulelor satelite. Celule progenitoare care ar putea fi implicate sunt celule asociate endoteliului, celule interstițiale și populația celulară marginală (side population). Celulele endoteliale și satelite sunt CD34+ și probabil au aceeași origine. Celule multipotente CD45–, CD34+, Sca1+ localizate în interstițiul muscular au potențial endotelial și miogen. Celulele marginale transplantate au potențial hematopoietic și miogenic (generează celule care populează nișa satelită). Totuși, acestea urmează o cale miogenă doar în prezența celulelor miogene. Celulele marginale sunt o populație heterogenă la care se cunoaște până în momentul de față că sunt CD45- și Sca1+. Există posibilitatea ca și acestea să aibă origine comună cu celulele satelite. Este nevoie de cercetări suplimentare pentru a vedea dacă celulele satelite și marginale se dezvoltă în paralel sau una din cealaltă 32.

Există o ipoteză care susține că rezerva de celule satelite poate fi aprovizionată de celule din afara țesutului muscular. Celule localizate în țesuturi non-musculare, creierul, timusul etc. au capacitatea de a dezvolta țesut muscular scheletic in vitro, uneori chiar in vivo. Până în prezent nu se cunoaște mecanismul prin care are loc acest proces, dar s-a observat că pot fuziona cu fibrele musculare fără să devină întâi celulă satelită-like. Studii suplimentare sunt necesare pentru a descoperi natura și rolul biologic al celulelor cu potențial miogen localizate în afara țesutului muscular 32.

Potențialul celulelor satelite

Cercetări recente susțin că celulele satelite sunt multipotente, că pot genera mai multe linii celulare, nu doar mioblaste. Acest aspect ar putea fi legat de heterogenitate. S-a observat că celule recoltate din mușchi se pot diferenția în linii miogene și neurogene sau miogene și endoteliale fără a se putea afirma că sunt sau nu celule satelite. Totuși, studii realizate la începutul secolului XXI au arătat că celulele satelite cultivate în condiții standard sau suplimentate cu factori care induc osteogeneza sau adipogeneza se pot diferenția în linii celulare osteogene, respectiv adipogene. Trebuie investigat în continuarea pentru a vedea dacă la acest nivel are loc un proces de transdiferențiere sau amplificare al unei subpopulații din nișa celulară satelită32.

Un studiu publicat de Hashimoto în anul 2004 susține existența mai multor subpopulații prin faptul că celulele satelite pot genera mai multe tipuri de celule progenitoare: celule rotunde miogene și celule dense cu potențial miogen și osteogen. Încă nu s-au realizat studii in vivo la mamifere pentru a ști dacă procesul de diferențiere are loc. Lucrări recente speculează ideea conform căreia potențialul de diferențiere este influențat de expresia genei MyoD, în sensul că lipsa expresiei favorizează diferențierea către alte linii mezenchimale 32.

Heterogenitatea

Conform analizelor molecularerealizate pe șoareci de laborator care evidențiză variabilitatea expresiei markerilor de suprafață in vivo, se poate afirma că celulele satelite reprezintă o populație heterogenă. Celulele satelite recoltate posttraumaticdin țesut muscular adult au fost împărțite în două categorii în funcție de rata diviziunii celulare: un număr redus de celule exprimă miogenina în primele 8 ore și prezintă șanse reduse de proliferare, iar celelalte care exprimă miogenina mai tardiv au potențial crescut de diviziune. Heterogenitatea poate fi observată și in vitro, progenitorii miogeni având potențial de proliferare și capacitate clonogenică variabilă. Având în vedere că până în prezent nu există dovezi fenotipice sau comportamentale care să susțină heterogenitatea acestui grup celular, se poate considera că variațiile prezente în populația satelită sunt date de prezența lor într-un sistem dinamic32.

Lanțul greu de miozină care permite diferențiera tipurilor de fibre musculare poate reprezenta un marker al heterogenității celulelor satelite. Acest lucru a fost evidențiat după transplantarea de celule satelite dintr-o zonă musculară în alta: zona primitoare prezintă precursori miogeni cu fenotipul zonei donoare. Totuși,exprimarea diferitelor izoforme ale lanțului greu de miozină a putut fi observată doar post-diferențiere, nu și înainte 32.

Heterogenitatea celulelor satelite este aspect este mai evident de la un mușchi la altul decât în comparațiile realizate între celule satelite recoltate din același mușchi. Sunt citate câteva exemple care susțin ideea menționtă: potențialul de regenerare al maseterului este mult mai redus decât al musculaturii membrelor, adică celulele miogene recoltate din maseter și cultivate au un nivel de proliferare și diferențiere redus; celulele satelite extraoculare sunt active în fibre netraumatizate pe când cele din membre sunt inactive. Variabilitatea existentă se datorează pe de-o parte mediului în care se dezvoltă, iar pe de altă parte diferențelor dintre progenitorii miogeni32.

Se poate vorbi de heterogenitate și între mușchii cu aceeași origine, la nivelul somitelor. În acest sens s-a marcat Pax3 cu eGFP, iar rezultatele obținute au arătat că la anumiți mușchi majoritatea celulelor sunt Pax3eGFP+, pe când la cei din vecinătatea lor acest marker este prezent înr-un număr redus sau chiar absent. Nu s-a găsit încă o explicație pentru acest fenonem, dar se consideră că nu poate fi pusă în legătură cu ontogenia sau tipul de fibre din alcătuire. Ceea ce nu poate fi contestat este că prin această metodă este demonstrată cu certitudine heterogenitatea populației satelite32.

Variațiile numerice ale celulelor satelite

Numărul de celule stem prezintă un grad mare de variabilitate. Acesta diferă de la un mușchi la altul și de la o miofibră la alta, în funcție de gradul de dezvoltare și de la o specie la alta35.

Celulele satelite reprezintă aproximativ 30-35% din totalul celulelor sublaminale de la nivelul unei miofibre de șoarece în perioada postnatală timpurie. Numărul scade până la 2-7% în perioada adultă. Mușchiul solear conține un număr de 2-4 ori mai mare decât mușchiul tibial anterior.

În cadrul aceluiași mușchi, fibrele cu contracție lentă conțin un număr mai mare de celule satelite în comparație cu cele cu contracție rapidă. Nu s-a găsit explicația acestei heterogenități intrinseci, dar se consideră că nișa celulelor satelite și factorii implicați în reglare ar putea fi implicate în acest fenomen35.

Densitatea celulelor satelite variază de-a lungul aceleiași miofibre. Un număr mai mare se poate observa la extremități, unde are loc creșterea în lungime a mușchilor scheletici și în regiunea perisinaptică. Majoritatea celulelor satelite sunt localizate în jurul unui vas capilar, la o distanță constantă. Raportul cu vasul capilar este alterat dacă survine denervarea, ceea ce ne sugerează influența inervației motorii și a vascularizației asupra comportamentului celulelor satelite35.

Trebuie avut în vedere și faptul că numărul poate fi influențat de metoda de analiză a datelor. De modalitatea în care au fost obținute rezultatele trebuie să se țină cont și când se fac comparații între studii diferite35.

Influența vârstei asupra potențialului regenerativ

Conform experimentelor lui Studitsky, țesutul muscular are capacitatea de a genera mușchi funcțional chiar și în cazul în care a fost îndepărtat, fragmentat și înlocuit. Studii ulterioare nu numai că susțin această idee, dar arată că această proprietate de regenerare se menține după mai multe cicluri34.

Odată cu înaintarea în vârstă are loc o scădere masei și a proprietăților mușchilor scheletici și înlocuirea lui cu țesut fibros și adipos. Există mai multe ipoteze în ceea ce privește procesele care stau la baza acestei modificări legate de înaintarea în vârstă: alterarea funcțională a celulelor satelite, diminuarea potențialului proliferativ și a capacității de antrenare a celulelor în procesele de regenerare34.

Experimente realizate pe șoareci în diferite etape au arătat că numărul de celule satelite se reduce cu 1/3 până în perioada adultă și continuă să descrească . Nu se reduce doar numărul, ci și exprimarea Pax7, ceea ce se traduce prin scăderea potențialul miogen și de autoregenerare. Modificare nu are loc la toate celulele satelite ceea ce sugerează implicarea altor factori în modificările legate de înaintarea în vârstă: (1) creșterea nivelului de molecule Wnt care stimulează transformarea în celule producătoare de țesut fibros, (2) reducerea semnalelor Notch asociată cu inhibarea potențialului miogen și cu o accentuare a diferențierii neînsoțită de autoregenerare (depleția celulelor satelite) 34.

Conform studiului lui Pannerec, transplantarea celulelor satelite într-un țesut mai tânăr favorizează capacitatea de regenerare tisulară a acestora. Astfel, putem trage concluzia că potențialul celulelor satelite se menține de-a lungul vieții, dar este influențat de mediul în care se află și de modificările care au loc la acest nivel în diferite etape ale vieții34.

Anatomia ultrastructurală a reticulului sarcoplasmic

Sarcomerele realizează structuri repetitive ale fibrei musculare, numite miofibrile 36. Fiecare miofibrilă este înconjurată de reticul endoplasmic neted / reticul sarcoplasmic ce reprezintă principalul rezervor de Ca2+ al fibrei musculare 36. Rețeaua de reticul sarcoplasmic este întreruptă de tubulii T, care reprezintă invaginări ale sarcolemei 36. Caveolina 3 este esențială pentru funcția musculară și are rol în biogeneza tubulilor T; sunt evidențe care indică ipoteza că mecanisme similare coordonează atât formarea tubulilor T cât și a caveolelor subplasmalemale 37. Tubulii T se localizează la nivelul discurilor Z sau în dreptul joncțiunilor A-I 36. Un tubul T se învecinează cu două cisterne terminale ale reticulului sarcoplasmic (reticul sarcoplasmic joncțional sau joncțional extins sau reticul sarcoplasmic corbular) cu care formează o triadă 36, 38, 39.Membrana tubulară și membrana reticulului sarcoplasmic sunt separate de un gap de circa 100Å traversat de structuri proteice electronodense numite feet40. Triadele (unități de eliberare a calciului) joacă roluri în contracția musculară; tubulul T are canale de calciu voltaj-sensibile numite receptori de dihidropiridină (DHPR) conectați fizic cu canalele de calciu ale reticulului sarcoplasmic numite receptori de rianodină (RyR) (mai sunt la acest nivel și alte proteine asociate reticulului corbular, triadina, junctina și calsechestrina)36, 41, 42. Depolarizarea membranei tubulului T în urma potențialului de actiune generat la nivelul plăcii motorii modifică conformația receptorilor de dihidropiridină care induc direct deschiderea canalelor de calciu ale receptorilor de rianodină, ceea ce determină eliberarea calciului în citoplasmă 36. Aceasta din urmă declanșează contracția sarcomerelor, proces numit cuplajul excitației cu contracția 36.

Semnalizarea dintre canalele de DHPR și RyR în timpul cuplajului excitației cu contracția este bidirecțională: cuplajul ortograd (DHPR-la-RyR) se referă la mecanismul prin care depolarizarea tubulului T declanșează activarea mediată de RyR a calciului din reticulul sarcoplasmic iar cuplajul retrograd (RyR-la-DHPR) reflectă influența RyR asupra conductanței calciului și asupra proprietăților de poartă ale DHPR 41.

Semnalizarea bidirecțională între mitocondrii și depozitele intracelulare (reticulul sarcoplasmic) stă la baza unor funcții celulare importante, precum producția oxidativă de ATP 43. În mușchii striați acest cuplaj se realizează prin localizarea mitocondriilor în vecinătatea depozitelor de calciu intracelulare; prin electron microscopie și electron tomografie au fost identificate mici punți sau pripoane (bridges/tethers) ce leagă membrana mitocondrială externă de depozitele intracelulare de calciu 43. Aceste punți/pripoane reprezintă substratul morfologic al semnalizării bidirecționale între mitocondrii și reticulul sarcoplasmic 43 și le-am pus și eu în evidență la nivelul mușchiului maseter.

O altă caracteristică a mușchiului scheletic adult la mamifere, pe care am identificat-o și eu pe preparatele de mușchi maseter de iepure, este poziționarea precisă a mitocondriilor adiacent triadelor (unitățile de eliberare a calciului) 41. Inițial a fost descrisă o subpopulație de mitocondrii intermiofibrilare limitate la banda I; toate tipurile de fibre musculare (albe, roșii, intermediare) prezintă perechi de mitocondrii subțiri care încercuiesc miofibrilele la nivelul benzii I, de fiecare parte a liniei Z (rânduri duble transversale, cu o periodicitate de circa 2 μm) 41. În plus mitocondriile mai formează și depozite/clustere subsarcolemale, așa cum am identificat și eu în mușchiul maseter, și, ocazional, se grupează în coloane longitudinale între miofibrile (mitocondriile columnare sunt rare în fibrele albe) 41.

Receptorii de rianodină la nivelul anvelopei nucleare

Rianodina este un alcaloid neutru izolat din planta Ryania Speciosa Vahl, din familia Salicaceae; este un agent muscular paralizant ce afectează atât mușchiul scheletic cât și miocardul (în miocard produce o paralizie flască iar în mușchiul scheletic produce o contracție ireversibilă) 40. Receptorul de rianodină (RyR) purificat are o structură tetragonală: are 4 subunități, fiecare apărând circulară cu un diametru de 14 nm; RyR se încadrează între-un pătrat cu latura de 26 nm, fiecare subunitate are o depresiune/gaură centrală de 2-4 nm diametru, iar în centru subunităție se contopesc formând o gaură centrală 40, 44. Astfel de receptori tetramerici am pus în evidență la nivelul anvelopei nucleare în mușchiul maseter de iepure, morfologia acestora fiind comparabilă cu cea demonstrată de Lai și colab. (1987) 45 care au sugerat că proteinele de la nivelul feet și RyR ar putea forma complexe oligomerice largi.

Sunt dispute privind natura eliberării nucleare de calciu 46. Nu există consens privind localizarea canalelor-receptori de inozitol și de rianodină care eliberează calciu în nucleu; depozitele intranucleare de calciu pot elibera calciu și în nucleoplasmă și în afara nucleului 46. Sunt aduse evidențe indirecte, funcționale, privind localizarea RyR pe fața internă a anvelopei nucleare, aspect structural disputat de evidențele mele, însă rolul receptorilor intranucleari în răspunsurile intracelulare normale încă esteîn discuții46.

Discuții asupra reticulului mitocondrial

Pe preparatele de microscopie electronică de mușchi maseter analizate am putut observa organizarea caracteristică a unei fibre musculare scheletice. Aceasta este dată de heterogenitatea organitelor specifice contractile, a miofibrilelor, de alternanța fibrilelor întunecate cu cele clare situate la același nivel care dau aspectul striat transversal.

Referitor la organitele comune tuturor celulelor, s-au evidențiat numeroase mitocondrii de dimensiuni și forme diferite, izolate sau grupate. Am putut observa două categorii de mitocondrii: mitocondrii subsarcolemale și intermiofibrilare. Mitocondriile subsarcolemale formează grupuri numeroase de organite sub membrana sarcolemală, în vecinătatea unui vas capilar. În ceea ce privește mitocondriile intermiofibrilare, s-a observat că acestea fuzionează la nivel membranar și dau naștere unui reticul mitocondrial34.

Într-un studiu realizat de van Breeman pe mai multe preparate de mușchi gastrocnemian uman, mitocondriile sunt descrise în cantitate mare în jurul nucleilor și în pungi sarcoplasmice localizate la periferia fibrei în examinările realizate.Pe o secțiune longitudinală a unei fibre musculare, mitocondriile perifibrilare au o dispunere regulată și se prefigurează ca niște tije scurte asociate la nivelul benzilor Z. Pe alocuri se evidențiază mitocondrii cu diametru crescut între miofibrile care prezintă o constricție caracteristică sau sunt separate de mitocondriile succesoare la nivelul benzii Z 34.

Studierea secțiunilor succesive a evidențiat faptul că mitocondriile de dimensiune reduse tind să rămână la fel pe toate secțiunile, pe când cele filamentoase cu dimensiuni mai mari cresc de-a lungul secțiunilor și se grupează în lanțuri mitocondriale lungi. La nivelul benzilor Z, s-a observat o ramificare laterală a lor 34.

Structura mitocondriilor musculare este identică cu cea din alte celule, prezentând o membrană internă pliată la nivelul căreia se găsesc criste și tubuli și o matrice cu granule fine. Distribuția și orientarea cristelor mitocondriale și a tubulilor este neregulată.

Tot în studiul mușchiului gastrocnemian uman se găsesc mitocondrii cu structură și localizare diferită: la periferie se observă organite celulare mitocondriale sferice și filamentoase grupate, la nivelul benzilor – mitocondrii filamentoase scurte, iar între miofibrile – formațiuni filamentoase lungi. Diferențele structurale și de localizare nu indică o variație funcțională a acestora34.

Numărul organitelor mitocondriale prezente în celulă este o caracteristică importantă de diferențiere. La nivelul mușchilor solicitați frecvent se observă un număr crescut mitocondrii de dimensiuni mari, pe când la cei cu solicitare redusă acest număr este mult mai mic. Numărul mitocondriilor prezente în celulă este direct proporțional cu solicitarea musculară, cu necesarul energetic. Mușchii roșii, bogați în fibre musculare de tip I cu conținut crescut de mioglobină posedă mai multe mitocondrii decât cei albi, bogați în fibre musculare de tip II cu un conținut redus de mioglobină. Capacitatea de oxidare este direct proporțională cu concentrarea celulară mitocondrială34.

Funcția mitocondriilor de cablu electric intracelular

Membranele care prezintă în structura lor enzime care eliberează și consumă energie sunt definite ca fiind membrane de cuplaj. Mediul care înconjoară membranele este format dintr-o soluție apoasă de electroliți cu conductibilitate electrică mare. Paradoxal, în același timp, conductivitatea electrică a membranei poate fi foarte redusă47.

Mitocondriile cu lungime suficient de mare fac parte din structurile capabile să îndeplinească rolul de elemente de transmitere a energiei47.

Primele studii ale mitocondriilor au fost realizate la microscopul optic și au indicat că acestea există sub două forme: filamentoasă și sferică/elipsoidală. Apariția microscopului electronic, care a permis analiza secțiunilor mai fine, a contrazis această idee, susținând că mitocondriile sunt aproape întotdeauna sferice și foarte rar filamentoase47.

O singură mitocondrie sferică nu este capabilă să transporte energia în interiorul unei celule eucariote care este considerabil mai mare. În cazul în care se poate evidenția existența mitocondriilor filmentoase, măcar în anumite condiții, se poate discuta de un transport energetic mitocondrial la nivelul unei celule eucariote47.

Tehnici mai moderne de microscopie contrazic ipoteza conform căreia majoritatea mitocondiilor sunt sferice. Astfel, reconstrucția tridimensională a unor secțiuni ultrafine de microscopie electronică și microscopia electronică de voltaj crescut care a permis analiza preparatelor de grosimi mai mari și marcarea fluorescentă a mitocondriilor susțin revenirea la ipoteza enunțată după analiza la microscopia optică: existența mitocondriilor filamentoase și sferice 47.

Utilizând tehnica secțiunilor seriate, s-a arătat că organitele mitocondriale de la nivelul mușchiului diafragmatic sunt organizate într-o rețea care străbate banda I în apropierea discurilor Z. Rețelele sunt conectate prin șiruri (filamente) orientate perpendicular pe planul lor, paralele cu miofibrilele. Sistemul pe care îl formează este denumit reticul mitocondrial47.

Prin microscopie elecronică se pot studia numai preparate fixate, adică structura, nu și funcția. Pentru studiul funcțional s-au utilizat cationi fluorescenți care penetrează membrana mitocondrială și s-a realizat analiza prin microscopie de fluorescență. S-a ales această metodă deoarece concentrația lor este considerabil mai mare în mitocondrii decât în afara lor. În studiile realizate de Amchenkova și colab. s-au utilizat rhodamine, deoarece sunt cationi puternic încărcați pozitiv, hidrofobi, cu un grad crescut de fluorescență,care posedă capacitatea de a penetra membrana mitocondrială. S-a utilizat etilrhodamina pentru a evidenția reticulul mitocondrial din mușchiul diafragmatic. Ulterior s-a folosit pentru a marca mitocondriile dintr-o cultură celulară. Celulele din cultură prezentau intracelular o structură cu aspect ondulat, care s-a dovedit a fi o rețea mitocondrială. Cercetările au continuat și s-a observat că atât rhodaminele, cât și alti cationi hidrofobi se acumulează selectiv în mitocondrii energizate, rezultând astfel mitocondrii fluorescente47.

Pentru a verifica dacă membrana de cuplaj îndeplinește funcția de legătură (cablu), s-au utilizat două teste: cu rhodamină și cu laser – metoda Bernes. La electroforeză s-a observat că etilrhodamina se acumulează în cantități mult mai mari în organitele mitocondriale energizate decât în citoplasmă 47.

O idee evidentă rezultată din această ipoteză este aceea că filamentele mitocondriale care îndeplinesc funcția de cablu nu trebuie să fie energizate în cazul în care prezintă întreruperi.În acest studiu, grupările mitocondriale descrise sunt formate din lanțuri de mitocondrii cu ramificații conectate între ele prin joncțiuni. Acest tip de organizare poartă numele de Streptio mitocondriale și poate fi văzut în cardiomiocite, diafragm și mușchi scheletic47.

Conform conceptului chemiosmotic al lui Mitchell despre transferul energetic transmembranar, procesele care generează energie și cele care consumă sunt cuplate printr-o diferență de potențial electrochimică.

Prezența mitocondriilor filamentoase lungi nu este suficientă pentru a susține că acestea posedă proprietățile unui cablu electric.Filamentele pot fi alcătuite din mitocondrii de dimensiuni reduse unite cap la cap sau din numeroase mitoplaste izolate electric înconjurate de o membrană mitocondrială externă comună. În interior, mitocondriile prezintă criste mitocondriale perpendiculare pe axul lung al organitului, care sunt dificil de diferențiat de septurile care compartimentează și separă filamentele48.

În încercarea de a demonstra proprietatea de cablu electric a mitocondriilor s-au marcat aceste organite cu cationi sintetici fluorescenți care pot penetra membrana fosfolipidică bilaminară. Cationii fluorescenți s-au folosit pentru a verifica dacă există variații ale potențialului de membrană (ΔΨ) la nivelul membranei interne mitocondriale. S-a observat că ionii sintetici penetranți se regăsesc în interiorul mitocondriei într-un număr de 103 mai mare decât în plasmă. S-a utilizat eilrhodamina deoarece are o capacitate crescută de a penetra membrana mitocondrială și permite analiza ΔΨ în mitocondriile intacte. Astfel, într-o celulă colorată cu rhodamină mitocondriile apar fluorescente în comparație cu alte componente care sunt întunecate. Microiradierea cu un fascicul laser foarte subțire a unei mitocondrii filamentoase a dus la dispariția fluorescenței în zona afectată, dar și în restul mitocondriei. Mitocondriile care nu au fost expuse iradiereii și care și-au păstrat continuitatea au rămas fluorescente. Aceste experimente au fost realizate pe fibroblaste. Mai mult de atât, o parte din fibroblastele umane prezentau majoritatea mitocondriilor conectate unele cu altele într-o rețea unică. În această situație, iradierea laser a uneia dintre ramificații a dus la la colapsul ΔΨ al întregului sistem48.

Din aceste idei enunțate rezultă că fibroblastele au o rețea continuă alcătuită fie dintr-un singur tub mitocondrial, fie din numeroase mitocondrii mici unite prin intermediul unor joncțiuni cu conductivitate electrică. Cea de-a doua ipoteză a fost susținută de prezența joncțiunilor intermitocondriale în mușchiul diafragmatic. S-a observat că joncțiunile sunt alcătuite din patru membrane aparținând mitocondriilor învecinate și spații intermembranare în care există material osmofilic. Joncțiunile dintre mitocondrii prezintă o conductibilitate electrică crescută. Aceleași rezultate s-au obținut analizând cardiomiocite și astrocite prin aceste tehnici48.

Dedov și Roufogalis au utilizat alt cation penetrant, JC-1, care poate face diferența între ΔΨ absent, redus sau crescut prin variațiile luminii emise:(1) ΔΨ zero – mitocondriile nu emit lumină; (2) ΔΨ redus – mitocondriile emit lumină verde; (3) ΔΨ crescut – emit lumină roșie.

Trebuie avut în vedere și faptul că filamentele mitocondriale nu sunt echipotente. Acest aspect a fost subliniat de Chen și colab., cei care au introdus tehnica JC-1. În cercetările lor s-a observat că în anumite culturi celulare, unele părți ale aceluiași filament mitocondrial emit lumină verde, pe când altele lumină roșie. S-a presupus că acest lucru se datorează întreruperii conductanței electrice la nivelul joncțiunilor intermitocondriale într-o rețea alcătuită din mitocondrii unite cap la cap48.

Mitocondriile filamentoase și grupurile de mitocondrii cuplate electric prezintă avantaje și dezavantaje. Pe de-o parte rețeaua de mitocondrii poate funcționaca un sistem eficace de transmitere a energiei dintr-o zonă în alta a celulei, dar pe de altă parte prezintă dezavantajul că lezarea locală a sistemului poate duce la alterarea mai multor, poate chiar a tuturor organitelor producătoare de energie dintr-o celulă.Totuși acest inconvenient este ținut sub control prin intermediul joncțiunilor intermitocondriale și a capacității lor de a opri temporar și local conductibilitatea electrică. Astfel, în urma alterărilor locale va rezulta izolarea regiunii afectate, nu întreruperea întregii transmisii energetice a rețelei48.

Numeroase studii promovează ideea că la nivelul celulelor care în mod normal prezintă multe mitocondrii izolate are loc o fuziune a acestora cu formarea unei rețele extinse mitocondriale în cazul în care acestea nu mai pot asigura necesarul energetic. Acest fenomen a fost descris doar în condiții de hipoxie48.

În celule de dimensiuni mari cu necesar energetic crescut, cum sunt cele din țesutul muscular striat roșu, sistemul mitocondrial energetic se formează de la început. În celulele musculare striate există numerose mitocondrii rotunde dispuse în straturi multiple sub membrana sarcolemală care se unesc prin joncțiuni intermitocondriale și formează grupuri. La acest nivel putem observa aproape exclusiv aceste organite. Mitocondriile subsarcolemale din stratul intern se leagă prin joncțiuni cu mitocondriile filamentoase care la rândul lor sunt conectate cu o rețea mitocondrială care străbate centrul fibrei musculare48.

Prin intermediul acestui sistem se asigură transportul de O2 către mijlocul fibrei pentru a asigura necesarul energetic la acest nivel. Se presupune că mitocondriile subsarcolemale utilizează O2 care difuzează din capilare în fibra musculară prin sarcolemă. Ulterior, potențialul protonic generat este transmis prin mitocondrii filamentoase la reticulul mitocondrial central unde este transformat în ATP. Alt avantaj al acestei organizări îl reprezintă posibilitatea de a reduce concentrația de oxigen în anumite zone fără a afecta rezerva energetică. Cele mai intense procese de respirație ar trebui să aibăloc la periferia celulei pentru a proteja centrul acesteia de acțiunea radicalilor liberi48.

Pe lângă mitocondriile subsarcolemale există și altă categorie numită mitocondrii intermiofibrilare. Acestea prezintă pompe antiport ATP/ADP într-un număr mai mare decât la nivel subsarcolemal și sunt principalele responsabile de formarea ATP. Mitocondriile subsarcolemale sunt implicate în procesele de respirație și produc potențialul protonic pentru a fi consumat de mitocondriile interfibrilare, urmând ca acestea să sintetizeze ATP. Numărul de pompe antiport variază odată cu temperaturile la care sunt expuse animalele de studiu. Acest lucru se întâmplă deoarece procesele de termoreglare produc decuplarea respirației și fosforilării celulare prin facilitarea transportului transmembranar al anionilor acizilor grași 48.

Nu trebuie să considerăm că utilizarea O2 și sinteza de ATP la nivel muscular au loc numai prin aceste sisteme de transmisie a energiei la distanță, deoarece în anumite condiții mitocondriile intermiofibrilare pot fi implicate în respirația celulară 48.

Pe lângă întreruperea conducerii electrice la nivelul joncțiunilor au loc și procese mai avansate, cum ar fi descompunerea rețelei de mitocondrii în mitocondrii rotunde unice. Acest proces poate avea loc în urma unui fenomen fiziologic (ciclu celular) sau patologic. Gilkerson și colab. au descoperit că descompunerea reticulului mitocondrial este consecința depleției materialului ADN mitocondrial. Uneori desființarea rețelei mitocondriale este urmată de migrarea mitocondriilor rezultate de la periferie către nucleu. Migrarea are loc în anumite doar în anumite condiții,ca de exemplu prezența TNF. Nu se cunoște exact de ce mitocondriile migrează către nucleu în cazul apoptozei indusă de TNF, dar se consideră că are legătură cu conținutul mitocondrial de proteine pro-apotoice. În momentul în care proteinele pro-apoptotice sunt eliberate din mitocondrie în citosol își exercită acțiunea asupra componentelor nucleare și astfel este indusă moartea celulară programată. Din cele menționate putem duce că mitocondriile sferice desprinde din rețea pot reprezenta forma transportabilă a acestora prin intermediul cărora îndeplinesc anumite funcții cum ar fi inducerea apoptozei programate48.

Microtubulii și dinamica mitocondrială

Microtubulii, una dintre cele trei componente ale citoscheletului, sunt structuri filamentoase rigide de aproximativ 25 nm, care formează o structură dinamică care suferă procese succesive de asamblare și dezasamblare. Microtubuliisunt indispensabili pentru numeroase funcții celulare, deoarece asigură pe de-o parte forma celulei, iar pe de altă parte sunt implicate în motilitatea celulară, transportul intracelular de organite și separarea cromozomială din timpul mitozei49.

În compoziția microtubulilor intră un singur tip de proteină globulară, tubulina cu o structură dimerică. Printr-un proces de polimerizare a dimerilor de tubulină α și β se formează microtubulii, care, în general, conțin 13 filamente lineare unite în jurul unui centru gol49.

Rețeaua pe care o formează prezintă o structură dinamică instabilă, în care microtubulii se asamblează și dezasamblează frecvent în interiorul celulei. Dinamica structurii microtubulilor poate fi condusă către polimerizare sau depolimerizare prin intermediul interacțiunilor cu diferite clase de proteine. O parte vor induce dezasamblarea microtubulilor prin scindare sau depolimerizarea tubulinei, iar cealaltă parte vor lega microtubulii și le vor crește stabilitatea49.

De moleculele de tubulină din compoziția microtubulilor se atașează trei clase importante de proteine. Prima categorie este reprezentată de proteinele asociate microtubulilor (MAPs) considerate a fi proteine structurale, deoarece sunt implicate în procesele de polimerizare și stabilizare ale microtubulilor și pot fi separate de tubulină în cicluri multiple de agregare și dezagregare ale microtubulilor. Reprezentative pentru această categorie sunt proteinele cu greutate moleculară mare MAP1a, MAP1b, MAP2a/2b/2c, MAP4, proteinele „tau” (greutate moleculară mică), 205 K=kDA MAP și izoforme ale proteinelor enumerate. Activitatea MAPs este reglată de fosforilare, permițând astfel celulei să controleze stabilitatea microtubulilor50.

Cea de-a doua categorie este formată din proteine motorii care generează mișcare de-a lungul microtubulilor prin hidroliza ATP. În această grupă intră kinezina, dineina și derivați ai lor. Acestea se leagă de microtubuli, dar nu pot fi separate de tubulină în cicluri repetate de asamblare și dezasamblare cum se întâmplă în cazul MAPs50.

Ultima categorie de proteine asociate microtubulilor este heterogenă și include enzime glicolitice, kinaze, proteine implicate în biosinteză, proteine atașate receptorilor membrane și ribonucleoproteine. Acestea reprezintă un punct de atașare pentru numeroase alte proteine citoplasmatice50.

Majoritatea studiilor au fost realizate pe MAPs cerebrale din cauza abundenței de microtubuli de la acest nivel, dar și din cauză că MAPs prezentau markeri specifici pentru dezvoltarea cerebrală și celulele de la acest nivel. MAP2 și tau localizate în dendrite și axoni sunt reprezentative pentru proteinele asociate microtubulilor de la nivel cerebral. Acestea prezintă structuri repetitive omoloage la capătul C-terminal care favorizeză atașarea lor la microtubuli50.

Pe lângă proteinele care se găsesc la nivelul sistemului nervos, în categoria MAPs există și proteine prezente în toate structurile celulare cum ar fi MAP4. Ca și MAP2, MAP4 prezintă structuri repetitive omoloage la capătul C-terminal care îi permite să se atașeze de microtubuli. Conform studiului realizat de Chapin și Bulinski pe culturi celulare, se pare că între MAP4 și microtubuli se creează interacțiuni heterogene care sugerează o stabilizare selectivă a subdiviziunilor de microtubuli50.

Rolul microtubulilor în dinamica mitocondrială

Variabilitatea formei și comportamentului mitocondriilor a condus la apariția a numeroase întrebări care stau la baza cercetărilor recente. Printre întrebările apărute se numără și cea în legătură cu componentele structurale și moleculare care sunt implicate în modificarea distribuțieiși morfologiei mitocondriale care a condus la realizarea studiului lui Yaffe 51.

Studii recente ale citoscheletului au identificat implicarea proteinelor de la acest nivel în modificarea distribuției mitocondriale și a altor organite. Aceste studii au oferit primele indicii care ar putea conduce la explicarea mecanismului prin care are loc redistribuția lor. Analiza la microscopia de fluorescennță a permis vizualizarea mitocondriilor și a elementelor componente ale citoscheletului care sunt prezente în același loc. Mai exact, s-au evidențiat mitocondrii și microtubuli în același loc în diferite celule ale mamiferelor (neuroni, spermatogonii și fibroblaste). Această idee a fost susținută de modificarea distribuției mitocondriale în culturi de celule ale mamiferelor după administrarea de agenți care induc desfacerea rețelei de microtubuli. Tot prin analiza de microscopie de fluorescență s-a observat că în axonii neuronali de pui are loc o scădere a motilității mitocondriale după administrarea de inhibitori ai microtubulilor, mai mult, s-ar părea că microfilamentele de actină sunt și ele implicate51.

Studii realizate pe organisme unicelulare, cum ar fi Schizosaccharomyces pombe, au demonstrat implicarea componentei genetice în localizarea mitocondriilor prin faptul că dezasamblarea rețelei de microtubuli cauzată de mutații genetice ale tubulinei a condus la apariția unei distribuții mitocondriale anormale51.

Interacțiunile dintre mitocondrii și microtubuli și deplasarea de-a lungul lor sunt mediate de proteinele asociate microtubulilor (MAPs). Această grupă de proteine include proteine de stabilizare și destabilizare a microtubulilor, care intervin în polimerizarea și funcția lor, dar și molecule motorii care sunt responsabile de motilitatea organitelor mitocondriale și nu numai51.

Studierea microtubulilor și a relației lor cu motilitatea organitelor a continuat și astfel s-au descoperit proteinele motorii, kinezina și dineina citoplasmatică, care leagă microtubulii și asigură necesarul energetic prin transformarea energiei chimice în lucru mecanic printr-un proces de hidrolizare al ATP-ului. Atât dineina, cât și kinezina pot lega și transporta vezicule, proteine și organite, în special mitocondrii. Kinezinele asigură transportul către capătul terminal pozitiv al microtubulilor, iar dineinele către capătul terminal opus, negativ51.

Din superfamilia Kinezinelor fac parte 14 familii, dintre care o parte, familiile kinezinelor 1 și 3 au afinitate pentru organitele mitocondriale. Dintre acestea, KIF1B din familia 3 a fost evidențiată în mitocondrii in vivo și a putut fi separată împreună cu acestea în celule izolate recoltate de la șoareci51. KIF1B este atașată de mebrana externă mitocondrială și are rol în deplasarea anterogradă a mitocondriilor către capătul terminal pozitiv52. Mai mult, s-a demonstrat că anticorpii pentru KIF1B inhibă motilitatea mitocondriilor care prezentau această proteină. KIF5B deține același rol în motilitatea mitocondrială – deplasare anterogradă către capătul pozitiv52. KIF5B susține implicarea kinezinelor prin faptul că mutația genei care codifică această proteină duce la o distribuție aberantă a mitocondriilor, predominat perinucleară, la șoareci și mortalitate în cazul embrionilor. Alt aspect care a putut fi observat, mitocondriile erau încă asociate microtubulilor chiar și în cazul existenței mutațiilor ceea ce sugerează că sunt implicate și alte molecule proteice51.

În localizarea mitocondriilor la nivel celular s-ar părea că sunt implicate și filamentele intermediare, deoarece alterarea acestei rețele de filamente duce apariția unei distribuții anomale a mitocondriilor. Totuși, rolul rol este pasiv sau structural, de ancorare a organitelor în locusuri citoplasmatice specifice. Există posibilitatea ca distribuția mitocondriilor să fie mediată de microtubuli și filamente intermediare în stadii diferite ale ciclului celular: microtubulii transportă mitocondriile la periferia celulei, urmând să fie preluate de filamentele intermediare la începutul diviziunii celulare. Ideea enunțată mai sus este susținută de studii de microscopie electronică pe axoni de broaște51.

O altă familie de proteine de legătură, cea a dynaminelor, intervine în distribuția mitocondrială la nivel celular. Acestea nu sunt responsabile doar de poziția, ci și de menținerea unei morfologii normale a mitocondriilor. Astfel, dynaminele intervin în procesele de fisiune și fuziune care au loc la nivelul reticulului mitocondrial. Experimente realizate pe diferite organisme care prezentau mutații ale genelor care codifică dynamine (Drp1, Dnm1p) au arătat o poziționare atipică a mitocondriilor, o agregare perinucleară a acestora51.

G. Rutter într-un studiu realizat recent evidențiază faptul că și dineinelor au influență asupra formei mitocondriilor. Mai mult, demonstrează că diferite clase de proteine, dineina și dynamina, conlucrează pentru a asigura forma și motilitatea mitocondrială52.

Microtubulii din musculatura striată

Cu toate că nu se cunosc exact funcțiile microtubulilor în musculatura striată, s-ar părea că ar fi implicate în diferențierea, morfologia și activitatea contractilă a acesteia53.

Microtubulii sunt localizați printre miofibrile la nivelul joncțiunii benzilor A și I, sarcolemei, aparatului Golgi sau la nivelul nucleului, fiind implicate în integrarea organitelor celulare în musculatura striată. Kano și Boudriau, în studii realizate indepent unul de celălalt, au arătat faptul că microtubulii pot avea o dispoziție predominată (longitudinală, oblică, transversală) în funcție de tipul și de funcțiile de care este responsabil mușchiul53.

Acțiunea agenților de stabilizare și depolimerizare la nivelul miocitelor din musculatura striată în timpul miogenezei duce la întreruperea dinamicii microtubulilor, care se traduce prin alterarea proceselor de fuziune și diferențiere a mioblastelor. Mecanismul prin care are loc acest proces nu este pe deplin cunoscut, dar se pare că proteinele asociate microtubulilor MAP4 și MURF 3 joacă un rol important deoarece acestea sunt indispensabile în formarea miotubilor și se presupune că participă la stabilizarea componentelor și transmiterea semnalelor53.

Alt eveniment important pentru morfogeneză, mai exact pentru fuziunea mioblastelor, este interacțiunea între M-caderină și miotubuli care se pare că intervine în procesele de reglare de la nivelul membranei miocitelor. Alterarea dinamicii microtubulilor în mioblastele scheletice postmitotice influențează morfologia și întrerup miofibrilogeneza: banda A prezintă filamente groase printre care pătrund microtubuli lungi, banda I conține microtubuli, dar nu prezintă filamente subțiri53.

Concluzii

Mușchii masticatori au importanță deosebită pentru aparatul dento-maxilar fiind implicațiîn realizarea celor mai importante funcții ale acestuia: masticația, fonația, deglutiția.

Mușchii masticatori sunt mușchi suprasuficienți, având capacitatea de a se contracta în continuare după ce arcadele dentare au venit în contact.

Sunt postulate valori ale forțelor masticatorii specifice fiecărui mușchi, totuși trebuie să avem în vedere că mușchii masticatori au atașamente osoase, iar geometria craniană este specifică individual. De asemenea, angulațiile și volumul muscular sunt specifice fiecărui individ în parte. Consider că valorile forțelor masticatorii postulate în anatomie trebuie privite doar orientativ, fără a fi considerate general valabile.

Lanțurile de mitocondrii pe care le-am obiectivat în mușchiul maseter sunt responsabile de transmiterea eficientă și rapidă a energiei dintr-o parte în alta a celulei musculare. Lucrarea de față reprezintă primul studiu specific al acestui reticul mitocondrial în mușchiul maseter. Consider că sunt necesare astfel de studii prin care săse generalizeze conceptul pentru toți mușchii masticatori și care să aprecieze și țesutul muscular uman.

Nișa stem musculară reprezentată de celulele satelite a fost descrisă cu oscilații în referențialul pe care l-am documentat. Nișa aceasta nu a fost apreciată în mușchii masticatori. Nici eu nu am identificat un substrat specific care să îmi valideze pozitiv ipoteza de cercetare.Conceptul și aprecierea tisulară specifică trebuie trebuie urmărite prin studii viitoare în anatomie și în anatomia comparată pentru obiectivare și uniformizare.

Nișa stem perivasculară reprezentată de pericite a fost descrisă în numeroase studii în majoritatea vaselor sanguine de la nivelul țesuturilor și organelor. La fel ca nișa musculară, nici aceasta nu a fost evidențiată în mușchii masticatori. Nici eu nu am reușit să identific în mușchiul maseter celule care să poată fi considerate a fi pericite, motiv pentru care susțin că studii suplimentare sunt necesare pentru a clarifica problema potențialului regenerativ al musculaturii striate masticatorii.

Mușchii masticatori reprezintă încă un subiect cu multe necunoscute. Se vede necesitatea unor studii ulterioare care să genereze și să confirme ipoteze general valabile în ceea ce privește implicarea nișelor stem în regenerarea musculară.

Bibliografie

1. Wang W, Wang J, Lu HY, et al. The effects of increasing occlusal vertical dimension on the deep masseter of rat at different ages. Archives of oral biology 2017; 74: 12-20.

2. Zhang Y, Wang X, Zhang M, et al. The trophic effect of ciliary neurotrophic factor on injured masseter muscle in rat. Iranian journal of basic medical sciences 2015; 18(9): 920-6.

3. Zhou D, Bai Y, Che X. Ultrastructural and proteomic alteration of superficial masseter muscle after lower jaw sagittal advancement in rat. Archives of oral biology 2012; 57(5): 436-44.

4. Xu LB, Wang ZX, Qi D, et al. [A preliminary study on the effects of the exogenous creatine phosphate on rat masseter muscle after unilateral chew]. Hua xi kou qiang yi xue za zhi = Huaxi kouqiang yixue zazhi = West China journal of stomatology 2010; 28(4): 348-51.

5. Abe S, Kasahara N, Amano M, Yoshii M, Watanabe H, Ide Y. Histological study of masseter muscle in a mouse muscular dystrophy model (mdx mouse). The Bulletin of Tokyo Dental College 2000; 41(3): 119-22.

6. Rusu M. Anatomia dezvoltării orofaciale. București: INFOMEDICA; 2003.

7. Sadler TW. Langman's Medical Embryology. 12th ed.

8. Boboc G. Aparatul dento-maxilar – Formare și dezvoltare. a II-a ed. București; 2003.

9. Keith A. Human Embryology and Morphology. fourth edition ed; 1921.

10. Noden DM, Francis-West P. The differentiation and morphogenesis of craniofacial muscles. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists 2006; 235(5): 1194-218.

11. Scott JH. The growth and the function of the muscles of mastication in relation to the development of the facial skeleton of the dentition. American journal of orthodontics 1954.

12. Pasat I. Atlas de Anatomia Omului – Capul și Gâtul. București.

13. Gray H. Gray's Anatomy – The Anatomical Basis of Clinical Practice. Forty-first ed: Elsevier; 2016.

14. Toma C. Cursuri Histologie. 2011.

15. van Breemen VL. Ultrastructure of human muscle. Human Muscle; 1960.

16. Eisenberg BR. Quantitative ultrastructure of mammalian skeletal muscle. Handbook of physiology.

17. Dubowitz V. SAC, Oldfors A. Muscle Biopsy 4ed: Saunders; 2013.

18. Brooks GA, Fahey T.D., Baldwin K.M. Human Bioenergetics and Its Applications. 4 ed. London: McGraw-Hill Education – Europe; 2011.

19. Dvorak AM, Feng D. The Vesiculo–Vacuolar Organelle (VVO): A New Endothelial Cell Permeability Organelle. Th Journal of Histochemistry and Cytochemistry 2001; 49: 419-31.

20. Sell S. Stem Cell Handbook. Second ed. New York: Springer Science+Business Media; 2013.

21. Kumar A, Kumar S, Nishanth T. A Review on Stem cell Research & Their Role in Various Diseases.

22. Alison MR, Islam SA. Attributes of adult stem cells. Journal of Pathology 2009.

23. Weissman I, Anderson D, Gage F. STEM AND PROGENITOR CELLS: Origins, Phenotypes, Lineage Commitments, and Transdifferentiations. Annual review of cell and developmental biology 2001.

24. Wurmser AE, Gage FH. Stem cells: cell fusion causes confusion. Nature 2002; 416(6880): 485-7.

25. Li L. TX. Stem Cell Niche: Structure and Function. The Annual Review of Cell and Developmental Biology 2005; 21: 605-31.

26. Walker M, Patel K, Stappenbeck T. The stem cell niche. Journal of Pathology 2009.

27. Scadden DT. The stem-cell niche as an entity of action. Nature 2006; 441(7097): 1075-9.

28. Ema H, Suda T. Two anatomically distinct niches regulate stem cell activity. Blood 2012; 120(11): 2174-81.

29. Ashton N, de Oliveira F. Nomenclature of pericytes. Intramural and extramural. The British journal of ophthalmology 1966; 50(3): 119-23.

30. Birbrair A, Zhang T, Wang ZM, Messi ML, Mintz A, Delbono O. Pericytes at the intersection between tissue regeneration and pathology. Clinical science 2015; 128(2): 81-93.

31. Collins CA, Olsen I, Zammit PS, et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell 2005; 122(2): 289-301.

32. Zammit PS, Partridge TA, Yablonka-Reuveni Z. The skeletal muscle satellite cell: the stem cell that came in from the cold. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society 2006; 54(11): 1177-91.

33. Zimmerlin L, Donnenberg VS, Donnenberg AD. Pericytes: a universal adult tissue stem cell? Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology 2012; 81(1): 12-4.

34. Pannerec A, Marazzi G, Sassoon D. Stem cells in the hood: the skeletal muscle niche. Trends in molecular medicine 2012; 18(10): 599-606.

35. Yin H, Price F, Rudnicki MA. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological reviews 2013; 93(1): 23-67.

36. Cadot B, Gomes ER. Skeletal Muscle. In: Bradshaw R, Stahl, PD, ed. Encyclopedia of Cell Biology. 225 Wyman Street, Waltham, MA 02451, USA: Elsevier; 2016: 677-82.

37. Al-Qusairi L, Laporte J. T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases. Skeletal muscle 2011; 1(1): 26.

38. Standring S. Gray's anatomy: the anatomical basis of clinical practice: Elsevier Health Sciences; 2015.

39. Franzini-Armstrong C, Protasi F, Ramesh V. Shape, size, and distribution of Ca(2+) release units and couplons in skeletal and cardiac muscles. Biophysical journal 1999; 77(3): 1528-39.

40. Fill M, Coronado R. Ryanodine receptor channel of sarcoplasmic reticulum. Trends in neurosciences 1988; 11(10): 453-7.

41. Rossi AE, Boncompagni S, Dirksen RT. Sarcoplasmic reticulum-mitochondrial symbiosis: bidirectional signaling in skeletal muscle. Exercise and sport sciences reviews 2009; 37(1): 29-35.

42. Sorrentino V. Sarcoplasmic reticulum: structural determinants and protein dynamics. The international journal of biochemistry & cell biology 2011; 43(8): 1075-8.

43. Boncompagni S, Rossi AE, Micaroni M, et al. Mitochondria are linked to calcium stores in striated muscle by developmentally regulated tethering structures. Molecular biology of the cell 2009; 20(3): 1058-67.

44. Lai FA, Erickson HP, Rousseau E, Liu QY, Meissner G. Purification and reconstitution of the calcium release channel from skeletal muscle. Nature 1988; 331(6154): 315-9.

45. Lai FA, Erickson H, Block BA, Meissner G. Evidence for a junctional feet-ryanodine receptor complex from sarcoplasmic reticulum. Biochemical and biophysical research communications 1987; 143(2): 704-9.

46. Gerasimenko O, Gerasimenko J. New aspects of nuclear calcium signalling. Journal of cell science 2004; 117(Pt 15): 3087-94.

47. Amchenkova A. A. BLE, Chentsov Y. S., Skulachev V. P., Zorov D. B. Coupling Membranes As Energy-transmitting Cables I. Filamentous Mitochondria in Fibroblasts

and Mitochondrial Clusters in Cardiomyocytes. 1988.

48. Skulachev VP. Mitochondrial filaments and clusters as intracellular powertransmitting cables. Biochemical Science 2001; 26.

49. Cooper GM. The Cell: A Molecular Approach. second ed. Sunderland, Massachusetts: Sinauer Associates; 2000.

50. Mandelkow E, Mandelkow EM. Microtubules and microtubule-associated proteins. Current Opinion in Cell biology 1995; 7: 72-81.

51. Yaffe MP. The machinery of mitochondrial inheritance and behavior. Science 1999; 283(5407): 1493-7.

52. Anesti V, Scorrano L. The relationship between mitochondrial shape and function and the cytoskeleton. Biochimica et biophysica acta 2006; 1757(5-6): 692-9.

53. Clark KA, McElhinny AS, Beckerle MC, Gregorio CC. Striated muscle cytoarchitecture: an intricate web of form and function. Annual review of cell and developmental biology 2002; 18: 637-706.