1. Caracteristici generale ale micropropagării in vitro . 2. Procesele morfo -fiziologice la nivelul explantelor sau a inoculilor cultivați in vitro… [619263]

1
ADRIANA PETRUS

BIOTEHNOLOGII VEGETALE
(curs pentru uzul studenților)

Oradea, 201 6

2 CONȚINUTUL CURSULUI

1. Caracteristici generale ale micropropagării in vitro .
2. Procesele morfo -fiziologice la nivelul explantelor sau a inoculilor cultivați in vitro
(regenerarea, dediferențierea, diferențiere, morfogeneza) .
3. Biochimia proceselor morfogenetice in vitro .
4. Etapele și condițiile de vitrocultură și efectul lor asupra plantulelor regenerate in vitro .
5. Aclimatiza rea vitroplantulelor la mediul septic de viață .
6. Tipuri de vitroculturi la cormofite .
7. Aplicații ale biotehnologiilor vegetale în ameliorarea plantelor. Variabilitatea somaclonală in
vitro . Selecția in vitro de linii celulare. Mutageneza experiment ală in vitro . Hibridarea
somatică. Plante transgenice. Semințe sintetice.
8. Avantajele și dezavantajele micropropagării in vitro .
9. Definirea unor termeni de biotehnologie vegetală.
10. Bibliografie recomandată.

1. Caracteristici generale ale micro propagării in vitro

Domeniul culturilor de țesuturi și celule vegetale reprezintă nu numai o ramură de bază a
biotehnologiilor moderne, aceea a biotehnologiilor vegetale, ci și o direcție de cercetare care are
drept scop examinarea reactivității celulel or, țesuturilor, organelor sau a plantulelor la cultura in
vitro , precum și a reacției vitroplantulelor la condițiile naturale de viață, în momentul transferării
lor ex vitro , în funcție de condițiile ecofiziologice la care trebuie să se adapteze în si tuația
scoaterii lor din recipientele de cultură, dar și în funcție de proveniența materialului biologic
inoculat , de originea și natura explantelor și de condițiile ecologice , optimale, în care au crescut
plantele mamă, donatoare de explante.
An de an, co ntinuă să se descopere noi aspecte, de natură fundamentală sau aplicativă,
referitoare la particularitățile de reactivitate ale fitoinoculilor, în dependență de factorii de mediu,
cu referire la micropropagare. Atât implicațiile teoretice, cât și cele econ omice ale biotehnologiei
vegetale nu pot fi pe deplin previzibile. Progresele științifice și tehnice realizate în secolul XX au
facilitat evoluția rapidă a cercetărilor în domeniul biotehnologiilor vegetale, permițând – totodată
– acumularea de elemente te oretice, indispensabile în obținerea de noi succese în domeniul
cultivării in vitro a țesuturilor și celulelor vegetale și mediatizarea lor eficientă în mediile
interesate.

3 SCHAEFFER (1990) definea micropropagarea ca fiind o înmulțire clonală in vitro a
plantelor, pornind de la diferite explante, în general, cu o proliferare accelerată de lăstari.
După ZAID și colaboratorii (1999), micropropagarea reprezintă multiplicarea
miniaturizată in vitro a plantelor și regenerarea materialului vegetal într -un m ediu aseptic,
controlat, pe medii de cultură care conțin substanțe de creștere specifice.
Micropropagarea este o metodă rapidă de multiplicare a plantelor, folosită de decenii la
scară industrială. Multe laboratoare produc plante prin micropropagare, cu aj utorul unor
protocoale bazate pe descoperirile din trecut, dar ele dețin și tehnici recente, cu impact economic
important, în vederea multiplicării, atât a speciilor ierboase, cât și a plantelor lemnoase
(PREECE și READ, 2003). Este cunoscut faptul că, pr in micropropagare se obțin clone ale
plantelor mamă, totuși, JAMES (după DESJARDINS, 2005) a arătat că mutațiile pot fi un
fenomen comun în culturile de țesuturi la bananier, mai mult de 14% fiind atribuite metilării
ADN -ului. Ideea de clonare a plantelor a luat naștere încă începând cu anul 1838, când
SCHLEIDEN și, în anul următor, SCHWANN (1839) au formulat ipoteza totipotențialității
celulare, potrivit căreia la baza structurii organismelor fiecare celulă posedă toate informațiile
genetice de care aceast a are nevoie pentru formarea unui nou organism (GAUTHERET, 1959,
1985).
În anul 1902, botanistul german HABERLANDT și -a publicat punctul său de vedere,
potrivit căruia celulele plantelor sunt totipotente, asemănător zigotului. Atel, cultivate in vitro , pe
medii artificiale – adecvate asigurării vieții acestora – ele pot regenera o nouă plantă.
Descoperirea auxinelor de către KÖGL și HAAGEN – SMITH (1931) a făcut ca
GAUTHERET și NOBÉCOURT în anii 1938 – 1939) să utilizeze în vitroculturile vegetale
succe se în domeniul menținerii culturilor de țesuturi, la plante, în regim de vitrocultură
(CACHIȚĂ, 1987 ).
În anul 1957, SKOOG și MILLER au publicat un articol cheie, în care s -a lansat ideea
potrivit căreia, la plante, creșterea sau morfogeneza sunt determin ate de interacțiunile cantitative
și calitative dintre auxine și citochinine. Studiile lor, făcute pe explante de Nicotiana tabacum , au
indicat faptul că, în general, prezența în mediile de cultură a unei cantități mai mari de auxină,
față de citochinină, induce rizogeneza , iar inversul situației, respectiv o pondere mai ridicată de
citochinină, în raport cu aceea de auxină, provoacă formarea de lăstari ( caulogeneza ). Acest
raport – auxină/citochinină – a fost denumit de către SKOOG și MILLER ca balanță ho rmonală .
MURASHIGE (1974) și-a adus o contribuție însemnată în dezvoltarea tehnologiilor
micropropagării plantelor prin descrierea stadiilor ce trebuie parcurse pentru desăvârșirea
acesteia , precum și a constituenților importanți care nu pot lipsi din comp oziția mediului de
cultură. MURASHIGE a definit patru stadii ale micropropagării: I. Inițierea culturii aseptice; II.

4 Multiplicarea propagulilor; III. Preaclimatizarea vitroplantulelor în vederea transferării lor ex
vitro și IV. Transferarea vitroplantu lelor în mediul septic de viață .
Multe descoperiri importante petrecute în decursul evoluției tehnologiei în domeniul
nutriției plantelor, a creșterii și morfogenezei, precum și a multiplicării in vitro a celulelor și
țesuturilor vegetale, au servit la d ezvoltarea micropropagării speciilor de interes economic,
ramură a biotehnologiilor vegetale cu o deosebită valoare practică .

2. Procesele morfofiziologice la nivelul explantelor sau a inoculilor cultivați in
vitro

1. Regenerarea
Regenerarea e ste capacitatea unor celule vii sau a oricărei părți din acestea de a -și reface
oricare parte distrusă, fiind o formă de autoconservare După cum preciza MURASHIGE (1984),
totipotența este deținută de către fiecare celulă a plantelor, dar exprimarea sa este “încredințată”
numai anumitor tipuri de celule, celule numite “meristemoizi”. Tot după MURASHIGE,
meristemoizii sunt celule competente morfogenetic în a răspunde la variați stimuli interni sau
externi și care, în condiții specifice, pot da naștere la tul pini, la rădăcini sau la embrioni. Atunci
când meristemoizii se disting la nivelul inoculilor cultivați in vitro ori la suprafața calusului, ei se
caracterizează prin delimitarea – pe suprafața culturii – a unor mici centri (noduli), cu celule
deținând pereți subțiri, nuclei mari, citoplasmă densă și vacuole mici (aspect caracteristic
celulelor meristemelor apicale și celor din embrionii imaturi).
O serie de inoculi nu răspund condițiilor de cultură, la nivelul așteptărilor și – în calitate
de operatori – nu suntem întotdeauna în măsură să stăpânim, în totalitate, procesele de
morfogeneză ori sintezele endocelulare (de exemplu producerea unor principii active). În atenția
cultivatorilor de explante vegetale in vitro se află două probleme importante, și anume: 1. găsirea
criteriilor care să permită selectarea acelor forme de explante și acelor condiții de cultură care să
asigure o creștere a incidenței centrilor meristematici pe unitate de suprafață; 2. căutarea căilor
celor mai eficiente de stimulare dir ijată a diferențierii celulelor și a exprimării morfogenezei, la
nivelul meristemoizilor.
Apariția centrilor meristematici, adeseori, constituie o problemă și în cazul plantelor cu
ridicată capacitate regenerativă. Astfel, MEINS, FOSTER și LUTZ (1982) (din MURASHIGE,
1984) apreciau că la calusul de tutun, inițiat proaspăt, un meristemoid se găsește la 1.000 până la
10.000 de celule.
Principalii factori care influențează procesul de regenerare in vitro sunt: specia de la care
s-a prelevat explantul; vârsta exemplarului vegetal sau a organului donator de explante; faza de

5 dezvoltare în care se află planta respectivă; condițiile în care sunt incubate explantele sau inoculii
în precultură, cu referire la: lumină, temperatură, agenți chimici și fizici etc.
La graminee, ca și la alte angiosperme, regenerarea la nivelul inoculilor cultivați in vitro
are loc pe trei căi principale (după VASIL, 1984), și anume:
1. depresarea meristemelor caulinare existente în explante;
2. organizarea “de novo” de meristeme;
3. formarea de embrioni somatici.
Primele două căi citate de VASIL permit o multiplicare clonală, limitată; cultura
embriogenă constituie, însă, o sursă nelimitată de înmulțire clonală. Gradul de manifestare a
capacității regenerative, la explante prelevate din diferite părți ale organismului vegetal, variază
cu specia. El este determinat de caracterul legăturilor interne ale țesuturilor și celulelor respective
în sistemul integrat de structuri generative, specifice organismului în cauză.
Regenerarea se finalize ază prin:
a. formarea de calus, inițial neorganizat, acesta – la rândul lui – poate genera – în manieră
independentă – rădăcini, mugurași sau embrioni somatici;
b. formarea de mugurași, fapt care poate conduce la generarea de tulpinițe ce, ulterior – în
porțiunea lor bazală – pot să diferențieze rădăcini, constituindu -se astfel, în final, la nivelul
explantului, o plantulă;
c. formare de rădăcini, care, arareori, pot da naștere la mugurași;
d. formarea de embrioni somatici, care prezintă o structură morfoan atomică identică cu
cea a embrionilor zigotici, ei deținând atât rădăciniță, cât și tulpiniță și muguraș.
Pentru ca regenerarea să aibă loc, inoculul (respectiv explantul) trebuie să găsească în
mediul lui de viață, toate condițiile necesare reluării proce selor vitale, la cote optime. În al doilea
rând, el trebuie să dețină o dimensiune corespunzătoare, care să nu scadă sub ceea ce se cheamă
”masă critică”, în funcție de care se stabilește apoi necesarul de “factori prag“, factori limită, fără
de care regen erarea iar, mai apoi morfogeneza, pot să stagneze, iar inoculul sau explantul să nu
urmeze calea dorită.

2. Dediferențierea
Celulele explantelor inoculate pe medii aseptice, pentru ca să își reorganizeze un mod de
viață, trebuie să sufere un proces de co nversie (suferind modificări morfologice și metabolice),
respectiv din celule definitivate structural și funcțional, acestea să treacă la starea de celule
meristematice, apte de multiplicare, proces numit dediferențiere.
Această dediferențiere implică ins tituirea – la nivel celular – a unor schimbări, care atrag
după sine modificări de natură morfofiziologică, respectiv instalarea întregului ansamblu

6 funcțional specific stării de celulă meristematică, aptă de diviziune. Aceste transformări se
produc grada t.
Aptitudinea celulelor explantelor inoculate “in vitro“ de a se dediferenția este foarte
inegal răspândită la celule, țesuturi și organe variate, în cadrul aceleiași specii și, într -o măsură și
mai mare, la specii sau genuri diferite. O condiție de bază este aceea ca celulele să fie vii și să nu
se găsească într -un proces avansat de senescență.
Fazele de dediferențiere celulară pot fi subdivizate astfel:
I. Prima fază de dediferențiere :
a – amorsarea proceselor de dediferențiere;
b – producerea ded iferențierii celulelor, până la dobândirea caracte risticilor citologice
specifice unui țesut meristematic de tip secundar, cu celule aplatizate, asemănătoare, ca aspect și
structură, cu cambiul;
II. A doua fază de dediferențiere :
a – dediferențierea în c ontinuare a celulelor până la stadiul de celule cu caracter de
meristem primar; generarea, din meristemele neoformate, de promeristeme sau de meristemoizi
(centre organogene), ori de embrioni somatici , iar din aceștia, regenerarea de plante;
b – generarea – prin proliferarea celulelor dediferențiate – a unui calus neorganizat,
omogen structurat. La nivelul acestui țesut calusal se pot, apoi, forma meristemoizi sau centri
embriogeni.
În general, fenomenele intime legate de transformarea celulelor definitiv ate
morfofiziologic, în celule meristematice, respectiv dediferențierea “in vitro“ sunt, în mare parte,
asemănătoare cu procesele similare petrecute în cazul celulelor ce se dediferențiază, incorporate
fiind în plante sau în organele de care aparțin, ori î n condițiile multiplicării vegetative,
tradiționale. Se poate aprecia totuși că, dediferențierea celulelor explantelor, detașate fiind de
corpul plantelor sau din anumite organe (bulbi, tuberculi, rizomi etc.), se petrece în condițiile
“smulgerii” țesuturi lor din interdependențele în care acestea au crescut și au coexistat până la
momentul explantării, interpunându -se – odată cu explantarea – și întregul complex de factori și
stimuli care controlau relațiile intercelulare, exercitau totodată o represie asup ra manifestării
aptitudinii celulelor nedizlocate de a se dezvolta autonom (nesubjugate în contextul structural al
organismului integru) și respectiv a inhibării exteriorizării (a exprimării) totipotențialității
celulare. Problema dediferențierii, privită prin această prismă, ne conduce la concluzia că, ”in
vitro“ celulele pot – mai repede și mai ușor – să se dediferențieze, decât în condițiile menținerii
acestora la locul de origine.
3. Diferențierea este procesul opus dediferențierii și constă dintr -o ser ie de transformări
structurale, pe care le suferă celulele nediferențiate sau dediferențiate (meristemele), trecând

7 printr -o specializare morfologică (ultrastructurală) și fiziologică, dobândind caracteristici noi,
proprii celulelor adulte.
Diferențierea celulară in vitro nu este așa de variată, ca aceea cunoscută în cazul
ontogenezei, respectiv a histogenezei normale (GAUTHERET, 1966). in vitro , unele funcții sunt
mai reduse sau mai simplificate, în timp ce altele sunt amplificate. Pentru studiul citodiferențierii
(diferențierea celulelor specializate) se urmărește formarea elementelor lemnoase, a xilemului.
Acest tip de celule sunt ușor identificabile în culturile in vitro și pot fi studiați factorii care
concură la inițierea și susținerea xilogenez ei. În cultura de celule, celule prelevate din tuberculi
de Jerusalem artichoke , celulele de xilem se formează la cca 48 de ore de la inițierea culturii.
Până în prezent, nu au fost elucidate fazele exacte ale citodiferențierii.
În ceea ce privește histodi ferențierea (diferențierea țesuturilor), acest fenomen se petrece
pe măsura constituirii organelor. Structura morfoanatomică a organelor generate in vitro tinde să
ajungă la anatomia tipică a organelor de referință, de la plantele aflate în condiții natu rale.
Amploarea histodiferențierii este dependentă de gradul de dezvoltare al materialului biologic
neoformat in vitro , respectiv de măsura în care a progresat morfogeneza și organogeneza.

Morfogeneza
Morfogeneza reprezintă procesul de dezvol tare a formei și a structurii organelor, în urma
diferențierii histologice a celulelor, fenomen care se concretizează, în final, fie cu formare de
organe ( organogeneza ), fie cu generare de embrioni ( embriogeneză) .
Ca și în cazul citodiferențierii și al histodiferențierii , morfogeneza și organogeneza sunt
supuse comenzilor de natură fitohormonală și enzimatică, iar reacția celulelor este dependentă de
zestrea genetică, proprie fiecărei celule.
COGĂLNICCEANU, în anul 2002, a semnalat influenta câmpului elect ric extern
(impulsuri electrice cu forma, amplitudinea și durata controlate) asupra proceselor de
citodiferențiere si morfogeneza in vitro, în condițiile manipulării hormonale a plantulei –inocul
de tutun ( Nicotiana tabacum L. cv. Xanthi), aflată în faza po stcotiledonara de dezvoltare. Sub
influenta tratamentului electric extern, mai multe celule se sustrag mecanismelor integrative ce
asigura pattern -ul de dezvoltare postembrionară.
Regenerarea , organogeneza și embriogeneza , în situații dirijate, constitui e condiția
fundamentală în reușita multiplicării plantelor pe cale vegetativă, întrucât – în acest tip de
înmulțire – se operează cu organe sau cu fragmente de plante ori de organe, fragmente care
trebuie să refacă părțile, respectiv organele lipsă.

8 VASIL (1984) considera că factorul decisiv în menținerea (păstrarea) capacității
morfogenetice, se află în starea fiziologică și de dezvoltare a inoculului, respectiv a explantului,
în momentul inoculării acestuia.
Morfogeneza la culturile in vitro este influ ențată, în mare măsură, și de următorii factori:
1. conținutul endogen în fitohormoni și aportul exogen de regulatori de creștere; 2. natura și
concentrația sărurilor minerale prezente în mediul de cultură; 3. natura și concentrația glucidului
introdus în mediul de cultură; 4. prezența în substratul de cultură a unor aminoacizi; 5. prezența,
natura și concentrația gazelor (O 2, CO 2, etilena) dizolvate în mediu sau existente în atmosfera din
recipientele de cultură; 6. prezența în substrat a unor extracte com plexe, de origine biologică, sau
a cărbunelui activ; 7. factorii fizici: lumina (natura, intensitatea acesteia și fotoperioada),
temperatura etc.
ORGANOGENEZA (formarea de organe: rizogeneza și caulogeneza)) in vitro este un
proces foarte complex ca re depinde de o serie întreagă de fenomene biologice, aflate în
antecedența momentului explantării țesuturilor și depinde, într -o foarte mare măsură de genomul
celular.
 Rizogeneza (formarea de rădăcini)
Un anumit fragment explantat, în linii mari, se comp ortă ca un minibutaș. El diferă de un
butaș normal, întrucât butașul clasic, fiind mai mare, deține bogate rezerve endogene, în plus
acesta deține muguri și, eventual, frunze. Mugurii și frunzele pot, și după detașarea fragmentului
de pe planta –mamă, să si ntetizeze anumiți fitohormoni.
Explantul însă, din cauza dimensiunilor sale reduse și a detașării lui de organul căruia îi
aparține, nu mai beneficiază de “mesaje” și de “susțineri“ pe care să le primească de la mugurii
sau de la frunzele individului sau structurilor căruia i -au aparținut celulele sale, și – odată
explantat – el rămâne, în totalitate, dependent de mediul de cultură; explantul, detașat fiind de
sistemul în care se afla integrat, este lipsit de întreg “complexul rizocalinic” endogen, particu lar
fiecărei plante integre, precum și de o serie de alți factori endogeni corelativi, de care existența sa
este puternic legată. În acest caz, factorul genetic, mărimea explantului, vârsta plantei –mamă,
starea fiziologică a celulelor pe care le deține exp lantul etc. sunt tot atâția factori care concură în
evoluția ulterioară a cormofitoinoculului.
Uneori, însă, in vitro , se produce o pierdere a capacității rizogene, mai ales ca urmare a
practicării unor repicări (subculturi) succesive. Se pune probl ema păstrării sau a redobândirii – în
caz de pierdere – a capacității rizogene. Factorii care condiționează menținerea capacității
rizogene și, mai ales, cei ce cauzează pierderea aptitudinii rizogene, sunt încă în mică măsură
cunoscuți.

9 Rizogeneza, ca de altfel toate fenomenele de organogeneză, este declanșată de interrelația
dintre “efectori” și locul de acțiune al acestora, respectiv “receptorii”, respectiv, “terenul”
morfogenetic propice pentru ca “efectorii“ să acționeze. Prin “efectori” se înțelege c eva mai mult
decât fitohormonii, eventual acizi nucleici, sinteza proteică etc. (după MARGARA, 1982).
Uneori, explantele inițiale pot fi inapte de rizogeneză; această aptitudine poate fi însă dobândită,
în mod secundar.
Lumina poate exercita un rol poziti v asupra rizogenezei, dar numai la o intensitate slabă
sau în urma unei perioade scurte de acțiune a acesteia (la 600 lucși, cu o durată de acțiune de mai
puțin de o oră pe zi).
Temperatura optimă pentru rizogeneză este, de regulă, ceea de 26C. Uneori, însă, se
recomandă practicarea unor alternanțe între o temperatură scăzută și ridicată (15C și 5C), în
prezența luminii, a auxinei și a unui mediu bogat în glucide.
În cele mai comune cazuri, formarea rădăcinilor – ca și la butași – este localizată polar.
Rădăcinile se formează la polul radicular (bazal) al explantului, în timp ce generarea mugurilor
este localizată la polul foliar (apical). Aportul de auxină, în concentrații ridicate, poate perturba
polaritatea. La concentrații optime auxina stimule ază rizogeneza. Adeseori, însă, minibutașii pot
fi înrădăcinați și în absența totală a fitohormonilor.
 Caulogeneza (formarea de mugurași)
“In vitro“, formarea de mugurași , respectiv generarea de centri vegetativi, este esențială
atunci când se urmărește multiplicarea sau regenerarea unei plante ori a unui genotip, indiferent
de calea prin care acesta a luat naștere. Inducerea caulogenezei la nivelul inoculilor cultivați in
vitro , este stimulată de prezența în mediul de cultură a citochininelor, adeseori , în condițiile
asocierii acestora, cu auxinele. Neoformarea de mugurași la nivelul calusului se află sub controlul
interacțiunii celor două categorii de fitohormoni. Reușita neoformării de mugurași presupune nu
numai prezența celor două tipuri de regulato ri de creștere, ci și a realizării unui anumit raport
între auxine și citochinine – în dependență de proporția componenților – al cărui eficiență este
valabilă funcție de specie, de proveniența și natura inoculului, dar – uneori – și funcție de
numărul de repicări suportate de cultura respectivă, în antecedență.
În general, se acceptă posibilitatea echilibrării conținutului endogen de fitohormoni, cu
adaosul din afară de fitoregulatori de creștere, în substratul de cultură. Uneori, se poate declanșa
caulo geneza reducând concentrația de auxină în mediul de cultură. Alteori, de exemplu,
experiențe făcute pe explante prelevate din măduvă de tutun (LEE și SKOOG, 1965) au dovedit
că este posibilă favorizarea formării de mugurași, prin adăugarea în substratul de cultură a unor
compuși fenolici, care par să acționeze prin intermediul AIA oxidazei, indirect, asupra nivelului
endogen de auxină. Dar, se cunosc și exemple de reacție inversă a cormofitoinoculilor. SASTRI

10 (1963) menționa (la cultura de Armoracia rustic ana) că aportul de auxină a favorizat
neoformarea de mugurași, în timp ce sporirea conținutului de chinetină a inhibat caulogeneza.
La calus, în inducerea caulogenezei, uneori, se obțin rezultate pozitive prin cultivarea
succesivă a acestuia, într -o prim ă etapă, pe un mediu fie cu concentrație foarte ridicată de 2,4 -D
(10-6, sau 10-7 M), fie în prezența unei auxine mai slabe ca eficiență, dar administrată într -o
concentrație mai mare, (AIB sau ANA, 10-6,10-5 M), asociată, eventual, cu o citochinină,
intro dusă în mediul de cultură în concentrație moderată. Acest calus, subcultivat pe un mediu cu
aport scăzut în auxină și cu un conținut ridicat în citochinină, ar putea conduce la înregistrarea
declanșării proceselor de înmugurire, respectiv de caulogeneză.
Factorii fizici : lumina și temperatura din camerele de creștere, umiditatea și concentrația
de oxigen din interiorul vaselor de cultură, precum și calitățile fizice ale mediului de cultură sunt
controversați în ceea ce privește efectele lor asupra caulogene zei, acțiunea acestora depinde
foarte mult de tipul inoculilor și de etapele de cultură parcurse anterior (CACHIȚĂ, 1987,
ROȘU, 1999).
A. Lumina . Acest factor are un efect clar asupra dezvoltării organizate, atât prin
intensitate cât și prin calitate și fotoperioadă, valorile optime fiind apropiate de necesitățile
plantei în condițiile naturale de viață.
Cu toate că numeroase specii necesită o anumită fotoperioadă pentru inducția florală, în
general se apreciază că neoformarea de mugurași este independent ă de fotoperioadă. Se cunosc
puține cazuri în care caulogeneza să fie favorizată de către o anumită fotoperioadă (de exemplu,
la Pelargonium caulogeneza este favorizată de o fotoperioadă lungă). Totuși, țesuturile explantate
de la diferite specii evidenția ză caulogeneză, preponderent, la lumină. Fragmente de
inflorescență, incubate la întuneric continuu, prezintă calusogeneză abundentă, dar nu și formare
de mugurași. La unele specii, inoculii – menținuți câteva zile la obscuritate – își pierd aptitudinea
caulogenă iar la gerbera și la freesie, după parcurgerea unei perioade de întuneric continuu,
inoculii florali – trecuți fiind la lumină continuă – vor genera mugurași.
B. Temperatura recomandabilă pentru desfășurarea optimă a proceselor de caulogeneză
este, în general, aceea de 25C, dar adesea este necesară alternarea temperaturilor, în corelație cu
fotoperioada.
C. Umiditatea relativă din interiorul vaselor de cultură influențează tipul de dezvoltare
organizată, aceasta trebuind să aibă valori apropiate d e 100%.
D. Oxigenul și factorul geotropic . Atât la hortensie cât și la garoafe, se întâlnește,
frecvent, la rădăcini, fenomenul de geotropism negativ ; rădăcinile, adeseori, în loc să se înfigă în
mediul de cultură, se orientează în sens invers, înspre desc hiderea flaconului. Se poate aprecia
faptul că, în asemenea situații, nevoia de oxigen face ca rădăcinile, în loc să fie geotropic

11 pozitive, să se îndrepte în sens invers forței de acționare a gravitației, respectiv spre gura
recipientelor; s -ar putea însă să existe și o pierdere a capacității rădăcinițelor respective de a mai
percepe forța gravitațională.
E. Calitățile fizice ale mediului de cultură . Utilizarea alternativă (sau la un moment dat) a
mediilor lichide și a celor solide poate exercita un efect benefic asupra producerii proceselor de
morfogeneză. Astfel, de exemplu, la orhidee, menținerea protocormilor în stare submersă
favorizează multiplicarea acestora, dar este inhibată organogeneza. Trecerea protocormilor din
mediul lichid pe mediu agarizat d eclanșează organogeneza. Dacă, după o perioadă de menținere a
protocormilor pe mediu agarizat, se submersează protocormii, prin acoperirea lor cu soluție
nutritivă diluată, sau chiar cu apă distilată, sterilă, se reușește o stimulare a proceselor de
organo geneză (CACHIȚĂ, 1983). Probabil că, în cazul protocormilor, trecerea acestora de la
starea de submersie, la cultură în atmosferă și, apoi, din nou la stare submersată face ca unele
reacții metabolice, enzimatice, să declanșeze înlăturarea barierelor fizio logice care represează
procesele de organogeneză. pH -ul mediului de cultură este de regulă corectat înainte de
autoclavare la valori cuprinse între 5 și 6.
Alterarea cariotipului nu este, întotdeauna, motivul pierderii aptitudinii organogene a
culturilor ( SACRISTAN și MELCHERS, 1969). Unele cauze fiziologice, cum ar fi dispariția sau
blocarea unor “factori” endogeni esențiali, de tipul “mesagerilor” sau al “receptorilor”, ori chiar
al unor factori trofici, ar putea fi implicați în acest fenomen, pe lângă e lementul genetic.
S-a constatat că există tipuri de explante care generează ușor atât rădăcini, cât și tulpini.
La crizanteme, explantele constând din: meristeme, fragmente caulinare diverse (nod, internod,
teacă, pețiol, peduncul floral etc.) sau cele con stând din rădăcini, diferențiază ușor mugurași
(LAZĂR și CACHIȚĂ, 1980 -1985).
La alte specii vegetale, explante prelevate de pe o aceeași plantă dovedesc aptitudini
organogene diferite. Astfel, la hortensie, meristemul și explantele nodale generează plantu le
complet conformate, dar rădăcinițele sunt firave și slab dezvoltate; explantele constând din
fragmente internodale (întregi sau secționate), orientate paralel cu suprafața mediului (de o
compoziție chimică identică cu cea a substratului pe care au cresc ut celelalte două tipuri de
inoculi), au generat rădăcini, fără a da naștere la mugurași.
Deosebită este capacitatea organogenă pe care o dețin componentele florale, începând cu
pedunculii florali, rahisul, zona bracteelor inflorescențelor și elementelor f lorale (sepale, petale,
stamine și pistil); aptitudinea regenerativă a acestora de a diferenția mugurași, tulpinițe, și
rădăcinițe este cu totul particulară și, uneori, spectaculoasă. Maturarea elementelor florale din
interiorul inflorescenței (respectiv s tarea fiziologică și stadiul de dezvoltare a țesuturilor de la
nivelul explantelor) limitează reactivitatea și organogeneza (CACHIȚĂ și LAZĂR, 1984).

12 Procesele de organogeneză in vitro privesc și formarea frunzelor pe tulpinițe. Dar, în
dependență de na tura explantelor utilizate în experimente (ovare, ovule), putem asista și la
fenomene de formare și de creștere a fructelor și semințelor, în cazul polenizării și fecundării
ovulelor in vitro , sau la creșterea ovarelor detașate din flori, în fazele incip iente de dezvoltare ale
acestora.
Cu toate că în literatura de specialitate abundă informațiile privind morfogeneza in vitro ,
nu se pot indica încă, modele generale de organogeneză și de embriogeneză, valabile în cazul
tuturor inoculilor cultivați in vitro . Se cunoaște încă, în mică măsură, gradul în care se poate
interveni eficient – în sensul dorit – în reglarea echilibrului endogen, de așa manieră încât să se
reușească redresarea unui dezechilibru produs la nivel de organ, țesut sau celulă (atât în condițiile
păstrării integrității sistemului în care se află incorporat fragmentul în cauză, cât și în cazul
explantării fragmentelor respective și a cultivării lor in vit ro).
EMBRIOGENEZA SOMATICĂ (formare de embrioni din celule somatice, ex. sporofitul ),
fenomen prezent la nivelul culturilor de celule, respectiv a suspensiilor celulare, sau la nivelul
unor explante – pețiol, limb, peduncul etc. – ori la nivelul calusului, presupune realizarea în
mediul de cultură, în cultură primară ori în subcultură, a unor condiții de mediu specifice relevării
acestui fenomen.
Embriogeneza somatică la plante este un proces morfogenetic complex prin care o
singură celulă somatică se poate divide și transforma în condiții speciale într -o structură bipolară
care se va dez volta generând în final planta întreagă, printr -un proces asemănător embriogenezei
zigotice.

Tipuri de regenerare prin culturi de țesuturi și celule vegetale Apex
sau
Dom
meristematic

lăstari
inducere
rădăcini

PLANTULE
Explante de
organe
și țesuturi

protoplaști

suspensii
celulare

calus

lăstari
adventivi

embrioni
somatici

13 3. Biochimia proceselor morfogenetice in vitro

La nivel biochimic o problemă centrală a studiului proceselor de morfogeneză o contituie
mecanismele moleculare care reglează secvențial evenimentele de proliferare celulară,
citodiferențiere și asamblare a celulelor în cadrul unor structuri de o mare complexitate.
Analizele biochimice asupra enzimelor, ca produși finali, în cadrul proceselor de
dezvoltare, pot oferi informații privind expresia genică caracteristică unui anumit tip de țesut
diferențiat. În plus, se cunosc variate enzime care ex istă în forme moleculare multiple, ca
izoenzime, cu aceeași activitate enzimatică la nivelul diferitelor celule dintr -un organism. Acestea
pot funcționa specific în anumite tipuri celulare sau în anumite stadii de dezvoltare și pot
constitui, astfel, marke ri a unor anumite evenimente metabolice din dezvoltarea țesuturilor.
Datorită avantajelor oferite screening -ul rapid al unui număr mare de izoenzime,
identificarea relativ ușoară și utilizarea unor cantități mici de extract, această metodă s -a dovedit
utilă, atât pentru analiza plantelor provenite din mediul natural de viață, cât și al vitroplantulelor.
Izoenzimele pot fi folosite ca markeri critici pentru analiza funcției genelor și reglării metabolice
în creșterea și difernțierea celulară, monitorizarea s tabilității liniilor celulare, identificarea
genelor hibride și a variantelor clonale, evaluarea posibilului stadiu de dezvoltare al culturii
celulare. Exprimarea unui marker biochimic caracteristic este determinată într -un stadiu timpuriu,
spre deosebire de cei mai mulți markeri morfologici , care pot fi detectați abia după difernțierea
organului sau țesutului respectiv. De aceea, izoenzimele pot constitui markeri ideali pentru
procesele induse în vitroculturi.
În acest sens, DRUART și colaboratorii (1982) , precum și MONCOUSIN și GASPAR
(1983), au arătat că activitatea peroxidazică se constituie într -un marcher în procesul de
rizogeneză. Performanțele atinse de exvitroplantule, postaclimatizare, depind de formarea de noi
și noi rădăcini, după transferarea l or ex vitro . Inducerea rizogenezei poate fi declanșată fie in
vitro , prin intermediul mediului de înrădăcinare, fie în momentul plantării în sol a
exvitroplantulelor. Important este ca sistemul radicular al exvitroplantulelor să se stabilizeze
funcțion al după amplasarea lor în sol, existând o relație direct proporțională între procentul de
supraviețuire, după aclimatizare, și calitatea rădăcinilor în „exvitrocultură” (PREECE și colab.,
1991). Peroxidazele intervin, alături de alți factori, și în menține rea sau decarboxilarea acidului
beta indolilacetic (AIA) (TRIFU și BĂRBAT, 1997), hormon care exercită o acțiune primară
asupra plasticității peretelui celular, prin acidifierea acestuia, precum și la nivelul enzimelor din
acesta, unele dintre ele fiind de tipul peroxidazelor.
KEVERS și GASPAR (1992), studiind corelațiile dintre rata de proliferare, mijloacele de
multiplicare, performanțele înrădăcinării și activitate peroxidazică – la vitroplantule de Kalmia

14 latifolia – au demonstrat că înrădăcinarea lăsta rilor generați in vitro este dependentă, în mare
măsură, de compoziția vitromediului utilizat în fazele antecedente de micropropagare.
Petruș vancea și colaboratorii (2004) au dozat activitatea peroxidazică (după metoda
descrisă de LÜCK, 1974) în rădăcin ițele vitroplantulelor, în momentul transferării lor în mediul
septic de viață, în cele ale exvitroplantulelor, aflate la finele perioadei lor de aclimatizare la
mediul ex vitro , precum și în cele ale plantelor cultivate în condiții de seră, la trei spec ii vegetale,
și anume: la crizanteme ( Chrysanthemum morifolium Ramat var. Lamet ), la violetele africane
(Saintpaulia ionantha ) și la orhideea Cymbidium hybridum. Autorii au concluzionat că,
activitatea peroxidazică la nivelul rădăcinițelor de crizanteme, d e violete africane și de orhidee a
fost foarte ridicată la vitroplantule și la exvitroplantule, față de aceea înregistrată la rădăcinile
plantelor din seră, ceea ce demonstrează, implicarea acestora în procesul activ de rizogeneză.
Făcând o comparație într e cele trei specii vegetale cu care s -a experimentat, activitatea
peroxidazică în rădăcinițe a prezentat sporurile cele mai ridicate față de martor – rădăcini
aparținătoare plantelor din seră – mai ales în cazul vitroplantulelor și a exvitroplantulelor de
crizanteme și de orhidee; rădăcinițele plantulelor de violete africane au avut o activitate
peroxidazică mai scăzută, sporurile la cele două categorii de plante, respectiv din „vitro” și din
ex vitro au fost de doar 77% și respectiv 88%, specie care s -a aclimatizat mai ușor și mai rapid la
condițiile mediului septic de viață, în momentul transferării ex vitro a vitroplantulelor, expresie a
faptului că funcționalitatea acestora a fost mai apropiată de normal, iar rizogeneza a fost
satisfăcătoare.

4. Eta pele și condițiile de vitrocultură și efectul lor asupra plantulelor regenerate in
vitro

În cadrul tehnicilor de cultivare in vitro a țesuturilor și celulelor vegetale trebuie să se
aibă în vedere respectarea unor etape (trepte) operaționale obligator ii, și anume:
1. înființarea unei culturi, respectiv obținerea unei culturi in vitro cu capacitate
regenerativă;
2. incubarea și creșterea dirijată a cormofitoinoculilor; ceea ce presupune nu numai
amorsarea proceselor regenerative, ci și a celor de morf ogeneză;
3. subcultivarea (repicarea sau transferarea – pasarea – culturilor);
4. conservarea culturilor;
5. transferarea ex vitro a vitroplantelor și aclimatizarea acestora la regimul de viață
septic.

15 DE CE AVEM NEVOIE?
1. Selecți e corectă a inoculului. Selecția materialului vegetal în vederea inițierii unei
culturi in vitro este problematică, având în vedere multitudinea de factori care pot influența
calitatea acestuia, și anume: genotipul, organul donor, vârsta fiziologică și ontogenetică,
anotimpul în care are loc prelevarea, dim ensiunea, starea fiziologică a plantei. Un inocul poate fi
reprezentat de un organ întreg, de un fragment de țesut sau chiar de celule izolate, care pot
proveni din orice parte anatomică a plantei: rădăcină, tulpină, frunză, floare, sămânță, hipocotil,
embrion, în funcție de obiectivele urmărite. Astfel, pentru multiplicare rapidă se folosesc apexuri
sau alte organe ale plantei (în funcție de specie) care dispun de o capacitate regenerativă ridicată;
în scopul obținerii de plante libere de viroze se foloses c explante de tip meristeme de 0,1 – 0,5
mm; plantele haploide (n) se obțin prin inocularea pe medii aseptice a anterelor sau a
microsporilor, iar pentru dezvoltarea de calus se utilizează orice explant de natură somatică, pe
medii cu adaos de regulatori d e creștere, de exemplu 2,4 -D.
2. Mediu de cultură optim . Mediile de cultură au o compoziție complexă, întocmirea
rețetelor, precum și natura substanțelor componente fiind stabilită prin numeroase cercetări.
Natura elementelor în mediile de cultură, combinația chimică și proporția substanțelor a
fost stabilită pe baza analizelor calita tive și cantitative făcute asupra cenușii diferitelor specii de
plante și a gazelor emanate la incinerarea acestora, precum și din experiențe de nutriție.
Indiferent sub ce formă chimică se adaugă elementele în mediu, trebuie să existe un
echilibru între c ationi (Ca2+, Mg2+, K+, Na+, NH2+) și anioni (SO 42-, NO 3-, PO43-). Unele
substanțe chimice pot imobiliza chimic unii ioni sau pot provoca precipitarea unor săruri. Unele
elemente, pentru, a fi mai ușor asimilate, se administrează sub formă de chelați (FeED TA).
Prezența sulfaților și a clorurilor sub formă de săruri de Ca, K, Mg etc., determină
extragerea din mediu a acestor substanțe și ca atare în mediu, se pot acumula, excedentar, ioni de
Cl-, și SO 42-, care vor acidifica mediul.
Mediile de cultură mai m ult sau mai puțin complexe, pot să fie solide (gelificate),
semisolide sau lichide. Uneori, recomandările privitoare la compoziția mediilor de cultură
variază de la un autor la altul, dar în limite relativ restrânse, dar în general, se compun din
substanțe anorganice: macronutrienți, micronutrienți și Fe chelatizat (FeEDTA), precum și dintr –
o serie de substanțe organice: vitamine, aminoacizi, glucide hormoni și un agent gelificant.
Există diferite rețete de medii de cultură, unele cu un conținut ridicat în săruri (mediul
Murashige – Skoog, 1962), altele cu un conținut moderat (mediul Nitsch – Nistch, 1969) sau cu
puține săru ri (mediul White, 1963), dar toate conțin componentele esențiale, organice și
anorganice, de care a dispus explantul în planta donoare intactă, de regulă printre acestea
numărându -se N, P, K, Ca, Mg, Cl, Fe, S, Na, B, Mn, Zn, Cu, Mo, Co, I. Alături de comp onenta

16 minerală, mediile de cultură trebuie să conțină vitamine, facultativ aminoacizi (de exemplu
glicina, acizul L – glutamic, acidul L -aspartic), hidrați de carbon (cu excepția culturilor
fotoautotrofe, care se induc pe medii lipsite de sursă de carbon precum zaharoza, glucoza,
fructoza), agar – agar (când se dorește solidificarea mediului) și uneori regulatori de creștere din
clasa auxinelor, citochininelor, giberelinelor sau etilena și acidul abscisic, compuși organici
diferiți de nutrienți, care, modi fică sub aspect cantitativ, creșterea și dezvoltarea inocului.

Rolul componentelor mediilor de cultură

A. Componente anorganice
 Apa este un constituent de bază al materiei vii (unele țesuturi conțin 95 -99% apă) . Ea
asigură mediul de dispersie pentru coloizii organitelor celulare. Scăderea conținutului în
apă produce pierderea turgescenței celulare la început, apoi moartea țesuturilor prin
deshidratare ireversibilă.
În cazul culturile in vitro pierderea apei se poate datora obturării defectuoase a
flacoanelor de cultură sau umidității scăzute în came ra de vegetație, care deshidratează atât
mediul, cât și țesutul. În această situație, mediul se concentrează prin pierderea apei și gelul cu
agar scade în volum și crapă. Acest fenomen provoacă o creștere a concentrației sărurilor în
mediu și necrozarea țe suturilor. Prevenirea acestei situații se face prin păstrarea în camera de
vegetație a unei umidității de 80% și transferarea inoculilor pe mediul proaspăt.
Scoaterea apei din țesuturi poate fi provocată și prin sterilizarea organelor în alcool.
Frunzele fără strat poros, florilor, fructele cu epicarp subțire, sunt sensibile la tratamentul cu
alcool, astfel că acest pas trebuie făcut cu prudență, un timp scurt; de aceea se preferă sterilizarea
cu hipoclorit de Ca sau de Na.
Pentru prepararea mediilor nutr itive se recomandă a se folosi apă deionizată sau
bidistilată. Deionizarea se face prin trecerea apei distilate prin coloane de rășini schimbătoare de
ioni. După unii autori această apă poate fi bogată în germeni, mai ales în cazul când coloanele de
rășini sunt folosite la intervale mari de timp. Bidistilarea apei se realizează în bidistilatoare. Apa
bidistilată trebuie păstrată în recipiente mari, bine închise, așezate la întuneric, în loc răcoros.
Periodic, se va înlocui apa distilată stocată și nefolosit ă.
 Macronutrienții (macroelementele) sunt elemente chimice de bază care intră în structura
materiei vii: C, O, H, N, S, P, K, și Ca. Prezența lor este indispensabilă în mediile de
cultură.
Proporția între diferite macro nutrienți variază de la o plantă la a lta, dar, în general se
apreciază că oxigenul alcătuiește 70% din materia vie, carbonul 18%, hidrogenul 10,5%, cele trei

17 elemente însumate deținând 98,5% din compoziția plantelor. P, K, S și N sunt participante cu
zecimi de procente. Ca și K joacă un rol i mportant în funcționarea celulei, în gradul de fluiditate
a citoplasmei, în schimbul ionic, în permeabilitatea membranei celulare etc. Î n organele și
celulele în care predomină lipidele, glucidele sau proteinele (fructe, semințe), estimările de mai
sus suf eră corecții importante. Ionii de Ca acționează în interacțiune cu cei de Mg trebuind să
existe un raport de echilibru fiziologic. Carența de Ca și Mg provoacă tulburări grave în colonia
de țesuturi, iar suprimarea lor din mediu, cauzează moartea celulelor în cca. 2 luni.
O parte mai redusă o au macroelementele: Mg, Na, Cl, Al, sub formă de ioni, în mediul
de dispersie sau în vacuole. Mg intră în molecula de clorofilă , Na joacă un rol important în
schimburile de ioni, dar excesul de Na poate cauza substitu irea K din celule și alcalinizarea
mediilor. Ionii de Ca în exces poate provoca acidifierea acestora, iar Al servește drept catalizator
într-o serie de reacții metabolice.
Aceste 12 elemente realizează cca. 99,99% din substanța vie.
Sărurile utilizate pent ru prepararea mediilor de cultură trebuie să prezinte un înalt grad de
puritate. Astfel:
 Necesarul de săruri cu conținut de azot pentru celulele și țesuturile cultivate "in vitro"
poate fi asigurat pe două căi: prin săruri anorganice (azotați, azotiți sau sulfați ori
carbonați de amoniu) sau prin săruri organice (aminoacizi: asparagina, glicina, tirozina,
în prezența unor vitamine din grupa B). Ionul azotic NO 3- este cel mai asimilabil
neputând fi substituit de ionii azotos (NO 2-) sau amoniu (NO 4+), primul cu efect toxic,
secundul cu valoare nutritivă mai scăzută și chiar toxic. Mo și Mn activează însă
reducerea nitraților în nitriți. Asimilarea ionilor de amoniu este influențată pozitiv numai
la pH apropiat de neutru. Ambele componente (anionul azotic și ca tionul amoniu) ale
azotatului de amoniu (NH4NO3), utilizat la un pH cuprins între 5 și 7 sunt absorbite în
cantitate mare. La un pH acid (4 – 5) este a bsorbit mai mult amoniul (1:10) (Gautheret,
1959).
 Sărurile cu conținut de f osfor . Pentru prepararea medi ilor de cultură s e utilizează în mod
obișnuit KH 2PO 4 (acid ortofosforic) deși Nitsch și Nitsch au demonstrat că acidul
metafosforic este mai eficace. Excesul în P exercită un efect toxic, producând încetinirea
creșterii sau necrozarea țesuturilor și moarte a acestora după al II -lea și al III -lea pasaj.
 Sărurile cu conținut de s ulf. Compușii pe bază de S prezintă o valoare nutritivă
diferențiată; bisulfații și sulfații sunt mai asimilabili decât sulfurile. Uneori este mai
eficientă forma organică cu sulfcist eină. Carența de sulf induce o clorozare a țesuturilor
"in vitro". Excesul de S exercită un efect toxic care produce necrozarea țesuturilor, în
mod similar cu cel descris anterior pentru P.

18  Potasiul . Concentrațiile optime de săruri de K recomandate sunt de 10 mM. Lipsa de K
duce la necrozarea țesuturilor, așa cum excesul de K poate stimula evoluția unor țesuturi.
Aportul insuficient de KNO 3 ca și de Ca(NO 3)2 sau KI duce la o slăbire a ritmului de
creștere a țesuturilor. Carența în K poate fi cauzată și de i ntroducerea unei cantități
insuficiente de K în medii. Supradozarea cu K, Ca, Mg și N este în limite largi suportată
de țesuturile cultivate "in vitro", în timp ce excesul de S și P determină apariția de
necroze și cauzează moartea coloniei după 2 – 3 subculturi .

 Micronutrienții (microelementele) deși sunt necesari în cantități reduse, aceștia devin
indispensabil i în compoziția mediilor de cultură, exercitând un rol deosebit asupra
țesuturilor crescute "in vitro", deoarece intră în compoziția a numeroase c ombinații
organo -metalice, complex e, cu valoare biologică ridicat ă, alcătuiesc sisteme enzimatice –
metalo -enzimale (citocromoxidaza și peroxidaza) fără de care procesele vitale nu se pot
desfăș ura sau participă cu o cotă de miimi sau zecimi de miimi de proc ent, la alcătuirea
materiei vii. Suprimarea lor totală produce reducerea creșterilor cu 40% începând cu
primul cultură și provoacă moartea coloniilor la ce a de-a treia subcultură .
Carențele acute se semnalizează la lipsa din mediu a Fe, B, Mn, Zn și Cu, în special la a
III-a și a IV-a repasare. În schimb lipsa de Ni, Co, I și Al nu a creat fenomene de carență
evidente. Mo și Mn măresc ritmul de creștere al celulelor, iar carența în B inhibă proliferarea
celulelor meristematice ale rădăcinilor, dar induce o creștere celulară mai pronunțată. Borul
poate fi extras în medii din pereții vaselor din sticlă cu silicat de bor, motiv pentru care se
recomandă folosirea vaselor Pyrex, în cazul experiențelor de nutriție.
Fierul, molibdenul și manganul împreună măresc ritmul creșterii celulare. Fe intră în
compoziția unor metalo -enzime, este implicat în sinteza proteică, iar împreună cu Mo sporește
conținutul de proteine în celule și acumulare a în țesuturi de N neproteic. Cuprul este necesar
pentru creșterea rădăcinilor izolate de tomate, dar carența sa nu este letală ca în cazul altor
exemplare. Manganul este și el implicat în sinteza proteinelor, carența represând ARN din celule.
Mn este nece sar pentru creșterea rădăcinilor de tomate. Trebuie avută în vedere proporția între
Mn/Mg, deoarece Mn într -o serie de reacții metabolice provocând perturbații celulare grave. Se
va avea în vedere că unele substanțe chimice pot imobiliza chimic unii ioni s au pot provoca
precipitarea unor săruri.
Între ionii unui mediu de cultură se stabilesc anumite raporturi sau interacțiuni substituiri
complexate și prin prezența sărurilor organice. Opțiunea pentru un anumit mediu variază în
funcție de scopul urmărit, dar , în principiu se utilizează una din rețetele clasice de mediu (Knop,
Heller, Murashige -Skoog, White, Knudson, Gamborg, Nitsch, Linsmaier etc.). Aceste medii sunt

19 verificate și echilibrate sub raport compozițional și ionic, în dependență de necesitățile
fiziologice ale țesuturilor vegetale. În funcție de scopul cercetărilor este necesară deseori
modificarea rețetelor clasice, în care caz modificarea trebuie neapărat menționată precis pentru a
asigura reproductibilitatea experiențelor.

B. Componente organice

Din analiza compoziției chimice a sevei elaborate care circulă prin floem s -a stabilit
natura
produșilor care rezultă prin fotosinteză. S -a constatat că glucidele au rol preponderent, secondate
de aminoacizi, vitamine, săruri organice și apă. Pornind de la nevoile de substanțe organice ale
plantelor, s -au stabilit compușii necesari recomandați în compoziția mediilor de vitroculturi
vegetale. Acești compuși sunt:
– zaharoza, glucoza;
– aminoacizi: asparagina, serina, histidina etc.;
– vitaminele: piridoxin a, tiamina, acidul nicotinic;
– extractul de drojdie (aminoacizi și vitamine, în special tiamina);
– regulatori de creștere (auxine, citochinine);
– inozitol, acid pantotenic, colina;
– hidrolizatul de cazeină;
– sucuri naturale (de lapte din nucă de cocos , tomate, cartofi);
– agarul.
Dozarea acestora este în funcție de rezerva endogenă de hormoni prezenți în explante, de
scopul urmărit de operator și de condițiile de cultivare a țesuturilor sau a celulelor inoculate.

 Surse de carbon organic . Cu toate că inoculii sunt verzi, celulele lor deși posedă
cloroplaste, nu au capacitatea de a fi total autotrofe, menținerea lor în viață depinzând de
prezența u nei surse de carbon glucidic.
Țesuturile devin heterotrofe față de carbon. Cu timpul țesuturile se depigmentează,
semnal că în mediul de cultură sunt absenți compuși implicați în sinteza clorofilei, ori a slabei
funcționări a cloroplastelor. Acest fenomen de anemie clorofiliană, se poate datora și lipsei de
fier. Fierul poate fi ușor imobilizat în mediul de cultură prin legarea lui chimică, în forme
inaccesibile sau greu accesibile. Suplinirea lipsei de elaborare a substanțelor energetice se face
prin adăug area în mediu de surse de carbon, precum:

20 – glucidele de origine vegetală, ca rezultat al activității fotosintetice. Cea mai eficientă
formă de glucide o constituie zaharoza. Limitele de concentrație sunt cuprinse între 1,2 –8% (12
– 80 g zaharoză la 1000 ml mediu de cultură). Concentrația optimă este de 2%. Sunt situații când
se cer concentrații de 8% la care zaharoza fără a devenii toxică este mai puțin eficientă. Glucoza
se situează pe un al doilea plan (la concentrații de 2 –5%). În anumite experimente p ot fi utilizate
și alte glucide: fructoza, maltoza, rafinoza iar uneori polizaharide: pectina, dextrina și amidonul
în stare coloidală solubilă. Uneori prin autoclavarea mediului se produce o alterare a zaharozei,
prin procese de caramelizare. Se recomandă respectarea exactă a temperaturii de sterilizare prin
autoclavare sau utilizarea sterilizării prin filtrare.
– alcoolii , dintre care s ingurul eficient s -a dovedit a fi glicerolul ca substrat pentru
numeroase specii, dar creșterea biomasei este inferioară celei produse de glucide. În multe rețete
se recomandă adăugarea unei cantități de 100 mg/l (0,1%) mezo -inozitol, obținându -se o
îmbunătățire a creș terii celulelor .
– acizii organici au o valoare energetică minoră, respectiv 15 % din cea a zaharozei ca
sursă de carbon. Acizii fumaric, succinic și citric exercită un rol favorabil asupra creșterii (la
concentrație de 10 mM).
 Surse de azot organic. Țesuturile vegetale cultivate in vitro , ca și plantele superioare,
sunt autotrofe față de azot, preluându -l din substanțele organice. S-a constatat însă că ,
adăugarea unor surse de azot organic, duce la optimizarea creșterii și multiplicării
celulare. S-au dovedit a fi eficienți : glicocolul ( White , 1939), ureea și unele baze azotate
(alantonina și ornitina). Dintre aminoacizi, glicina, asparagina, tirozina , cisteina și
glutamina au un efect favorabil moderat asupra creșterii unor culturi.
 Vitaminele. Importanța lor în culturile de țesuturi vegetale a fost descoperită întâmplător
(Kotte , 1922) prin intuirea efectului lor asupra reușitei culturilor în care se adăugau
extracte de plante. Ele sunt prezente în toate mediile de cultură și sunt indispensabile unei
multiplicări și creșteri optime. Tiamina (vitamina B1) prezintă o valoare deosebită,
prezența ei stimulând creș terea biomasei celulare și tisulare. Piridoxina (vitamina B6)
este indispensabilă fiind precursorul unei serii de enzime. Acidul nicotinic (vitamina PP)
a fost utilizat încă din anul 1938 și este nelipsit în mediile de cultură. Riboflavina
(vitamina B2) ș i acidul pantotenic (vit amina B5) sunt în mică măsură recomandate în
rețetele de medii. Se folosește cu mai bune rezultate pantotenatul de calciu. Vitamina B12
(cobalamina) a fost mai rar folosită în special în culturile tumorale. Biotina (vitamina H)
are e fecte stimulatoare în proliferarea celulelor. Acidul folic se pare că prezintă o acțiune
stimulatoare în creșterea țesuturilor tumorale, menținute la lumină. Ac idul ascorbic
(vitamina C), în concentrații de 1 -50 mg/l este recomandat ca agent antioxidant ai

21 produșilor melaminici, eliminați în mediul de cultură de către unele explante și care au o
acțiune nocivă asupra acestora.
 Regulatorii de creștere sunt compuși similari fitohormonilor, având a u un rol primordial
în multiplicarea, creșterea și diferențiere a explantelor cultivate in vitro , dar sunt de natură
exogenă și nu produși de către organismul plantei ca și fitohormonii .
Regulatorii de creștere utilizați în culturile in vitro sunt cuprinși în următoarele grupe
funcționale: auxine, gibereline, citoc hinine, acidul abscisic și etilenă și au comun faptul că
exercită o acțiune funcțională fitoreglabilă, la diluții extrem de mici: 10-6, 10-8 mol/l .
– auxinele sunt substanțe cu acțiune directă asupra creșterii celulelor, fiind utiliza te mai
frecvent în cul turile de țesuturi, au acțiune stimulatoare în rizogeneză. Cele mai importante dintre
auxine sunt: acidul 3 indolilacetic (AIA) singura auxina naturală, acidul 1 naftilacetic (ANA),
acid indolilbutiric (AIB), acidul 3 -naftoxiacetic (ANOA), acidul 2,4 – diclorfenoxiacetic (2,4 -D),
acidul p -clorfenoxiacetic (pCPA) . AIA este mai puțin stabil termic și se oxidează la lumină,
micșorându -i-se astfel eficiența. ANA este mai utilizat fiind stabil și eficient. Uneori se asociază
ANA cu AIB. 2,4-D este o auxină cu mar e eficacitate în formarea de calus și în rizogeneză. În
concentrații moderate fiziologic, impulsionează diviziunea celulelor la nivelul cambiului, dar
devine toxic la concentrații mai mari. În cultura de calus asigură o mare friabilitate, facilitând
separa rea celulelor în suspensii celulare și în embriogeneza somatică. Acidul p -clorfenoxiacetic
prezintă același mod de acțiune ca și 2,4 – D, dar este mai puțin toxic.
– citochininele stimulează procesel e de diviziune celulară , formare de calus și
caulogeneză. Cele mai importante citochinine sunt : chinetina sau 6-furfuril adenina sau 6 –
furfurilaminopurina (K sau Kin), b enziladenina sau 6-benzilaminopurina (BA sau BAP), z eatina
(citochinină naturală ), N-6-izopentiladenina (2 iP ).
În concentrații de 10-4 – 10-5 M, citochininele sunt folosite în scopul proliferării
meristemelor
axilare în culturi de apex, iar în doze de 10-6 – 10-7 M, în stimularea multiplicării celulelor în
explante tisulare cultivate "in vitro". La concentrații mai mari de 10-6 sunt utilizate pent ru
inducerea formării de embrioni somatici ori a mugurașilor la nivelul calusului.
În mediile destinate înrădăcinării, în general, se evită adăugarea de citochinine, întrucât
inhibă rizogeneza.
– giberelinele au acțiune similară și sinergică cu a auxinelor , dar influența lor se consideră
a fi la nivelul proceselor enzimatice (implicate în creștere), ele nu acționează direct asupra
proceselor de alungire a membranelor (ca auxinele). Acidul giberelic ( AG3) este esențial în
culturile meristematice la câteva sp ecii vegetale (cartof, tomate etc.), deoarec el influențează
alungirea zonei apicale axiale a meristemului caulinar. La lumină AG3 inhibă rizogeneza, în timp

22 ce la întuneric, în asociație cu auxina, o stimulează. Are acțiune sinergică cu auxinele și
citoch ininele. La foarte multe specii, inoculii evoluează mulțumitor și în absența acestui hormon.
– acidul abcisic (ABA) este foarte rar utilizat având un rol de inhibare a creșterii. Acest
compus es te utilizat în culturile de embrioni somatici, pentru inducere a intrării acestora în repaus
și în procedeele de conservare in vitro .
– etilena acționează asupra auxinelor endogene sau exogene adăugate în mediu,
intensificându -le activitatea , dar poate contribui la declanșarea fenomenului de hiperhidrie (o
formă de neoplazie apărută la nivelul vitroplantulelor) . Substanța comercială poartă denumirea
de E threl ( Ethefon),care prin descompunere eliberează etilena (gaz) și ac idul fosforic. Dacă
prezența ei este necesară în mediile de cultură, s e recomandă să fie adăugată prin filtrare la rece
în concentrații de 1 – 0,1 mg/l.
 Substanțe naturale complexe. Uneori se recomandă să se adauge în mediul de cultură
extracte proaspete sau liofilizate de:
– drojdie de bere, hidrolizat de cazeină;
– suc de fructe: portocale, tomate, lapte de cocos;
– extract de malț, de endosperm imatur de porumb (în faza de lapte).
De regulă, aceste extracte se folosesc în concentrații reduse (0,1 – 1 g/l), dozele fiind
reglate prin tatonări, compoziția chimică a acestor extracte fiind complexă.
 Cărbunele activ se recomandă a fi adăugat la unele medii de cultură în concentrații de 2
%. El favorizează la unele specii, creșterea țesutului în culturi de apex și de antere. S-a
constatat că pulberea de cărbune absoarbe unii compuși toxice rezultați în urm a
degradării zaharozei în timpul sterilizării prin autoclavare. Cărbunele activ absoarbe și
regulatroii de creștere prezenți în mediu, dar și unii compuși fenolici sau taninuri care
brunifică mediul de cultură și duc la necrozarea țesuturilor. El este reco mandat în cazul
culturilor de conifere.
 Agenți gelificanți. Agar -agarul este cel mai comun agent solidificator utilizat în
prepararea mediilor de cultură; el se prepară din unele alge roșii care habitează mările din
sudul Asiei și se dizolvă în apă bidisti lată sau direct în mediul de cultură dar prin
încălzire la minim 40 0C). Cantitatea de agar folosită este în funcție de rețetă, diferă în
funcție de calitatea acestuia, de la 0,6 – 1 %. Încercările de a înlocuii agarul cu gelatina nu
au reușit, deoarece ac easta nu permite aerarea mediului solidificat, schimburile ionice și
absorbția substanțelor din mediu fiind frânată. Cu rezultate mai bune se folosesc:
biogelurile, silicagelul sau gelurile de poliacrilamide sau alte sisteme precum filtrele de
hârtie, lign oscheletonul de luffa (Petruș – Vancea, 20 04).

23  Compușii speciali se folosesc temporar, în anumite culturi de țesuturi și celule,
protoplaș ti etc. D intre aceștia fac parte o serie de enzime: celulază, pectinază,
hemicelulază, macerozimă, iar cu utilitate de durată: glucide, sorbitol, manitol, riboză etc.
Enzimele sunt introduse în mediu pentru macerarea peretelui celular, iar glucidele
amintite anterior , fie pentru stabilirea unei presiuni osmotice optime, fie ca sursă de
carbon.
Mediile de cultură și apa distilată necesară în etapa de asepsizare a materialului vegetal se
recomandă a fi autoclavate la temperatura de 120 °C, adică la presiunea de 1 atmosferă, timp de
15 – 30 minute, în funcție de volumul mediului din recipiente. Mediile de cultură care conțin
substanțe termolabile se pot steriliza „la rece”, prin filtrare, fie cu nuci filtrante, fie cu filtre
Millipor.
3. Asepsia și asepsizarea
În scopul evidențierii infecțiilor, condiție de la sine înțeleasă pentru realizare a culturilor
de explante pe medii aseptice, trebuie asigurată o perfectă dezinfectare, respectiv sterilizare a
tuturor suprafețelor (mese, instrumentar, recipiente) și a materialului vegetal destinat prelevării
țesuturilor.
Asepsi zarea sau sterilizarea constă în operațiunea de îndepărtarea sau distrugerea
microorganismelor și a sporilor acestora, de pe suprafața și din interiorul obiectelor, prin diferite
căi (chimice, fizice).
Dacă materialul vegetal provine din mediul septic (nu dintr -o vitrocultură antecedentă),
acesta trebuie sterilizat, după prelevare. Metoda de asepsizare (doar chimică poate să fie) și
durata de sterilizare se alege în funcție de proveniența materialului utilizat, adică în funcție de
specie, cadrul ecologic, organul, țesutul, amplasamentul lui pe plantă, vârsta, fenofaz a etc. Ceam
mai comună procedură de asepsizare este aceea cu soluție de hipoclorit de sodiu (apă de Javel),
în diferite concentrații, la care se adaugă câteva picături de Tween 20 sau detergent, pentru a
micscora tensiunea superficială în lichidul dezinfecta nt, facilitând, astfel, contactul direct între
acesta și suprafața materialului vegetal.
Metode de sterilizare utilizate în biotehnologia vegetală
În tehnicile de culturi in vitro vegetale, sterilizarea poate fi realizată cu ajutorul agenților
fizici sau chimici .
A. Sterilizarea cu agenți fizici
Sterilizarea prin căldură uscată
 Sterilizarea prin flambare constă în trecerea obiectului de ste rilizat prin flacăra unui bec
de gaz sau a unei lămpi cu alcool, o dată sau de mai multe ori, timp de câteva secunde.

24 Prin acest procedeu se sterilizează pipetele Pasteur, pipetele gradate, pensele, bisturiele,
în momentul folosirii, gura baloanelor și a e prubetelor, înainte și după utilizare.
 Sterilizarea prin încălzire la plita electrică. Se sterilizează prin acest procedeu obiectele
metalice (ansele, acele spatulate). Acestea se țin în flacără până la înroșirea lor.
 Sterilizarea prin aer cald . Aerul încă lzit la 1600 –1800, în decurs de o oră, distruge toate
microorganismele. Acest mod de sterilizare se realizează în etuve (cuptor Pasteur sau
poupinel). Prin acest procedeu se sterilizează toată sticlăria de laborator: baloane,
eprubete, pipete gradate, pipe te Pasteur, cutii Petri, pâlnii, fiole, capsule, mojare, vasele
de cultură etc.
Obiectele de sterilizat trebuie să fie curate și uscate. Pipetele, cutiile Petri și
instrumentarul utilizat la hotă, se înfășoară prealabil sterilizării în folie de aluminiu. Folia va
asigura o protecție suplimentară în momentul transportului obiectelor sterilizate până la hota cu
flux laminar de aer steril.
Controlul sterilizării se face prin teste biologice utilizând o cultură de Bacillus subtilis. În
cazul în care sporii ac estei culturi nepatogene nu mai pot germina (când trec în forma
vegetativă), se consideră că sterilizarea s -a realizat corespunzător.
Sterilizare prin căldură umedă
 Sterilizarea prin fierbere . Prin fierbere nu se realizează o sterilizare perfe ctă, deoarece se
distrug numai celulele vegetative, nu și majoritatea sporilor. Prin acest procedeu se
sterilizează instrumente metalice (pense, foarfeci, bisturie), precum și seringile. Durata
fierberii este de 30 de minute. Pentru a împiedica ruginirea o biectelor sterilizate, în apă se
adaugă borax. Boraxul și carbonatul de sodiu ridică punctul de fierbere al apei la 105 0C.
 Sterilizarea prin vapori de apă sub presiune (autoclavarea). Este procedeul cel mai
eficace, ducând la obținerea unei sterilizări pe rfecte. Aparatul folosit pentru acest tip de
sterilizare este autoclavul . Prin autoclavare se sterilizează majoritatea mediilor de cultură,
aparatele din sticlă, cu garnituri de cauciuc, halate, vata, recipientele contaminate și
baloanele cu medii nutritiv e. Acestea din urmă se închid cu dopuri de vată. Sterilizarea
mediilor de cultură se realizează la o presiune de 1 atmosferă, căreia îi corespunde o
temperatură de 1210C, timp de 30 de minute.
Controlul sterilității realizată prin autoclavare se face prin teste biologice. În acest scop se
folosesc culturi sporulate, care rezistă la temperaturi ridicate (culturi sporulate de Bacillus
anthracis , rezistente la 115 0C și culturi de Bacillus stearothermophilus, rezistente la 121 0C
timp de 5 minute sau la 130 0C, timp de 1 minut).
Sterilizarea este eficientă dacă însămânțarea sporilor după autoclavare nu este urmată de
creșterea bacteriilor rezultate din germinarea sporilor. O metodă de verificare a atingerii

25 parametrilor de sterilizare corespunzători unei autocl avări corecte constă în utilizarea unui
colorant în amestec cu unele săruri cu puncte de topire diferit: β -naftol (p.t.=1100C), antipirina
(p.t.=1140C), acid benzoic (p.t.=1210C), fenacetina (p.t.=1350C) etc. Colorantul și substanța
control trebuie să fie miscibile între ele. Această metodă are însă un neajuns: nu se știe exact cât
timp s -a menținut această temperatură în autoclav.
 Pasteurizarea este o metodă incompletă de sterilizare, imaginată de Pasteur , prin care se
distrug numai celulele vegetative, nu și sporii. Ea se poate face prin încălzire la
temperatura de 60 – 65 0C, timp de 30 de minute, urmată de o răcire bruscă și menținerea
materialului sterilizat la rece – la 4 0C – pentru împiedicare germinării sporilor. Acest tip
de pasteurizare se numește pasteurizare joasă . Când se folosește temperatura de 70 -75 0C
pentru încălzire, timp de 10 – 20 minute, se realizează o pasteurizare medie . Dacă
lichidele supuse pasteurizării sunt aduse, într -un strat subțire, în contact cu suprafețe
încălzite la 85 -90 0C, timp de câteva secunde, se realizează o pasteurizare înaltă . Această
metodă se aplică lichidelor supuse unei alterări rapide și se folosește în mod curent în
industria laptelui.
 Tindalizarea este o metodă de sterilizare fracționată, preconizată de Tynda ll (în anul
1877), se utilizează pentru substanțele care se denaturează la temperaturi ridicate. Ea
constă din încălzirea repetată a materialului de sterilizat, timp de 30 -60 minute, la
intervale de 24 de ore, în trei zile consecutive. Această metodă se ba zează pe faptul că
eventualii spori transformați în forme vegetative între două încălziri succesive, vor fi
distruși la următoarea încălzire. Tindalizarea se realizează la temperatura suportată de
materialele care urmează să fie supuse sterilizării. Astfel , mediile cu zaharuri se
tindalizează la 100 0C.
Sterilizarea prin raze ultraviolete
Razele UV distrug celulele vegetative, dar au o acțiune mai redusă asupra sporilor. Se
sterilizează prin acest procedeu aerul și suprafețele din interiorul ca merei de inoculare, întrucât
aceste radiații modifică structura particulelor polarizate dextrogir distrugând acizii nucleici, fapt
care are ca urmare obținerea de radicali liberi și peroxizi, agenți oxidanți și/sau reducători, care
acționează asupra microo rganismelor omorându -le. Această metodă are însă un neajuns, prin
faptul că în timpul sterilizării se produc cantități relativ mari de ozon, gaz toxic organismului
uman. Astfel, pentru ferirea personalului, se impune ca înaintea începerii activităților în camerele
sterilizate cu raze UV, se lasă să se producă difuzia pasivă a ozonului, operație care ține
aproximativ 30 de minute.
Sterilizarea prin ultrasunete

26 Ultrasunetele sunt vibrații acustice (cu o frecvență de peste 20.000 de Hz), care se o bțin
în aparate speciale ce permit trecerea unui curent alternativ de înaltă frecvență, printr -un cristal
de cuarț. Vibrațiile masei cristalului de cuarț, sub acțiunea impulsurilor electrice, duc la
dezintegrarea rapidă a celulei bacteriene.
Sterilizarea prin filtrare
Sterilizarea prin filtrare constă în trecerea lichidelor printr -o masă poroasă cu pori de
dimensiuni mici, care rețin microorganismele cu diametru mai mare decât al ochiurilor rețelei
filtrante. Virusurile trec prin porii acestor filtre. Se sterilizează prin această metodă mediile de
cultură care conțin compuși chimici care se denaturează la cald. Filtrarea nu trebuie considerată
ca simplu fenomen mecanic, în care filtrul se comportă ca o sită, ci este un fenomen complex, la
baza căruia stă adsorbția sau cernerea (în funcție de tipul filtrului) particulelor din lichidul de
filtrat, de către pereții capilarelor care formează porii filtrului.
Cele mai eficiente filtre, sunt cele cu membrană, realizate din fire obținute din esteri ai
celulozei asociate cu clorura de polivinil, nailon sub formă de discuri subțiri, rezultând o rețea de
pori fini care reprezintă 80% din suprafața totală, 20% fiind țesătura. Mărimea porilor este
variabilă, de la 0,22 μm – 14 μm.
Pentru filtrarea sterilizan tă se utilizează filtrele Millipore cu diametrul ochiurilor de 0,22
μm. Acestea prezintă avantajul că nu cedează particule în soluția care se sterilizează, și nu
reacționează cu lichidul de filtrat. De asemenea, se pot steriliza prin autoclavare. Ca dezava ntaj,
se poate aminti imposibilitatea reutilizării acestora după filtrare (spre deosebire de filtrele din
ceramică sau din sticlă sintetizată).

B. Sterilizare cu agenți chimici
Pentru sterilizarea cu agenți chimici este folosit în special termenul de dezinfecție .
Agenții chimici dezinfectanți , de uz curent sunt:
• Soluția de sublimat corosiv 0,1%, utilizată pentru dezinfecția mai riguroasă a mâinilor,
meselor, mobilierului din sticlă și faianță;
• Alcool etilic 70%, pentru dezinfecția curentă a mâin ilor;
• Soluția de bicromat de potasiu 5%, pentru dezinfecția pipetelor utilizate;
• Formol 5%, pentru dezinfecția obiectelor din sticlă, faianță, metal etc.;
• Apa oxigenată (în concentrație de 3%), pentru dezinfecția mâinilor și mucoaselor;
• Soluția de permanganat de potasiu 0,1%, pentru dezinfecția mucoaselor;
• Soluția de hipoclorit de sodiu 2 -5%, soluție de hipoclorit de c alciu 10%, clorură
mercurică 1% etc, pentru dezinfectarea materialului vegetal.

27 4. Selecția corectă recipientelor de vitrocultură rămâne la lati tudinea fiecărui laborator
și se face în funcție de: instrumentarul utilizat la inoculare, volumul necesar de mediu de cultură,
numărul și mărimea inoculilor viteza și modul de creștere al acestuia. În cercetare, este
obligatorie utilizarea unui singur tip de recipiente de cultură, pentru toate variantele
experimentale (cu excepția cazurilor în care se dorește însăși studierea influenței mărimii vasului
de cultură asupra morfogenezei inoculilor, dar în această situație nu mai trebuie să existe o altă
variab ilă în experiment). Nu întotdeauna recipientele de dimensiuni mari vor determina
intensificarea creșterii vitroplantulelor, dimpotrivă. Totuși, în cazul speciilor care cresc sub
formă de tufă, precum Saintpaulia , Drossera , este necesară utilizarea unor rec ipiente cu un
diametru de cel puțin 5 cm. Esta important ca sticla din care sunt confecționate recipientele de
cultură să fie transparentă și termostabilă, pentru a rezista procedurilor de sterilizare. Prealabil
distribuirii mediului de cultură în recipien te, acestea se presterilizează, la etuvă, cu căldură
uscată, la 120 – 140 °C, timp de 4 h.
5. Inocularea materialului vegetal este operațiunea de amplasare a inoculului aseptic pe
un substrat de cultură sterilizat, cu ajutorul unui instrumentar lipsit de germen i, în condiții de
asepsie. Instrumentarul utilizat, materialul biologic de inoculat, incinta de inoculare (de regulă o
hotă cu flux laminar de aer steril, amplasată într -o cameră specială asepsizată în prealabil),
precum și mâinile operatorului trebuie să fie sterilizate pentru a împiedica pătrunderea
germenilorpatogeni în interiorul recipientelor de vitrocultură. După dimensionare inocului și
inocularea acstuia pe mediu steril, se procedează la acoperirea recipientelor de cultură cu folie de
polietilenă și amplasarea lor în camera de creștere.
6. Incubarea vitroculturilor se realizează în camere de creștere climatizate, cu un regim
ecofiziologic cerut de natura inoculilor și tipul vitroculturilor. Primele zile de la inoculare
reprezintă perioada de incubare, t imp în care vitroculturile trebuie urmărite, în vederea înlăturării
imediate a posibilelor infecții care pot să apară. Aceste infecții pot fi de natură bacteriană (Gram
pozitive: Actinomyces, Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Staphylococcus, Microc occus
sau Gram negative: Pseudomonas, Erwinia, Xanthomonas, Achromobacter, Agrobacterium etc.)
sau de tip fungic, și anume: Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Alternaria, Trichoneme,
Candida, Botrytis, Fusarium, Mucor, Rhizopus etc. Recipientele infec tate se îndepărtează și se
sterilizează prin autoclavare, prealabil deschiderii lor, pentru a împiedica contaminarea
atmosferei din laborator.
7. Creșterea vitroculturilor începe o dată cu apariția primelor semne de apariție a
proceselor regenerative. În a ceastă perioadă iluminarea vitroculturilor este recomandată să fie
făcută cu lumină albă, emisă de tuburi fluorescente, cu o intensitate luminoasă de 500 – 5 000 lx,
în funcție de specie și de scopul urmărit.

28 8. Pregătirea și prelucrarea vitroculturii pentru viitoarea cultură (pentru subcultură sau
pentru aclimatizarea la mediul septic de viață, ori biometrizarea).
9. Conservarea vitroculturilor . În cazul în care se dorește păstrarea pe o durată cât mai
lungă a vitroculturii, cu scopul realizării unor subculturi cât mai rare, se vor practica diferite
metode de reducere a intensității proceselor vitale, fie prin hipoxie (diminuarea aportului de
oxigen) sau prin metoda hipobarică (coborârea presiunii atmosferice), sau prin deshidratări
menajate a celulelor (prin cr eșterea presiunii osmotice a substratului de cultură), fie prin
menținerea culturilor la temperaturi joase, de 4 – 7 °C, în condiții de iluminare scăzută, fie chiar
prin păstrare a acestora în azot lichid, la – 196 °C ( criostocare ).

PARTICULARITĂȚI ALE CULTURILOR IN VITRO

Condițiile specifice cu lturilor in vitro determină producerea unor anormalități
morfologice și disfuncționalităț i în țesuturile vitroplantulelor (Tabelul 1) . Rata scăzută a
fotosintezei și eliminarea excesivă a apei sunt probleme comune întâlnite în momentul
transplantării vit roplantulelor în mediul natural de viață. Studii ultrastructurale au arătat că aceste
probleme sunt responsabile de pierderea excesivă a umidității țesuturilor plantulelor, care poate
conduce la ofilirea lor și la un procent de supraviețuire scăzută, posta climatizare. Dintre
handicapurile suferite de către vitroplantule vom descrie câteva mai importante:
Fotosinteza. Plantulele crescute in vitro au, frecvent, un aparat fotosintetic inadecvat
rolului pe care acesta trebuie să -l joace în condițiile vieții î n mediul natural (SMITH și colab.,
1986). În general, vitroplantulele se hrănesc heterotrof sau mixotrof , doar în prezența unei
concentrații ridicate de CO 2 în atmosfera din recipientele de cultură și înlăturarea inhibiției
feedback -ului ciclului Calvin de către surplusul de zahăr din substrat, prin înlăturarea glucidelor
din mediul de cultură, ele se pot hrăni fotoautotrof (GROUT, 1988). Prezența zahărului în mediul
nutritiv poate împiedica fotosinteza, deoarece acesta inhibă producția de
ribulozodifostatc arboxilaza, o enzimă cheie în fotosinteză, iar depozitele acestuia sub formă de
amidon blochează cloroplastele (Fig. 1) (CACHIȚĂ și CRĂCIUN, 1991). Alți factori, cum ar fi
nivelul scăzut al luminii și schimbul inadecvat de gaze, asociat cu alte condițiile de vitrocultură,
pot afecta, de asemenea, fotosinteza.

29
Tabelul 1. Aspecte ale condițiilor de vitrocultură și efectele lor asupra vitroplantulelor, comparativ cu cele din
mediul natural de viață și obiectivele aclimatizării la mediul septic de viață .
Condiții in vitro Anormalități suferite
de vitroplantule Condiții „in vivo” Obiectivele
aclimatizării
1. Mediu aseptic – Țesut palisadic redus,
mezofil foliar sărac,
constând dintr -un singur
strat de celule
– Număr mic de
cloroplaste, cu depuneri
de amidon și conținut
diminuat de clorofilă,
ceea ce conduce la o
rată scăzută a
fotosintezei
– Respirație ridicată la
întuneric
– Dificultate în
diferențierea țesuturilor
– Sistem radicular
deficitar, lipsit de
perișori absorbanți
– Hiperhidrie
– Slabă dezvol tare a
cuticulei epidermale
– Stomate modificate,
cu osteole în
permanență larg
deschise
– Transpirație scăzută
– Risc de apariție
fungilor și bacteriilor și
a mutațiilor 1. Mediu septic – Prevenirea
eventualelor infecții

– Împiedicarea
evapotranspirați ei
excesive, a
deshidratării și a
instalării deficitului
hidric

– Trecerea
exvitroplantulelor la
nutriție autotrofă

– Formarea unui
sistem radicular apt
de a absorbi apa și
sărurile minerale din
sol 2. Substrat artificial de
cultură 2. Substrat natur al
sau artificial
3. Mediu de cultură bogat
în ioni anorganici, vitamine
și zaharuri, cu nivel
osmotic mărit, uneori cu
adaos de regulatori de
creștere 3. Lipsa mediului de
cultură, în special a
sursei de carbon
4. Regim de nutriție
heterotrof, event ual
mixotrof 4. Regim de nutriție
fotoautotrof
5. Atmosferă constantă,
lipsită de curenți de aer, de
O2 și CO 2, dar bogată în
etilenă 5. Atmosferă cu
curenți de aer,
bogată în O 2 și CO 2,
lipsită de etilenă
6. Umiditate ridicată 6. Umiditate scăzut ă
7. Iluminare suplimentară 7. Iluminare naturală

Au fost efectuate diverse încercări de intensificarea a procesului de fotosinteză a
plantulelor aflate în vitrocultură, ca efect al stimulării biosintezei clorofilei, prin manipulări ale
compoziției m inerale a mediului de vitrocultură, în ceea ce privește azotul, fosforul și potasiul,
binecunoscut fiind faptul că azotul este un component structural al moleculei de clorofilă
(BIELESKI, 1982; SEBANEK, 1992).
Influențele nutriției minerale ale vitroplant ulelor asupra conținutului de clorofilă au fost
demonstrate și de SALISBURY și ROSS (1992). Autorii menționați au arătat o creștere a
cantității de clorofilă a, sub influența fertilizării cu azot, sulf și calciu, în timp ce cantitatea de
clorofilă b nu a î nregistrat modificări semnificative.

30

Fig. 1. Ultrastructura cloroplastelor din celulele mezofilului foliar al frunzulițelor plantulelor de garoafe: A – in vitro
(6000 X) și B – la 24 h după transferarea ex vitro (12 000 X) (ca – canalicule; s – stromă; g – grane; cl –
chloroplast; am – amidon; pc – perete cellular; sp – spațiu intercellular; M – mitocondrie; c – citoplasmă; V –
vacuolă) (CACHIȚĂ și CRĂCIUN, 1991).

Prezența pigmenților asimilatori în cloroplaste, localizați în lamelele granale, asig ură
desfășurarea în tilacoide a reacțiilor anabolice primare, cu sinteza de glucoză, compus care este
ulterior polimerizat în granule de amidon, formațiuni care se depun în stroma cloroplastelor din
cauza regimului heterotrof sau mixotrof al vitroplantulel or, blocând activitatea acestora,
amidonul neavând unde să migreze în plantulă (CACHIȚĂ, 2000). Amidonul, ca substanță de
rezervă, prin hidroliză eliberează treptat moleculele de glucoză, care în cadrul proceselor de
catabolism, prin energia rezultată, sus țin energetic procesele de morfogeneză, în special după
transferarea ex vitro a vitroplantulelor (de exemplu în procesul de rizogeneză), având un rol
major în adaptarea exvitroplantulelor la mediul septic de viață. În afară de pigmenții clorofilieni
(clorofila a și b), cloroplastele conțin pigmenți galbeni (caroten și xantofilă). În cazul
vitroplantulelor, cloroplastele și leucoplastele se transformă frecvent în amiloplaste (și invers),
dar și cromoplastele în cloroplaste (CACHIȚĂ, 2000).
DUMITRESCU și I ORDAN (1986) (după CACHIȚĂ și colab., 2004) au studiat, la
microscopul electronic, mezofilul foliar al vitroplantulelor de Populus, aflate în diferite stadii ale
micropropagării acestora, rezultatele fiind corelate cu cantitatea de pigmenți asimilatori.
Cloroplastele, în curs de diferențiere, nu prezintă un sistem tilacoidal organizat și distribuit în
stromă. După 30 de zile de la transferarea ex vitro a vitroplantulelor într -un mediu hidroponic, în
celule se produc modificări citofiziologice; pe plan mor fogen, apar noi frunzulițe, iar sistemul
radicular este deja dezvoltat. Cantitatea de clorofilă a și b și de carotenoizi crește gradual, pe

31 măsura amplificării complexității structurale a cloroplastelor. Autoarele au ajuns la concluzia că,
adaptarea exvitr oplantulelor la condițiile vieții ex vitro este un proces lent, continuu, care necesită
trecerea unei mari perioade de timp.
În ceea ce privește cantitatea de pigmenți asimilatori (PETRUȘ – VANCEA, 2008), la
crizanteme, la violete africane și la cymbidiu m, vitroplantulele au prezentat o cantitate de
pigmenți asimilatori semnificativ mai mică, comparativ cu plantele cultivate în condiții naturale
de viață. Aceste diferențe au fost diminuate după 30 de zile de exvitrocultură , moment în care,
cantitatea de p igmenți asimilatori ( a, b, carotenoizi) a prezentat diferențe nesemnificative din
punct de vedere statistic, cu excepția clorofilei a, din exvitrofrunzulițele de cymbidium, care a
prezentat – și la finele perioadei de aclimatizare – diferențe negative semn ificative statistic, față
de martor, acest fenomen putând să se constituie într -una dintre explicațiile dificultăților întâlnite
în aclimatizarea exvitroplantulelor acestei specii, la mediul septic de viață (Tabelul ).
Determinarea conținutului frunzuliț elor în pigmenți asimilatori, respectiv în clorofilele a (CHL a ),
b (CHL b ) și pigmenți carotenoizi ( Car), s-a realizat prin extragerea acestora în N,N –
dimetilformamidă (DMF) 99,9% Merck, după metoda MORAN și PORATH (1980), valorile
cantitative ale pigmenț ilor asimilatori au fost obținute prin utilizarea coeficientului de absorbție
propus de WELBURN (1994).
Cuticula acoperă întreaga suprafață aeriană a plantelor în condiții naturale de viață. Ea
este constituită din cutină, un lipid cu grad înalt de saturar e, un polimer insolubil cu rol de
protecție, elaborat de celulele epidermale, mai ales foliare, situat la interfața dintre plantă și
mediul exterior (HOLLOWAY, 1982). Biosinteza și depunerea cuticulei pe peretele extern al
celulelor frunzelor este activată ca răspuns la condițiile de mediu (GILLY și colab., 1997). Pe de
altă parte, autorul afirmă că, grosimea cuticulei sintetizate in vitro se mărește pe parcursul
perioadei de vitrocultură, odată cu creșterea frunzelor, la fel ca și la frunzele provenite d e la
plantulele cultivate în condiții naturale de viață, ceea ce demonstrează că, în condiții de umiditate
maximă, formarea cuticulei este evident programată genetic și nu este exclusiv dependentă de
condițiile de stres.
Ceara . Situația este diferită în c azul cerii epicuticulare care acoperă suprafață externă a
cuticulei. Ea poate lua diferite forme variind de la o structură amorfă, până la depozite cristaline
(BACKER, 1982). Unele studii au arătat că, structura cristalină și calitatea cerii epicuticulare de
pe suprafața frunzulițelor plantelor micropropagate in vitro diferă considerabil de aceea a
plantelor similare crescute în seră, sau de a acelora provenite din câmp (VIOUGEAS și colab.,
1995). Absența stratului de ceară epicuticulară conduce la o tran spirație excesivă cu consecințe
negative în procesul de aclimatizare ( MASEDA și colab., 2004) .

32

Fig. 2. Aspectul unei stomate și a cerii epicuticulare la frunzele de Lycium chilense: A – in vitro , B –ex vitro ,
evidențiate la microscopul electronic c u baleaj (1350 X) ( MASEDA și colab., 2004).

Stomatele sunt formațiuni celulare, de dimensiuni microscopice, prezente în epiderma
organelor aeriene ale plantelor, în special a frunzelor. Stomatele, împreună cu celulele anexă
formează aparatul stomatic. Prin buna funcționare a stomatelor plantelor, aflate în condiții
natural de viață , se asigură desfășurarea corespunzătoare a proceselor vitale din întreaga plantă,
nu numai prin asigurarea unui schimb gazos echilibrat , dar și a unui regim hidric normal , în
limitele capacității adaptative a speciei sau a soiului plantei în cauză. O bună funcționare a
stomatelor preîntâmpină pierderea excesivă de apă sub formă de vapori, prin evapotranspirație.
Insuficienta dezvoltare a aparatului stomatic – fapt prezent la nive lul frunzulițelor
vitroplantulelor – atrage după sine o pierdere excesivă de apă, prin evapotranspirație. Deci, la
vitroplantule, prealabil transferării lor ex vitro și pe parcursul aclimatizării, aparatul stomatic
trebuie să fie cât mai mult adus la sta rea de normalitate morfofiziologică a celulelor sale.
O stomată tipică este localizată la nivelul celulelor epidermale (Fig. 3 A) și este formată
din două celule stomatice (reniforme sau halter iforme), dispuse față în față, lăsând între ele o
deschidere nu mită osteolă. Atunci când celulele stomatelor sunt deschise la maximum, diametrul
osteolei măsoară între 1 -12 microni și o lungime de 13 -40 microni (CACHIȚĂ, 1987). La
vitroplantule, frecvent pot fi observate stomate în stadiul de formare (prestomate) (Fig . 3 B).
Spre deosebire de celelalte celule ale epidermei, celulele stomatice conțin cloroplaste.
Conținutul citoplasmatic al celulelor stomatice este mai bogat decât al celulelor epidermale
obișnuite și acestea au un nucleu mare (Fig. 8) , cloroplastele de regulă fiind dispuse în jurul
nucleului; la vitroplantule, adeseori, în cloroplaste, la microscopul electronic, se disting și mici
grăuncioare de amidon (CACHIȚĂ și PETURȘ , 2008) (Fig. 4).

33
A.
B.

Fig. 3 Aspecte ale stomatei surprinse în secțiunile transversale practicate prin limb ul foliar al frunzulițelor de sfeclă
de zahăr ( Beta vulgaris var. Saccharifera), aflat e la 30 de zile de la germinarea în condi ții naturale de via ță
(A) și ale celulelor prestomatice , observate în secțiunile transversale practi cate prin frunzulițele plantulelor
cultivate timp de 30 de zile in vitro (B) (Ap. G. – aparat Golgi; cel.pst. – celule prestomatice; cel.st. – celule
stomatice; c.sst. – cameră substomatică; cit – citoplasmă; cl – cloroplaste; cgl – conglomerate electron dense;
epi. sup. – epidermă superioară; L – lacună; p.c. – perete celular; ppl – proplastide; N – nucleu; V – vacuolă )
(A – ob. 100X; B – bară de 2 µm ) (CACHIȚĂ și PETRUȘ , 2008).

A.
B.

Fig. 4 Aspecte ale cloroplastelor frunzelor de sfeclă de zahăr ( Beta vulgaris var. Saccharifera), aflate în condiții
naturale de viață (A) și in vitro (B) (a – amidon; cl – cloroplast; gr – grană; m.e. –membrane externă ; str –
strom ă; t – tilacoid ă; V – vacuolă; bă rile măsoară 2 µm ( A ) și 5 µm (B ) (CACHIȚĂ și PETRUȘ, 2009) .

În condiții normale de viață, plantele dispun de un sistem de închidere -deschidere al
osteolelor stomatelor, favorizând schimbul de gaze dintre mezofilul palisadic și atmosferă, iar
rolurile lor sunt variate, printre acestea se înscrie acela de r eglare a intensității transpirației și de
mărire a eficienței funcției de apărare exercitată de către epidermă. În natură, în scopul evitării
producerii unei evapotranspirații excesive , nu numai mecanismul de închidere și de deschidere a
stomatelor contează , ci – în zilele toride – pentru a preveni o deshidratare exagerată și ofilirea
frunzelor, și densitatea acestora este de dorit să fie mai scăzută . SALISBURY (1927 ) și
SCHOCH (1978 ) au demonstrat că , în cadrul aceleași specii , frecvența stomatelor poate va ria
semnificativ chiar și la frunzele aceleași plante. De altfel, într -o oarecare măsură, și morfologia
frunzei po ate fi modificat ă de factori ambientali. Adeseori, frecvența stomatelor este influențat

34 de mărimea celulelor sale, astfel, celulele anexă mici sunt asociate cu o frecvență ridicată a
stomatelor. După SCHOCH și colaboratorii (1980 ), indexul stomatic (raportul dintre numărul de
stomate de pe o zonă a frunzei și numărul de celule epidermale, plus celule anexă, pe suprafața
limbului foliar) nu este întotdeauna constant, el putându -se modifica în fun cție de intensitatea
luminoasă . Părerile referitoare la factorii de mediu care sunt implicați în morfogeneza stomatei
sunt numeroase și contradictorii. Astfel, KUBINOVÁ (1991 ) a arătat că, o iradiere a pla ntelor cu
o intensitate luminoasă ridicată a condus la creșterea numărul de s tomate per frunză , în timp ce
DALE și colab oratorii ( 1972 ) și LICHTENTHALER (1985) au afirmat contrarul. De asemenea,
plantele crescute pe sol uscat și în umiditate scăzută au pre zentat la nivelul limburilor foliare o
densitate a stomatelor crescută, comparativ cu cele cultivate într -un sol umed și o umiditate
atmosferică ridicată (PENFOUND, 1931).
Stomatele și perii se formează și în condiții de vitrocultură, dar specificitatea ac estui tip
de regim ecologic – umiditate ridicată (de până la 85%), temperatură constantă, iluminare
moderată, regim nutritiv heterotrof, parțial mixotrof etc. – face ca stomatele să fie în deschise
permanență, iar sistemul de închidere și de deschidere al osteolelor să fie nefuncțional
(CACHIȚĂ și CRĂCIUN, 1991; CACHIȚĂ și colab., 2004). În regim de vitrocultură, rolul
stomatelor și cel al perilor este mult modificat, în raport cu cel desfășurat în condiții naturale
(Fig. 5) (TAJI și ARIEL, 1994; PETRUȘ – VANCEA și colab., 2007).
A.
B.

Fig. 5 Stomatele epidermei inferioare a limburilor foliare ale frunzelor plantulelor de violetele africane ( Saintpaulia
ionantha L.), crescute în seră (A) sau regenerate in vitro (B) (c.epi. – celulele epidermei; c.epi.inf . – celulele
epidermei inferioare; st. – stomată; ost. – osteolă; c.a. – celule anexe) (PETRUȘ – VANCEA și colab., 2007).

BRAINERD și FUCHIGAM I (1982) și WETZSTEIN și SOMMER (1982 ) au fost de
părere că, stomatele din epiderma frunzulițelor generate în re gim ex vitro au prezentat caractere
morfostructurale și funcționale mixte, fie asemănătoare cu cele existente în epiderma
vitrofrunzulițelor, fie având o dezvoltare normală, ca acelea a stomatelor frunzelor plantelor din
seră, în timp ce in vitro celul ele epidermale prezintă doar prestomate, cu stomate nediferențiate.

35 În perioada de aclimatizare a exvitroplantulelor, KAVANAGH (1985) a observat că
densitatea stomatelor a scăzut la nivelul loturilor aclimatizate în incinte de dimensiuni mici.
În situația amplasării plantulelor de Prunus cerasis (MARTIN și colab., 1988) și de
Malus pumila (BLANKE și BELCHER, 1989) în condiții de umiditate atmosferică scăzută
stomatele vitrofrunzulițelor nu se pot închide rapid. MAR TIN și colaboratorii (1988) au s ubliniat
faptul că, după aproximativ 15 minute de la scăderea umidității atmosferice din vitrocultură la
45%, aproximativ 75% dintre stomatele frunzulițelor vitroplantulelor de prun au devenit apte de
închidere și de deschidere.
În schimb, SUTTER (1988) a observat la Cerasus și la Liquidambar, că după o oră de la
transferarea exvitroplantulelor într -un mediu septic de viață, stomatele se închid. Funcționalitatea
sistemului de închidere a stomatelor diferă și în funcție de specie. Pe de altă parte, autorul a
observat că, d eși există o diferență mare între talia frunzelor plantelor normale și a celor obținute
in vitro (care se aseamănă cu cele ținute la umbră), mărimea celulelor și forma acestora, nu
diferă.
În general, stomatele vitro frunzulițelor sunt mai lungi și m ai largi decât cele biometrizate
la plantele din mediul natural de viață (CAPELLADES și colab., 1990; SCHMIDT și
WALDENMAIER, 1993), dar celulele stomatei vitrofrunzulițelor de magnolie sunt de trei ori
mai mici, decât cele ale frunzelor plantelor din medi ul septic, însă ele prezintă celule anexă mai
mari (KAMENICKA și LANAKOVA, 1996). Auto arele amintite anterior au menționat faptul că,
umiditatea relativă și intensitatea luminoasă influențează morfologia aparatului stomatal, în ceea
ce privește structura ș i densitatea stomatelor pe frunză, dar este încă neelucidat modul în care
acești factori de mediu acționează.
CAPELLADES și colaboratorii (1990) au reușit, la trandafir, în vitrocultură, să
impulsioneze formarea unui aparat stomatic funcțional, prin mărir ea intensității luminoase de la
35µmol m-2.s-1 la 80 µmol m-2.s-1 FFF (flux de fotoni fotosintetici) și prin reducerea gradului de
hidratare a atmosferei din interiorul recipientelor de cultură, de la o umiditate de 100% la 75%.
În ceea ce privește măsur ile de protejare a plantelor generate in vitro , în momentul
transferării lor ex vitro , în perioada de aclimatizare, se motivează aplicarea unor tratamente
constând în acoperirea plant ulelor cu clopote de sticlă, asigurând umiditatea crescută în imediat a
apropiere a acestora , întrucât stomatele au osteolele larg deschise, după cum de altfel este stipulat
în literatura de specialitate (CACHIȚĂ, 1987; CACHIȚĂ și CRĂCIUN, 1991).
În general, stomatele vitroplantulelor sunt mai lungi și mai largi decât la pla ntele din
mediul natural de viață, iar acestea sunt în permanență deschise (Fig. 6).

36

Fig. 6. Aspecte ale stomatelor frunzelor de garoafe: a – ex vitro , b – in vitro , evidențiate la microscopul electronic
cu baleaj (TAJI și ARIEL, 1994).

Sistemul r adicular . Cercetările au arătat o ramificare slabă a sistemul radicular neoformat
in vitro la nivelul vitroplantulelor, precum și o slabă dezvoltare a perișorilor absorbanți din cauza
absenței unei conexiuni vasculare bune între rădăcină și tulpină (YIE și LIAW, 1977). Mai mult
decât atât, autorii au menționat că sistemul radicular al vitroplantulelor regenerate din minibutași,
diferă de cel al vitroplantulelor regenerate din embrioni somatici sau gametofiți, în sensul că
minibutașii generează rădăcinițe adventive, laterale, fragile, în timp ce embrionii somatici au un
meristem care regenerează un sistem radicular ontogenic normal.
În tabelul 1 au fost prezentate, în mod sintetic, principalele aspecte care privesc
particularitățile și cerințele vitroplant ulelor și pe cele ale exvitroplantulelor.
În cazul transferării vitroplantulelor în mediul septic de viață, pentru a mări procentul de
supraviețuire al acestora la mediul natural, în regim protejat sau în teren, pentru început trebuie
asigurate condiții sp eciale de mediu ex vitro , inițial cât mai asemănătoare celor cu care
vitroplantulele au fost familiarizate în fazele de vitrocultură (KOZAI, 1991). Efortul principal
trebuie să se concentreze asupra controlării anumitor condiții de menținere în imediata apropiere
a exvitroplantulelor a unei umidități ridicate în atmosferă, scop atins, în general, prin acoperirea
culturilor cu clopote, ori cu folie transparentă și incoloră, sau prin păstrarea lor în solarii sau în
sere cu ceață. Pe lângă această măsură, es te necesară umbrirea , respectiv o temporară ecranare a
exvitroplantulelor împotriva incidenței radiațiilor solare pe corpul lor, insolație care poate dăuna
celulelor plantulelor abia scoase din „vitro”; pe de altă parte, intensitatea luminii solare poate
fluctua, ceea ce conduce la producerea de modificări ale parametrilor de temperatură și de
umiditate relative , cu urmări asupra intensificării evapotranspirației la nivelul părții aeriene a

37 exvitroplantulelor aflate în curs de aclimatizare și decompensarea hidrică a exvitroculturilor.
Păstrarea de lungă durată a exvitroplantulelor în ceață și la umbră împiedică, însă, instalarea
proceselor de fotosinteză. Cercul vicios care ia naștere în cazul controlării condițiilor de mediu în
perioada de aclimatizare este prezentat sintetic în tabelul 2 (KOZAI, 1991).
Tabelul 2. Cercul vicios al reglării condițiilor de mediu ex vitro în perioada de aclimatizare (KOZAI ,
1991 ).
___________________________________________________________________________________
1. În primul st agiu de aclimatizare, exvitroplantulele sunt sensibile la stresul hidric și nu au dezvoltat un
sistem autotrof de nutriție
2. Umiditatea relativă a atmosferei din recipientele de aclimatizare trebuie menținută ridicată, pentru a
reduce mortalitatea exvitropl antulelor
3. Ceața artificială realizează atât o hidratare a atmosferei din jurul exvitroplantulelor, cât și o umbrire a
acestora, măsură necesară pe parcursul zilei pentru a păstra umiditatea ridicată sub incidența luminii
solare naturale
4. Fotosinteza este, însă, inhibată în condiții de umbrire prea puternică
5. Inhibarea fotosintezei (fotoautotrofismului) poate descrește organogeneza, respectiv rizogeneza și
caulogeneza
6. Absorbția apei și a sărurilor minerale este diminuată de insuficienta dezvoltare a aparatulu i radicular
secundar
7. Absorbția diminuată de apă, pe fondul unei transpirații excesive la nivelul frunzelor, poate conduce, în
final, la moartea exvitroplantulelor
8. În momentul transferării ex vitro a vitroplantulelor, o parte dintre frunzulițe pot fi înde părtate, pentru a
reduce astfel excesul de transpirație. Pe de altă parte, fotosinteza este inhibată de o suprafața foliară
mică.
___________________________________________________________________________________

5. Aclimatizarea vitroplantulelor la med iul septic de viață

În domeniul vitroculturilor vegetale, termenul de aclimatizare are o semnificație aparte, și
anume: adaptarea plantulelor generate in vitro (vitroplantulelor) la condițiile mediului septic de
viață (CONOVER și POOLE, 1984; CACHIȚĂ, 1 987) sau „procesul de creștere a plantelor
cultivate in vitro , în condițiile mediului extern de viață” (ZAID, 1999) .
Noțiunea de aclimatizare a fost și este preferată, de către vitrocultorii vegetali,
termenului de adaptare sau de acomodare , având un se ns mai larg, care, fără îndoială, reprezintă
mai bine stresurile suportate de exvitroplantule, respectiv șocurile: hidric, patologic sau
fiziologic suportat de plantulele generate in vitro , în momentul transferării lor în atmosfera
septică și plantarea în sol, situație în care nu este vorba de o plantare a unor specii în noi terenuri,
geografic diferite, în scopul îmbogățirii unui anumit areal cu specii originale din alte locuri. În
vitroculturile vegetale, această procedură se aplică, numai atunci când este necesară – la finele
perioadei de micropropagare – trecerea vitroplantulelor, generate în regim aseptic, în condițiile
mediului natural de viață. Așadar, în funcție de scopul urmărit, vitroplantulele – înrădăcinate sau
nu – pot fi trecute în mediul se ptic, cu luarea unor măsuri speciale de protecție a acestora față de
stresul la care ele sunt supuse într -o asemenea situație.

38 Aclimatizarea este faza în care exvitroplantulele trebuie să se adapteze la condițiile de
viață ex vitro , ceea ce presupune ad aptarea acestora la: o scăzută umiditate aeriană și în substrat ,
o intensitate luminoasă diferită de aceea pe care au avut -o plantulele in vitro , fluctuații de
temperatură , curenți de aer și puternice atacuri ale cu diferiți agenți fitopatogeni , situații care, în
ansamblul lor, presupun parcurgerea de către ele a unor permanente stresuri și necesitatea
producerii unor transformări adaptative în corpul acestora. Se recurge la această etape în
momentul în care există cerere pe piața de desfacere pentru come rcializarea de material de
plantat, în unitățile de profil. Astfel că, din stocul existent se trece la aclimatizarea
vitroplantulelor care dețin deja o talie de câțiva cm, mai multe etaje foliare și câteva rădăcinițe
adventive. Aclimatizarea presupune tran sferarea ex vitro a vitroplantulelor, spălarea sistemului
lor radicular de mediul agarizat (mediu care pe lângă compușii anorganici are un conținut ridicat
și compuși organici, respectiv în glucide, agar și vitamine, ceea ce facilitează dezvoltarea în ju rul
plantulelor a unei flore microbiene de fermentație sau de putrefacție, fapt care conduce la
necrozarea plantulelor). După lavarea plantulelor, ele urmează să fie plantate într -un substrat
constând din variate tipuri de amestecuri (sterile sau nesterile , în funcție de recomandări) și – pe
perioada de aclimatizare – fortele vitroplantule trebuie ocrotite, ferite de curenți de aer și de
deshidratare, prin acoperirea lor cu clopote sau coviltire transparente, incolore, timp de câteva
săptămâni. Periodic, cu lturile trebuie udate, la baza plantulelor, cu apă stătută și ocazional (în
funcție de natura substratului) pot fi administrate și tratamente cu soluții nutritive, anorganice.
Aclimatizarea vitroplantulelor transferate ex vitro se face în sere special am enajate sau în incinte
special construite ori confecționate, pentru ca să permită o aerisire parțială a culturilor, până la
copertarea lor totală. Plantele aclimatizate pot fi comercializate ca atare, sau din ele se realizează
o plantație mamă, din care se recoltează butași, ce vor fi înrădăcinați prin practicile tradiționale
de înmulțire vegetativă, dar efectuate în sere speciale, protejând culturile cu perdele speciale prin
care nu pot să treacă insectele.

6. Tipuri de vitroculturi la cormofite

Vitrocu lturile (culturile in vitro ) semnifică – în sens larg – culturi efectuate în regim
aseptic , fie în recipiente din sticlă fie, mai nou, în flacoane (de forme și dimensiuni variate), din
material plastic.
Întrucât vitroculturile se constitu ie în practici care sunt uzuale și în alte tipuri de
laboratoare și biotehnologii, nu numai în culturile in vitro de țesuturi și celule vegetale
(cormofitoinoculi ), respectiv în culturile de microorganisme (virusuri, bacterii, alge, drojdii,
mucegaiuri), dar și de unele insecte, larve, crustacee, moluște etc., pentru departajarea

39 vitroculturilor având ca inoculi, explante de plante superioare acestea sunt numite biotehnologii
vegetale sau cormofitotehnologii .
Tipurile de vitroculturi care privesc cormofi totehnologiile se referă fie la culturi efectuate
pe medii lichide, fie pe medii solide, dar și cu referire la vitroculturi explante de natură variată
(atunci când este vorba de cultura primară ) sau de inoculi – minibutași, propaguli, celule ori
protoplașt i în cazul subculturilor . În acest context, culturile pot fi:
 culturi de embrioni zigotici (imaturi sau maturi)
 culturi de organe :
 rădăcini
 lăstari
 muguri sau boboci
 frunze
 flori și inflorescențe
 antere
 ovare, ovule, saci embrionari.
 culturi de țesuturi :
 calus
 meristeme (caulinare, radiculare)
 culturi de explante tisulare variate, de exemplu:
 parenchimuri:
 de rezervă (la morcov)
 asimilator
 medular (la tutun)
 țesut liberian secundar.
 culturi de celule :
 libere sau imobilizate.
 culturi de protoplaști (celule d enudate, pe cale enzimatică).

Vitroculturile se practică în variate scopuri teoretice , în cercetări de morfogeneză, de
diferențiere celulară, de creștere, în studii de biogeneză sau de biodegradare ș.a.m.d., sau în
scopuri productive , cum este cazul micro propagării clonale, a obținerii de plante "libere de
viroze", în producerea de compuși secundari de metabolism, în industrie prin culturi de celule
(libere sau imobilizate) sau de calus, pentru prepararea de produși secundari de metabolism, de
coloranți, e nzime etc.
Culturile de embrioni zigotici se practică fie în ameliorare, în scopul salvării unor
embrioni rezultați din încrucișări realizate între parteneri incompatibili din punct de vedere
genetic, la care pe măsura trecerii timpului – din momentul realizării fecundării (care poate fi
practicată și in vitro ),– embrionii se necrozează; în astfel de cazuri, dacă embrioni respectivi sunt
prelevați (la un număr de săptămâni după fecundare) și sunt inoculați in vitro , pe medii de
cultură speciale, se realizează o cultură de embrioni zigotici imaturi și din aceștia sunt, apoi,
regenerate noi genotipuri cu calități pe care nu le au cei doi parteneri parentali. Prin astfel de
tehnici, s -au realizat o serie de hibrizi, astfel imposibil de obținut.

40 Culturil e de embrioni zigotici pot fi practicate și cu embrionii maturi , situație în care
semințele – prealabil extirpării embrionilor din semințe – sunt puse la imbibat, timp de 24h, în
apă, după care, în condiții aseptice, se procedează la scalparea embrionilor și la cultivarea lor in
vitro , utilizându -i, de regulă, în experimente variate, ca modele experimentale.
Culturile de meristeme. În general, în mod curent, în biotehnologia vegetală, prin culturi
de meristeme se subînțeleg culturile de apex caulinar, sau cele de dom meristematic, însoțit de o
pereche de primordii foliare, întrucât în industriile horticole de micropropagare, în scopul
inițierii vitroculturilor "libere de viroze", de la nivelul plantelor mame donatoare de explante se
prelevează, în regim as eptic, la stereomicroscop, explante de cca. 0,250 mm. Explantele
meristematice cu dimensiuni de sub 0,5 mm (funcție de specie și de soi) prezintă avantajul că
ele, de cele mai multe ori, acest tip de explante (respectiv inoculi) prezintă avantajul că sunt
"libere de virusuri", cu toate că ele sunt prelevate de la plante mame polivirusate; însă, cu cât
talia explantului meristematic este mai mică, cu atât capacitatea lui regenerativă este mai scăzută.
Acest fenomen a fost descoperit de către Morel și Martin, în anul 1952 și pe baza acestei
descoperiri s -a dezvoltat o întreagă industrie de micropropagare, după inițierea de vitroculturi
"libere de viroze". Pentru a spori randamentul în unitățile axate pe obținerea de culturi "libere de
viroze", în astfel de uni tăți se procedează la aplicarea, la nivelul plantelor mame, de tratamente
termoterapeutice (de regulă, tratamente cu temperaturi de 38 -40șC) administrate timp de mai
multe săptămâni (4 -5 săptămâni, în funcție de specie și soi), perioadă în care virusurile nu se mai
replică, creșterile apicale înregistrate în această perioadă beneficiind de lipsa invaziei celulelor
lor de către virusuri – virusurile, la temperaturi de cca. 40șC nereplicându -se – ceea ce permite o
mai mare siguranță în regenerarea – din expla ntele meristematice ce depășesc talia de 0,25 mm –
de vitroplantule. "libere de viroze", chiar și în cazul prelevării și cultivării in vitro a unor
explante cu talii de cca. 1 mm, respectiv constând din apexuri. În unitățile profilate pe culturi de
meris teme, apicale sau axilare, eficiența inoculărilor și creșterea inoculilor în vitrocultură se
mărește cu cât explantele sunt mai mari, mai ales că prelevările se fac la microscop. Deci, prin
termoterapie se mărește nu numai eficientizarea muncii (număr de i noculări realizate per oră
muncă), și crește procentul de inoculi supraviețuitori, dar și procentul de vitroplantule "libere de
viroze". După obținerea de vitroculturi, acestea trec printr -un proces de testare serologică a
identificării prezenței infecțiil or virale (și tipul acestora), în vitroculturile realizate, iar culturile
infectate sunt incinerate, în unitate, pentru micropropagarea păstrându -se numai vitroplantulele
absolut libere de germeni fitopatogeni. În continuare, micropopagarea se realizează p rin
minibutășiri variate, ori prin separare de tufe (în propaguli) sau prin protocormi, la orhidee.
În momentul în care există cerere pe piața de desfacere pentru comercializarea de
material de plantat, în unitățile de profil, din stocul existent se trece la aclimatizarea

41 vitroplantulelor care dețin deja o talie de câțiva cm, mai multe etaje foliare și câteva rădăcinițe
adventive. Aclimatizarea presupune transferarea ex vitro a vitroplantulelor, spălarea sistemului
lor radicular de mediul agarizat (mediu care pe lângă compușii anorganici are un conținut ridicat
și compuși organici, respectiv în glucide, agar și vitamine, ceea ce facilitează dezvoltarea în jurul
plantulelor a unei flore microbiene de fermentație sau de putrefacție, fapt care conduce la
necrozarea plantulelor). După lavarea plantulelor, ele urmează să fie plantate într -un substrat
constând din variate tipuri de amestecuri (sterile sau nesterile, în funcție de recomandări) și – pe
perioada de aclimatizare – fortele vitroplantule trebuie ocroti te, ferite de curenți de aer și de
deshidratare, prin acoperirea lor cu clopote sau coviltire transparente, incolore, timp de câteva
săptămâni. Periodic, culturile trebuie udate, la baza plantulelor, cu apă stătută și ocazional (în
funcție de natura substr atului) pot fi administrate și tratamente cu soluții nutritive, anorganice.
Aclimatizarea vitroplantulelor transferate ex vitro se face în sere special amenajate sau în incinte
special construite ori confecționate, pentru ca să permită o aerisire parțial ă a culturilor, până la
copertarea lor totală. Plantele aclimatizate pot fi comercializate ca atare, sau din ele se realizează
o plantație mamă, din care se recoltează butași, ce vor fi înrădăcinați prin practicile tradiționale
de înmulțire vegetativă, dar efectuate în sere speciale, protejând culturile cu perdele speciale prin
care nu pot să treacă insectele.
În cazul în care materialul de plantat este produs prin tehnici de butășire, este obligatorie
retestarea plantelor mame, donatoare de butași, proveni te din material de plantat produs in vit ro
pentru verificarea dacă acestea sunt sau nu libere de viroze. Nu pot fi comercializate răsadurile
care nu au certificat de sănătate și atestat de soi.
Procedurile de micropropagare constau din practici de mini – sau microbutășire, care se
operează numai în vitrocultură. Există și metode mai puțin utilizate, de înrădăcinare ex vitro a
unor minibutași proveniți din vitroculturi, prin folosirea unor pudre rizogene. Aceste metode sunt
mai puțin utilizate din cauza s ensibilității mari a minibutașilor derivați din vitroplantule, la
regimul de viață din mediul aseptic. Astfel de proceduri se aplică, cu precădere, la tehnicile de
micropropagare în regim nutrițional fotoautotrof , când în mediile de cultură nu se introduc
compuși organici (nici zaharoză), culturi care sunt mai rezistente și nu se nutresc heterotrof dar
la care se impune ridicarea la 10% a concentrației de CO 2 în atmosferă din vase și mărirea
intensității luminoase de la cca. 1 -2000 lucși, la 10.000 de lucși , sau chiar la mai mult. Astfel de
culturi se fac în incinte speciale, în sistem închis.
Culturile de meristeme reprezintă una dintre cele mai extinse tehnici in vitro . Obținerea
mericlonelor omogene genetic se datorează faptului că eventualele aberații c are ar apărea chiar și
în celulele vârfului de creștere sunt eliminate prin selecție diplontică, care asigură supraviețuirea
preferențială a celulelor cu o constituție genetică diploidă, normală. Mericlonarea asigură

42 menținerea și multiplicarea unor linii parentale caracterizate prin incompatibilitate sporofitică,
astfel, se reușește menținerea nealterată a acestor genotipuri.
Plantulele haploide regenerate in vitro sunt sterile și ca urmare se pot multiplica prin
culturi de meristeme pentru a obține mat erial suficient pentru analizele genetice, cât și pentru
operațiile de diploidizare.
Culturile de meristeme reprezintă tehnici de rutină pentru multiplicarea la scară
industrială a multor specii horticole.
Culturile de muguri se practică fie în cazul unor specii lemnoase, când explantele
mugurale sunt inoculate pe medii de cultură cu adaos de giberelină (AG 3 = acid giberelic),
compus care exercită efecte specifice ce constau în alungirea internodiilor axei mugurelui,
distingându -se eboșele foliare și facili tând, în acest mod, recoltarea de meristeme sau de
minibutași care, la rândul lor, sunt subcultivați pe medii proaspete, lipsită însă de AG 3 (cu sau
fără adaos de cărbune animal), operațiune care servește atât la evitarea barierei de fenoli oxidați,
ce împ iedică realizarea – în condiții optime – a schimburilor între inocul și substratul de cultură,
dar și o juvenilizare a inoculilor, încărcându -l hormonal cu compușii auxinici și citochininici,
introduși în mediile de cultură, în concentrații fiziologic acti ve.
Culturile de frunze , întregi sau fragmentate, se practică la speciile la care și în mod
tradițional răspund pozitiv la înmulțirea lor pe cale vegetativă, prin butași de frunze, (de exemplu
la Begonia, Saintpaulia, Bryophyllum etc.).
În general, după in ițierea unei vitroculturi, se poate practica micropropagarea, o
micropropagare a caesteia prin minibutași, constând din frunzulițe (pețiolate sau nu), ori numai
din pețioluri.
Zona cea mai organogenă a frunzelor este, cel mai adesea, fie porțiunea bazală a limbului,
fie pețiolul, dar – în general – care trebuie să cuprindă regiunea nervurii principale.
Regenerarea la nivelul unor astfel de minibutași este reprezentată de caulogeneză –
formare de mugurași adventivi – urmată, mai apoi, de rizogeneză; de cel e mai multe ori, astfel de
vitroculturi se constituie în tufe care – pentru micropropagare și subcultură – vor fi separate în
propaguli . Aceste formațiuni (fragmente din tufa comună, având cca. 3 frunzulițe pețiolate, cu
pețiolurile inserate pe o bază caul inară comună, din care – în zona bazală – pornesc sau nu
rădăcinițe adventive) vor fi subcultivate pe medii proaspete și astfel, propagulii vor genera noi
tufe; dacă propagulii vor fi trecute pe medii lipsite de regulatori de creștere, după înrădăcinare ei
vor putea fi transferați ex vitro și vor putea fi aclimatizați pentru a stimula rizogeneza. În unele
cazuri, propagulii mai robuști pot fi înrădăcinați direct ex vitro , fără subcultură. Astfel de practici
de micropropagare și de producere de material de plantat prin vitrocultură se utilizează în

43 unitățile de înmulțire in vitro a multor plante de ghiveci ( Saintpaulia , Gloxinia , Begonia ,
Nephrolepsis ), dar și la Gerbera și la Beta (sfeclă).
Culturile de antere se practică pentru regenerarea din celulel e rezultate post meioză, a
celulelor mame ale grăuncioarelor de polen, de plante haploide. Procedeul poartă numele de
androgeneză .
În reușita unor astfel de proceduri, o condiție de bază constă în faptul că anterele trebuie
să fie foarte tinere, întrucât r egenerarea de haploizi din polen matur este mult mai dificilă. În
consecință, anterele trebuie prelevate din boboci foarte tineri, atunci când încă nu s -au deschis
florile, în faza de preanteză, optimă pentru androgeneză la diferite specii și chiar soiuri de plante.
Pentru a stimula procesul regenerării de haploizi, (de fapt, pe calea embriogenezei, din celule
haploide) se impune, adeseori aplicarea unor tratamente (șocuri) cu temperaturi pozitive,
coborâte (păstrarea culturilor, timp de cca. 10 zile, la fr igider, la + 4 -7șC.
În scopul în care regenerează are loc din celule diploide somatice sau din celulele mame
ale grăunciorilor de polen, prealabil meiozei, ori din celule tapet, vitroplantulele rezultate nu
prezintă nici un interes.
Culturile de ovare, ovu le sau de saci embrionari .
Acest tip de culturi se practică fie în scopul fertilizării embrionari in vitro , pentru
obținerea de hibrizi care, în mod natural, nu pot fi obținuți, fie în scopul selectării de haploizi,
prin regenerarea de plantule din oosfe rele conținute de sacii embrionari, aceștia – la rândul lor –
aflându -se în interiorul ovulelor, iar ovulele în interiorul ovarelor. Obținerea de plante haploide
pe această cale poartă numele de ginogeneză .
Atât în cazul androgenezei cât și al ginogenezei, plantulele rezultate în vitrocultură sunt
analizate din punct de vedere genetic și prezintă valoare în ameliorare numai acelea care se
dovedesc a fi haploide, celelalte se elimină. Vitroplantulele dovedite a fi haploide se subcultivă
in vitro și se trat ează cu colchicină pentru a determina o diploidizare a celulelor lor, realizându –
se plante izo – sau homozigote. Aceste vitroplantule vor fi transferate ex vitro , vor fi aclimatizate
și, apoi, vor fi utilizate în ameliorare, în variate operațiuni de hibri dizare.
Culturile de celule se obțin, de regulă din calus (mai ales din calus friabil), prin agitarea
acestuia într -un mediu de cultură lichid. Ulterior, cu pipete rupte la vârf (boante) se recoltează
numai mediu lichid, câțiva ml ce sunt adăugați la un me diu lichid (de obicei de compoziție
obișnuită, dar lipsit de agent gelificant), cultura – în continuare – urmând să fie agitată. Pentru a
cunoaște densitatea celulelor aflate în cultură, este obligatorie – după o omogenizare a suspensiei
– estimarea densit ății celulare pe o lamă de tip hemocitometric.
Culturile celulare pot fi fie în suspensie și ele – în această stare – pot fi utilizate în
producerea de biomasă (dacă periodic se operează subculturi – la intervale de câteva săptămâni –

44 după metoda descrisă anterior), fie celulele aflate în cultură pot fi orientate spre embriogeneză
somatică și ulterior, pentru obținerea de semințe artificiale, ori embrionii somatici rezultați pot fi
utilizați, la rândul lor, ca biomasă (embrionii somatici fiind identici din punct de vedere
morfofiziologic, dar mai ales biochimic, cu cei zigotici; în consecință, embrionii care au un
conținut ridicat în anumite principii active pot fi utilizați în prepararea de produse
fitofarmaceutice.
Culturile de celule pot să fie imobilizat e pe suporturi inerte (de exemplu pe sferule
poroase din sticlă sau din porțelan, ori pe bureți sau pe spume uretanice); suporturile respective
se introduc în coloane așezate în poziție verticală sau orizontală, racordate la sisteme de pompare
– în regim a septic – a mediilor de cultură, aerate, soluțiile nutritive, ce conțin suspensii celulare,
perfuzând materialul pe care să adere (să se fixeze) celulele solitare, facilitează distribuirea
suspensiilor celulare în reactorul de cultură, pe măsură ce celulele se multiplică ele se fixează pe
substrat și asociațiile care se realizează conferă un cadru microecofiziologic mai propice
desfășurării unor procese de sinteză specifice pentru anumite tipuri de țesuturi, cu biogeneza de
compuși secundari asemănători din punct de vedere chimic cu cei produși de celulele aflate în
cultură, dar care sunt integrate morfofuncțional sistemului din care ar fi făcut parte, ca celule
solitare, adeseori, nu există posibilitatea de exprimare a acestor abilități. În alte situații cel ulele
imobilizate servesc ca agent biologic menite să efectueze o bioconversie a unor compuși aflați în
mediul de cultură – special introduși în acesta – astfel încât substanțele vizate să fie transformate
chimic sau fizic (formă dextrogiră în levogiră, sa u invers), mediul de perfuzie colectându -se,
urmând a fi valorificat ca materie primă, cristalizându -se și purificându -se compusul dorit.
Culturile de celule, în suspensie, servesc și ca mediu de selecție, atunci când se urmărește
acest țel, în mediul de c ultură se introduce factorul de selecție (fitotoxine fungice, anumiți ioni
grei sau chiar NaCl), iar celulele rezistente sunt apoi determinate să dea naștere la embrioni
somatici, iar aceștia prin semănare vor putea realiza o cultură cu rezistență la preze nța în mediul
natural de viață a factorului de presiune care a impus selecția. Procedura se poate repeta până
atinge pragul de rezistență dorit.
Culturile de protoplaști servesc, în primul rând, ca modele experimentale în cercetările de
inginerie celulară și de inginerie genetică, pe celulele denudate (în lipsa peretelui celular pecto –
celulozic, de altfel foarte rigid), realizându -se cu ușurință de la experimente de microchirurgie,
microinjectare, electroporare (permeabilizarea membranei protoplaștilor cu a jutorul curentului
electric), sonicare (permeabilizarea membranei protoplaștilor cu ajutorul ultrasunetelor), până la
transfer de gene prin intermediul unor vectori, naturali sau artificiali sau prin fuziune cu
liposomi, sau la realizarea de hibridări soma tice, generându -se noi fenotipuri.

45 Protoplastul reprezintă conținutul sferic, plasmolizat al unei celule vegetale, delimitat de
plasmalemă și eliberat experimental din spațiul restrictiv al peretelui celular.
Izolarea protoplaștilor se realizează prin met oda enzimatică de îndepărtare a peretelui
celular. Principalele preparate enzimatice comerciale utilizate în izolarea protoplaștilor conțin:
celulaze, hemicelulaze și pectinază, o mare parte având ca sursă biologică pe Aspergillus niger
sau Rhizopus. Țesut ul donor de explante este constituit, cel mai adesea, din țesut foliar (mezofil),
care eliberează o populație omogenă de protoplaști, dar și din calus, celule în suspensie, polen,
rădăcini, țesuturi de rezervă, meristeme, organe florale etc. viabilitatea p rotoplaștilor este
dependentă de presiunea osmotică între conținutul celulei și mediul ei exterior, fapt ce previne
„explozia” acesteia, în lipsa peretelui celular. Presiunea osmotică este reglată prin introducerea
în soluția enzimatică a unor glucide de t ipul manitolului, sorbitolului, glucozei și zaharozei, a
unor săruri minerale ca KCl și CaCl 2 și adesea a dextran sulfatului, pentru absorbția fenolilor.
pH-ul soluției este ajustat la 5,2 – 6.
Preincubarea in vitro a țesutului donor, înaintea introduce rii acestuia în soluția enzimatică
se realizează în mediu de cultură hipertonic suplimentat cu glucoză, xiloză, piruvat de sodiu, acid
citric, acid malic, acid fumaric și unii stimulatori ai creșterii.
După izolarea protoplaștilor este necesară purificare a acestora, pentru obținerea unor
suspensii pure, lipsite de resturi de celule distruse sau de pereți celulari nedigerați, realizată prin
centrifugări repetate și resuspendări succesive în soluția cu stabilizator osmotic, urmată de
separarea protoplaștilor viabili în gradient de densitate. După circa 7 – 10 minute de centrifugare,
la o viteză de 100 g, la interfața dintre cele două soluții se formează un inel de culoare verde, în
care sunt concentrați protoplaștii viabili, iar resturile se depun la fundul e prubetei. Viabilitatea
protoplaștilor se evidențiază la microscopul optic în contrast de fază sau prin metode
colorimetrice.
Rediferențierea este marcată prin începutul sintezei noului perete celular, modificarea
formei sferice și declanșarea primelor divi ziuni celulare. După formarea microcoloniilor se
stabilesc noi gradienți chimici, se restabilesc comunicațiile intercelulare prin intermediul
plasmodesmelor, și ca urmare celulele capătă caracteristicile morfologice și fiziologice specifice
celulelor de ca lus sau din culturi în suspensie.

46 7. Aplicații ale biotehnologiilor vegetale în ameliorarea plantelor. Variabilitatea
somaclonală in vitro . Selecția in vitro de linii celulare. Mutageneza experimentală in vitro .
Hibridarea somatică. Plante trans genice. Semințe sintetice.

Ameliorarea plantelor se realizează în scopul selecției unor soiuri și varietăți care
întrunesc exigențele impuse de rigorile eficienței, vizând atât creșterea producției cat și o mai
bună adaptare la condițiile de mediu.
Etapel e care trebuie parcurse în vederea obținerii unor soiuri sau varietăți noi, sunt
comune, indiferent de sistemul de ameliorare, și anume:
1. prospectarea, evidențierea, stimularea sau crearea variabilității genetice;
2. alegerea genitorilor și asocierea informaț iei lor genetice cu aceea a genotipurilor
cultivate, în scopul obținerii nivelului scontat al performanței biologice;
3. stabilirea metodei optime de multiplicare a idiotipului dorit, care să asigure, în
același timp, exprimarea noilor performanțe, prezentare a omogenă și fiabilitatea
utilizării sale.
Etapele de bază ale strategiilor de ameliorare sunt asemănătoare, pornind de la
evaluarea resurselor genetice disponibile și continuând cu transferul, recombinarea și exprimarea
informației genetice corespunzătoar e scopului urmărit, pana la structurarea și stabilizarea unei
varietăți comerciale.
Gama variabilități genetice existente în populația de bază este un element important în
reușita oricărui program de ameliorare, diversitatea resurselor genetice reprezintă un patrimoniu
strategic de importanță egală cu aceea a resurselor energetice, motiv pentru care există o
preocupare intensă a specialiștilor de a identifica noi căi de sporire a variabilității. Acest lucru
poate fi realizat pe două căi:
– inducerea exprimări i unor noi reglaje genetice la soiurile existente (cel mai adesea
prin mutageneză fizică sau chimică, care nu modifică structura alelică a unui
individ, remaniind doar un situs punctiform, lăsând, în rest, fondul genetic intact –
exemplu la orez);
– recombin area informației aparținând la două genotipuri și selecția produșilor
rezultați (exemplu hibridări intraspecifice sau interspecifice – exemplu triticalele
sunt obținute din grâu și secară).
Totuși, mecanismele procesului meiotic sunt factori limitativi ai recombinărilor de
informație genetică. De altfel, reproducerea sexuată se caracterizează prin asimetria transmiterii
informației citoplasmatice a gametofitului masculin și femel, reducând apreciabil polimorfismul
extranuclear. Una dintre problemele amelior atorilor este acea de dublă obligație: pe de o parte de

47 a crea varietăți omogene cu performanțe superioare, pe de altă parte, de a stabiliza structura
genetică sub forma unei varietăți apte de a fi comercializată.
Dacă metodele convenționale de ameliorare sunt bazate pe protocoale de lungă durată și
costisitoare, metodele biotehnologice permit disocierea organizării structurale a plantei,
depășirea limitei impuse de reproducerea sexuată și a granițelor de specie, izolarea, purificarea,
amplificarea și trans ferul informației genetice. Mai mult decât atât, tehnicile culturilor de celule
și țesuturi corelate cu procedeele de inginerie genetică permit sporirea considerabilă a resurselor
genetice, prin inducerea unor modificări de germoplasmă, care nu există în n atură, ele devenind,
astfel, o bogată sursă de diversitate genetică, utilizată nu numai pentru ameliorarea soiurilor
actuale, ci și pentru crearea de noi soiuri, cu însușiri superioare celor existente în prezent.
Variabilitatea somaclonală reprezintă o nou ă sursă de variabilitate genetică, apărută în
condiții de vitrocultură, ca urmare a unor modificări cariotipice grosiere sau discrete. Cu toate că,
inițial, micropropagarea in vitro a fost caracterizată ca instrument de obținere de clone, s -a
demonstrat fa ptul că, în anumite condiții, vitroculturile se pot constitui și în surse de variabilitate
genetică, reprezentând metode importante care pot completa și accelera programele ameliorării
tradiționale. Noul tip de variabilitate genetică, determinată de condiț iile de cultură in vitro ,
corespund calitativ celor obținute în urma utilizării radiațiilor ionizante sau a mutagenilor
chimici . Fenomenul de variabilitate somaclonală se accentuează o dată cu prelungirea perioadei
de cultură sau când sistemul de regenerar e implică o fază de calus. S-a reușit chiar selecția unor
varietăți cu însușiri utile prin exploatarea variabilității somaclonale indusă de condițiile de
vitrocultură, comparabile cu acelea obținute prin metodele ameliorării convenționale. Spre
exemplu:
Specia, cultivar Caractere noi
Brassica napus – rezistența la erbicide
Capsicum annuum (ardei) – cantitate redusă de semințe
Lycopersicum esculentum (roșia) – fructe cu cantitate ridicată
DNAP – 9 de substanță uscată
DNAP – 9 – rezistență la Fusarium
Medico sativa (lucerna) – flori albe
Sorgum bicolor – rezistență la dăunători
Zea mays – rezistență la erbicide
Nicotiana tabacum – rezistență la virusul PVY

Aceste modificări genomice (cromozomale sau genice) apar din cauza faptului că, prin
explantare, celulele tr ec de la mediul stabilizat din cadrul organismului intact, la noile condiții

48 din vasul de cultură, suferind un stres. Alături de compoziția mediului de cultură, o serie de alți
factori, cum ar fi genotipul, vârsta culturii, frecvența subcultivărilor, au rol important în
generarea diversității genetice în vitroculturi.
Dintre modificările genetice produse in vitro de factori metabolici sau de mediu , cele mai
frecvent întâlnite sunt:
– aneusomatita – exprimată prin prezența simu ltană în zonele meristematiceiar apoi
în țesuturile diferențiate, a unor celule cu complemente cromozomale aneuploide ,
alături de celule care posedă complementul euploid normal;
– modificări genetice rezultate în urma unui crossing – over somatic ;
– endoreplic area cromozomală (politenizarea), rezultând diplocromozomi
(cromozomi cu 4 cromatide) și quadruplocromozomi (cromozomi cu 8 cromatide ).
Bineînțeles că, eventualele modificări genetice prezente în explant sunt propagate în
cultură și pot fi încorporate în p lantele regenerate, împreună cu alte posibile variații genetice
produse în decursul vitroculturii.
Variabilitatea indusă in vitro
O caracteristică a micropropagării in vitro constă în instabilitatea populațiilor celulare
proliferative.
Variabilitatea din vitroculturi se poate exprima prin:
– modificări morfo -fiziologice în calusul cu creștere neorganizată și în culturile în
suspensie (exemple: habituarea, modificări ale activităților biosintetice, modificări
ale constituenților celulari), precum la nivelul vitroplantulelor regenerate;
– variabilitatea capacității morfogenetice .
Variabilitatea în culturile de celule și țesuturi vegetale se manifestă sub raport fiziolgic și
morfologic printr -o serie de procese, incluzând: habituarea (proces fiziologic prin care, în urma
expunerii repetate la un anumit stimul, reacția la acel stimul se diminuează, la nivel fiziologic –
obișnuire) , modificări ale activităților biosintetice , modificări ale tipului de creștere și ale
constituenților celulari.
Capacitatea celulelor d in culturi de a acumula pigmenți și metaboliți secundari ca
alcaloizi, steroizi, terpene etc., reprezintă aspecte ale diferențierii fiziologice care indică faptul că
celulele au devenit specializate. Totodată, în cadrul aceleiași culturi de calus se pot in dividualiza
linii celulare care pot varia ca aspect, textură, friabilitate, pigmentație, potențial de creștere și
morfogenetic, cerințe metabolice, rezistență la factori fizici și chimici, ploidie și totipotență.
Din culturile de celule vegetale stabilite pentru producerea de metaboliți secundari, pot fi
izolate și clonate celule unice. Deoarece populația celulară originală este inevitabil heterogenă,
există probabilitatea ca unele clone să se remarce prin capacități biosintetice care să le

49 depășească pe ce le ale celulelor inițiale. După izolarea unor astfel de clone celulare este dificilă
stabilirea însușirilor acestora, deoarece acestea se deteriorează în timp.
Din cauza menținerii în vitrocultură pe perioade îndelungate, prin subculturi repetate,
unele c ulturi celulare pot deveni la un moment dat auto nome în ceea ce privește auxinele sau
citochininele administrate exogen, fenomen denumit habituare sau anergie . Celulele habituate
dețin proprietăți asemănătoare celulelor tumorale, deoarece își pierd proprie tatea de a percepe
semnalele care coordonează activitatea normală. Celulele autonome, capabile de a se multiplica
fără factori de creștere sau a produce tumori prin grefaj, sunt, însă, susceptibile de a pierde aceste
proprietăți. Faptul că habituarea este un fenomen reversibil, demonstrează că pot avea loc,
spontan, modificări profunde ale fenotipului celular, care nu corespund unor modificări ale
integrității genomului. Așadar, habituarea reprezintă un fenomen epigenetic și nu unul mutagen.
Există o incid ență largă a variațiilor genetice, care se accentuează în funcție de durata
expunerii celulelor la condițiile de creștere in vitro . Deoarece, astfel de modificări genetice,
denumite generic variabilitate somaclonală se regăsesc și la plantele regenerate in vitro a fost
intuită și importanța lor în ameliorare fapt ce explică volumul însemnat de cercetări dedicate
elucidării bazelor genetice ale acestui fenomen.
Mutageneza indusă se aplică sistemelor de culturi in vitro cu diferite grade de
complexit ate, cum ar fi: culturi celulare în suspensii, culturi de protoplaști, culturi de calus,
microspori, embrioni zigotici sau somatici sau vitroplantule .
Culturile in vitro prezintă un mare avantaj, și anume posibilitatea tratării unui număr
mare de celule cu agenți mutageni, dar și a efectuării selecției în condiții controlate, rezultatele
fiind mult mai rapide și mai eficiente, comparativ cu cele obținute prin tehnici clasice.
Mutațiile presupun modificări ale materialului genetic, localizate atât la nivelul ADN
cromozomal, cât și al celui extranuclear, dispus în cloroplaste și mitocondrii, deci ele pot fi :
– genice
– cromozomale
– genomice
– plastidiale
– mitocondriale.
Utilizarea de agenți mutageni (fizici sau chimici), respectiv inducerea mutagenezei in
vitro are drept scop selecția de noi fenotipuri caracterizate prin rezistența sau toleranța crescută
la factori abiotici sau biotici de stress, cum ar fi: sărăturare, pH, ioni metalici, condiții
inundabile, secetă, temperaturi extreme, soluri sărace, boli și dăun ători.
Dacă ameliorarea convențională operează cu populații mari de plante , ceea ce presupune
multă mână de lucru, prin metodele de cultivare in vitro a țesuturilor și celulelor este posibilă

50 operarea cu populații celulare mult mai numeroase pentru induc erea mutațiilor și pentru selecția
formelor cu însușiri utile.
Dintre agenții fizici utilizați pentru inducerea mutagenezei in vitro (cu acțiune atât directă
asupra materialului genetic, dar și indirectă, asupra mediului de cultură, care influențează
creșterea și diferențierea in vitro ) amintim: radiațiile ionizante (razele gamma, raze X ), iar dintre
agenții chimici (mai eficienți deoarece produc acțiuni directe asupra moleculelor de ADN):
agenții alchilanți (etil -metan -sulfonatul – EMS sau metil -metan sulfonatul – MMS ), analogi ai
bazelor azotate (5-bromodeoxiuridina – BudR sau 5 – bromouracil – BU) sau compuși nitroși
(N-metil -N' – nitro – N – nitrosoguanidina – NTG sau N -etil-N-nitrosoureea – ENU).
Mutageneza chimică nu modifică structura alelică a in dividului, ea apărând ca o metodă
„blândă”, putând să remanieze un situs punctiform, fără să afecteze restul genomului.
Hibridarea somatică – aplicații în ameliorarea plantelor.
Din cauza fenomenului de incompatibilitate care poate să apară când partenerii nu sunt
apropiați taxonomic, metodele tradiționale de hibridare sexuată pot utiliza, ca forme parentale,
numai anumite grupe de organisme, în combinații restrictive, iar descendenții rezultați din
încrucișările sexuate posedă un genotip definit și limitat . În încrucișarea sexuată cei doi gameți,
feminin și masculin, contribuie în mod egal (simetric) la constituirea nucleului zigotului, dar prin
hibridare somatică se pot obține, alături de indivizi simetrici și hibrizi asimetrici, care conțin
întregul mater ial genetic al unuia dintre parteneri și doar o parte a genomului nuclear și
extranuclear al celuilalt partener . Determinanții genetici extranucleari sunt, însă, uniparentali, de
origine maternă, la majoritatea speciilor de plante . Hibridarea somatică repr ezintă o modalitate
de obținere a unei game largi de combinații genomice foarte importante în ameliorarea plantelor.
Fuziunile de protoplaști conduc la obținerea de celule hibride, chiar dacă aceștia provin
de la plante îndepărtate filogenetic (deci nu po t fi încrucișați pe cale sexuată). Avantajul
hibridării somatice prin fuziune de protoplaști, comparativ cu metodele convenționale de
hibridare sexuată, constă în realizarea combinării nu numai a eredității nucleare, ci și a celei
citoplasmatice, stocate î n cloroplaste și mitocondrii, care controlează rezistență la unii factori
abiotici de stres, la boli, la androsterilitate și eficiență fotosintetică.
Dacă celulele hibride sunt rezultatul unor celule aparținand aceleași specii (fuziuni
intraspecifice), ale se numesc homocarioni , iar dacă rezultă prin fuziunea unor celule aparținând
unor specii sau genuri diferite (interspecifice sau intergenice) se numesc heterocarioni .
Dacă pe parcursul unor procese de digerare a peretelui celular, ca urmare a dilatării
plasmodesmelor, are loc intermixarea completă a celulelor adiacente, rezultă homopolicariocite,
di sau trinucleate, dar, în general, fuziunea celulară la plante nu se poate realiza fără aplicarea
unor tratamente.

51 Fuziunile de protoplaști pot fi induse de fa ctori chimici , cum ar fi: polietilenglicolul
(PEG) (care are totuși un anumit grad de toxicitate pentru produșii de fuziune), alcoolul
polivinilic, dextran sulfatul, alginatul de calciu, gelatina sau lectinele.
Dintre factorii fizici care induc fuziuni: u tilizarea unor câmpuri electrice continue sau
alternative (electrofuziunea), de joasă frecvență pentru permeabilizarea reversibilă și
nondisteructibilă a membranelor celulare, prin mărirea potențialului de membrană.
Electrofuziunea se practică în scopul ob ținerii de hibrizi somatici vegetali sau de celule hibride
microbiene, în producerea de agregate gigantice multinucleate, precum și în obținerea de
hibridoame pentru producerea de anticorpi monoclonali.
Electrofuziunea oferă o serie de avantaje, comparativ cu fuziunea chimică, și anume: se
realizează rapid, în condiții apropiate de cele fiziologice, permite fuzionarea sincronă a unui
număr mare de celule, având randament de până la 95%, presupune un control permanent al
procesului, permite realizarea unor f uziuni heterocelulare binare și selectarea individuală a
produșilor de fuziune, nu afectează decât o zonă mică a membranei plasmatice și nu întreaga
plasmalemă, protoplaștii fuzionați își păstrează capacitatea regenerativă, iar produsul de fuziune
rezultat își formează rapid un nou perete celular.
Realizarea unor combinații dirijate de caractere extranucleare se bazează pe fracționarea
protoplastului în subprotoplaști (prin centrifigare diferențiată, la viteze ridicate și în gradient
osmotic, folosind în ac est scop Percolul, un silicagel coloidal), care reprezintă fragmente celulare
(citoplaști, carioplaști, plastoplaști, condrioplaști, vacuoplaști) ce conțin unele organite, care
urmează a fi transferate în interiorul unui protoplast receptor.
Un alt tip de hibridare, așa numită gametosomatică , presupune fuzionarea unui protoplast
de microspor (haploid) cu un protoplast somatic diploid, rezultând un hibrid gametosomatic
triploid.
În hibridarea somatică, spre deosebire de aceea convențională, heterocariocitul sau
heterocarionul rezultat este deosebit de complex, el putând combina atât genoforii nucleari, cât și
pe cei citoplasmatici ai ambilor parteneri, care, de regulă, sunt diploizi, ceea ce poate supune
produsul de fuziune la profunde restructurări genetice. Așadar, incompatibilitatea somatică apare
ca rezultat al coexistenței forțate, în interiorul unei entități celulare, de citoplasme și genomuri și
se poate manifesta pe mai multe planuri: asimetria hibrizilor, competiția dintre diferiți genitori
(ex. pot p redomina numai plastidele unuia dintre parteneri, fenomenul conducând la sterilitate).
Primii hibrizi somatici de interes au fost „pomatele”, obținute de la produși de fuziune ai
protoplaștilor de tomate și de cartof, care dezvoltă tuberculi de cartof în s ol și fructe de tomate
deasupra solului.
Plante transgenice (plante modificate genetic)

52 Tehnicile de transformare genetică asigură transferul în plantele cultivate al unor gene
provenite din diferite sisteme biologice (de la alte specii vegetale, neînrudi te, de la
microorganisme și chiar de la animale), obținându -se plante rezistente la erbicide, la insecte sau
virusuri.
Ingineria genetică are drept scop modificarea deliberată, prin metode biochimice, a
genomului plantelor, prin încorporarea de ADN de la procariote sau eucariote precum fungi,
alge, animale. Pe lângă ADN se pot introduce organite, celule bacteriene sau algale în
protoplaștii plantelor superioare, ca modalități de transfer intergenic al unor procese sau
caracteristici utile.
Transferul genic este condiționat de realizarea stabilă a patru procese fundamentale:
introducerea, integrarea, replicarea și experimentarea materialului genetic străin, în celula gazdă.
Tipuri de transformări genetice:
1. transformarea cu ajutorul vectorilor genici , cum su nt plasmidele bacteriene (ex. plasmida
Ti (tumor inducting), a bacteriei Agrobacterium tumefaciens sau plasmida Ri (root
induction), din Agrobacterium rhizogenes și unele virusuri);
2. transformarea prin intermediul vectorilor virali . Există peste 300 de viru suri la plante
care pot fi utilizați ca vectori, aceștia fiind caracterizați prin: spectrul speciilor gazdă,
virulență, posibilitatea transmiterii mecanice, proporția transmiterii prin semințe
(menținerea în genomul celulelor receptoare și după meioză), po tențialul de a cuprinde
informație genetică suplimentară.
– Singurul grup care întrunește cele mai multe dintre aceste condiții este cel al
caulimovirusurilor , cele mai importante fiind: Virusul CERV (carnation etched ring
virus) din Caryo phyllaceae , CaMV (cauliflower mosaic virus), din unele Cruciferae și
specii de Solanaceae , DaMV (Dahlia mosaic virus), din Amaranthaceae ,
Chenopodiaceae și Solanaceae.
– Un alt tip de virusuri cu ADN monocatenar sunt geminivirusurile (cu morfologie
geminată, adică în par ticule perechi), dintre care: CLV (cassava latent virus), MSV
(maize streak virus), WDV (wheat dwarf virus) și BGMN (bean golden mosaic virus).
– Virusurile ARN monocatenare , multipartite (au genomurile divizate în mai multe
molecule ARN), exemplu: BMV (br ome mosaic virus).
– Viroizii cei mai mici agenți patogeni. Se pot folosi în agroinfecție, prin care se combină
transferul genic via Agrobacterium și infecția virală.
– Bacteriofagii sunt virusuri care infectează bacteriile și pot fi utilizați ca vectori.
– Transpozomi i sau gene săritoare (secvențe de ADN excizate de la un situs al
cromozomului și inserate la alt sit) este posibilă asocierea unui astfel de transpozom cu o

53 genă de rezistență la virus și apoi supus clonării. Exemple: elemetele Ty (transposon
yeast), care constă din secvențe de ADN repetitiv dispersate la diferite situsuri în
genomul drojdiilor, fiind construiți vectori cu o capacitate superioară de transformare;
încapsularea de plasmide ADN în liposomi asigură o bună protecție a materialului
genetic străin pe parcursul transferului intracelular, atunci când celula receptoare este
protoplastizată.
3. transferarea directă de gene nu necesită construirea unor vectori speciali . Orice vector de
clonare de dimensiuni mici, care conține o origine a replicării de la E. coli și o genă marker
bacteriană, poate fi folosit pentru transferul direct de gene. Acesta se poate realiza prin
diferite metode:
– transformarea protoplaștilor .
– metoda biolistică (bombardarea celulelor și țesuturilor cu microproecti le, de regulă din
tungsten, pe suprafața cărora se află ADN destinat transformării). Prin această metodă au fost
obținute plantele transgenice de porumb și soia.
– electroporarea – electroinjectarea sau electroinfecția – supunerea celulelor la pulsuri de
înalt voltaj pentru a induce temporar pori la nivelul membranelor, prin care pot pătrunde
diferite macromolecule, inclusiv ADN.
– micromanipularea – injectarea directă de ADN străin în nucleii celulelor vegetale (în celule
izolate, în protoplaști, în grupu ri de celule meristematice, în embrioni somatici, în embrioni
zigotici imaturi, ovule nefertilizate).
– electroforeza – migrarea ADN printr -un țesut vegetal țintă.
– utilizarea fibrelor de carbură de siliciu – vortexarea (agitarea) țesuturilor împreună cu ADN
și fibre de carbură de siliciu, până ce fibrele penetrează pereții celulari permițând ADN să
pătrundă în citoplasmă.
– alte metode de transfer direct al ADN în celulele vegetale – există o serie de alte metode cu
aplicabilitate restrânsă de transformar e a celulei vegetale cum ar fi: îmbibarea ADN în
țesuturi utilizând semințe uscate sau embrioni, transformarea polenului sau a tubului polinic,
macroinjectarea ADN în țesuturi sau utilizarea microlaserului pentru a perfora peretele
celular și plasmalema .
Exemple de plante transgenice:
– tolerante la erbicide – la tutun, tomate, cartof, cereale etc.
– rezistența la insecte (în special la lepidoptere) – la Petunia, tutun.
– garoafe c u viață prelungită î n vază – modificarea metabolismului etilenei
– toleranță crescu tă la factori abiotici de stress, cum sunt: soluri sărace, extreme de
temperatură, secetă, condiții inundabile, ioni toxici, sărăturare etc.

54 – plante de porumb cu sterilitate masculină și cu toleranță la erbicidele glufosinate
sau rezistente la insecta „cor n borer” sau care posedă mecanisme pentru
detoxifierea de micotoxine produse de Fusarium moniliforme .
– sfeclă de zahăr tolerantă la glufosinate.
– tomate transgenice rezistente la Phytophthora infestans.
– castraveți rezistenți la mucegaiul cenușiu.
– bumbac rezi stent la insecte.
– vinete care produc fructe fără semințe.
– petunii portocalii (purtand gena dfr de la porumb).
– cafea decofenizată genetic.
– imunizarea orală prin introducerea de vaccinuri „comestibile” din plantele
transgenice. Crearea acestor vaccinuri impl ică transferul unor gene de la agentul
infecțios (virusuri, bacterii) la plante.
– modificări ale metaboliților primari
 Proteine
 Uleiuri
 Amidon
 Vitamina A (“golden rice”), vitamina E.
– Plante bioreactoare (vaccinuri, anticorpi, proteine din lapte uman, protei na din fibra
pânzei de paianjen).
– Fitoremediere – plante rezistente sau care acumulează agenți poluanți.

Progresul cercetărilor în acest domeniu este atât de alert încât o prezentare exaustivă este,
actualmente, aproape imposibil de realizat. Deși, realiz ările sunt extraordinare iar perspectivele
de aplicare pe scară largă ar rezolva multe probleme de producție și calitate a produselor agricole
pentru viitorul apropiat și îndepărtat, se înregistrează astăzi, din păcate, o criză în domeniul
aplicării bioteh nologiilor vegetale cauzată de percepția publică și actvitatea unor organizații
ecologiste. Problemele etice pe care le ridică aplicarea noilor biotehnologii trebuie analizate și
rezolvate cu multă chibzuință și deschidere fără a frâna progresul din acest promițător domeniu
al geneticii.
Cu toate impedimentele de ordin tehnic, cât și social sau etic, unele dintre acestea fiind
deosebit de acute, după aproximativ 30 de ani de la elaborarea tehnologiei ADNR există, în
lume, sute de hectare cultivate cu plant e transgenice. În U.E., deocamdată, doar porumbul
transgenic este acceptat pentru a se cultiva.

55 Semințele sintetice
Semințele sintetice sau clonale reprezintă o aplicație importantă a biotehnologiilor în
agricultură. Inițial, obținerea de semințe sintetic e a fost realizată din embrioni somatici
încapsulați (la lucernă, țelină, varză, morcov, bumbac, salată, orez, porumb), iar apoi ideea
semințelor sintetice a fost extinsă și la muguri, lăstari sau alte tipuri de propagule vegetale, care,
protejate artifici al, făceau posibilă conversia lor într -o plantă autonomă.
În acest scop sa folosește alginatul de sodiu care, în prezența unei soluțiii de azotat de
calciu, se gelifică în jurul embrionilor. În interiorul capsulei se asigură un supliment nutritiv, un
„endo sperm” sintetic și alte elemente care asigură desicarea alginatului, aceasta fiind acoperită
cu o peliculă hidrofobă dintr -un polimer (Elvax). În cazul încapsulării de minibutași, aceștia sunt
prealabil supuși unui tratament rizogenic.
Semințele sintetice se pot păstra la 4 °C, timp de mai multe luni și se pot semăna
mecanizat direct în câmp.

8. Avantajele și dezavantajele micropropagării in vitro

Avantaje :
– înmulțirea rapidă, accelerată a speciilor vegetale, în regim controlat, programat,
independent de sezon și de perioadele de latență
– uniformitate în cultură
– îmbunătățirea condițiilor de muncă, în paralel cu diminuarea costurilor de
producție (comparativ cu metodele tradiționale de înmulțire), prin reducerea
numărului de ani necesari înmulțirii, prin ec onomie de energie prin reducerea
spațiului necesar cultivării in vitro , prin reducerea numărului de persoane angajate
și automatizarea tehnologiei,
– obținerea de plante superioare calitativ, de elită
– juvelinizarea culturilor prin îmbunătățirea ramificăr ii tulpinilor, a vigurozității
frunzelor, în final a întregii plantule
– obținerea de portaltoi
– eradicarea germenilor fito și zoopatogeni și înființarea de culturi libere de agenți
patogeni (ciuperci, bacterii, micoplasme, virusuri sau viroizi)
– crearea de no i genotipuri
– obținerea de haploizi prin culturile de antere sau de polen

56 – selectarea și cultivarea de linii celulare cu rol important în sintetizarea (în
bioreactoare) unor produși secundari de metabolism, substanțe cu acțiune
farmaceutică, o serie de comp uși chimici
– conservarea fondului genetic, respectiv a germoplasmei, în bănci de gene

Dezavantaje :
– pericolul introducerii în cultură, într -un anumit sezon, a speciilor sau soiurilor
atunci la „modă” și saturarea pieței cu același produs
– sărăcirea genetică, apărând pericolul selectării naturale de dăunători
– apariția fenomenului de hiperhidrie (vitrificare sau sticlozitate) sau a necrozelor
– pierderi cauzate de lipsa de profesionalism sau conștiinciozitate a angajaților
– posibile accidente de muncă
– pierderi, un eori destul de ridicate, la aclimatizarea vitroplantulelor la mediul septic
de viață

9. Definirea unor termeni de biotehnologie vegetală

1) Acid abscisic – fitohormon cu rol inhibitor asupra unor procese de creștere, implicat fiind în
instalarea și menține rea latenței și a semenescenței.
2) Adventiv – organe neoformate în locuri neobișnuite, de exemplu: rădăcini adventive – se
formează la nivelul frunzelor, tulpinilor, inflorescențelor, sau al fragmentelor derivate din
acestea; muguri adventivi – neoformarea de mugurași la nivelul internodurilor frunzelor, florilor,
ori al explantelor derivate din acestea; neoformarea de organe la nivelul calusului; neoformarea
de meristeme adventive, prin dediferențierea celulelor definitivate structural și funcțional;
embrio geneza somatică, ș.a.m.d.
3) Agar – agar – polizaharid extras din alge, utilizat pentru solidificarea mediilor de cultură (medii
agarizate).
4) Agregat – elemente care sunt unite la un loc formează noduli sau ciorchini. În culturile de
țesuturi, o masă de celu le de formă diferită care se pot greu disocia unele de altele, chiar și prin
agitare.
5) Androgeneză – formarea de embrioni haploizi în cazul cultivării in vitro a unui grăuncior de
polen, sau, altfel spus, dezvoltarea de plante din gametofitul masculin.
6) Anergism – vezi habituație;
7) Aneuploid – celule, țesuturi și organisme care au mai puțin sau mai mulți cromozomi decât un
multiplu exact al numărului de cromozomi din celula haploidă;
8) Apex, apical – extremitatea unui organ; meristeme apicale=meristeme ter minale;

57 9) Apogamie – dezvoltarea unui embrion pornind de la celule ale sacului embrionar, altele decât
oosfera; celula poate fi haploidă (sinergide sau antipode), sau diploidă. Apogamia este un caz
particular de apomixie;
10) Apomixia (vezi parasexualitate) – este un caz de formare a embrionului fără fecundare, pornind
de la o altă celulă decât oosfera;
11) Aseptic – absența ciupercilor, bacteriilor, virusurilor, micoplasmelor sau a altor
microorganisme;
12) Autoclavă – aparat utilizat pentru sterilizarea, ce funcțio nează cu aburi aflați sub presiune.
13) Auxine – clasă de substanțe, regulatoare de creștere, care determină alungirea celulei vegetale,
dominanța apicală, inițierea rădăcinilor, etc.;
14) Axenie – eliberare totală de asociație cu alte organisme;
15) Axilar – situa t la axila frunzelor, de exemplu mugurii axilari;
16) Bancă de gene – colecție de viețuitoare, organe sau molecule;
17) Bioconversie – transformare de energie și de substanță prin mijlocirea sistemelor vii.
Fotosinteza constituie o bioconversie a energiei lumini i solare în energie chimică potențială.
Sinteza diferitelor substanțe organice prin mijlocirea sistemelor vii, pornindu -se de la precursori
existenți în mediul natural sau de cultură al organismelor.
18) Caliclone – plante generate din calus.
19) Calus – țesut c are, în mod natural, se formează la nivelul suprafețelor tăiate sau vătămate ale
unui organ sau organism vegetal. În tehnica culturii de celule și țesuturi vegetale, prin calus se
înțelege o aglomerare de celule care manifestă o creștere neorganizată (neco ntrolată prin
mecanismele de integrare ale organismului) și nelimitate. Calusul poate fi cultivat indefinit, prin
transplantări repetate. Calusul constituie materialul inițial pentru regenerarea în cultură a unui
organ sau chiar a întregului individ vegeta l.
20) Calusogeneză – formare de calus.
21) Cambiu – meristem – în sens strict – meristem secundar; zonă generatoare libero -lemnoasă.
22) Cameră de cultură – camera în care sunt menținute culturile in vitro , în condiții controlate de
lumină și de temperatură;
23) Cari ograma – reprezentarea grafică a cromozomilor unui cariotip. Cariograma se alcătuiește pe
baza a diferite tipuri de măsurători efectuate asupra cromozomilor (lungimea totală a
cromozomului, lungimea celor două brațe, raportul dintre ele, indicele si poziți a centromerului,
poziția strangulațiilor secundare, a organizatorului nucleolar, a regiunilor heterocromatice, etc.).
24) Cariotip – caracteristicile vizibile la microscop ale cromozomilor (număr, formă, mărime, și
alte aspecte morfologice) la celulele aflate în metafază.
25) Caulogeneză – este procesul de diferențiere și de dezvoltare a tulpinii;
26) Celule hibride – rezultate din fuzionarea a două sau mai multor celule formându -se un
sincarion.

58 27) Citochinine – o clasă de regulatori de creștere care sunt responsabil i de diviziunea celulelor
vegetale, diferențierea acestora, formarea de mugurași, înlătură dominanța apicală exercitată de
mugurele terminal, etc.
28) Cibrid – celule viabile rezultate prin fuziunea protoplaștilor, creând un hibrid citoplasmatic.
Ciclul celul ar – totalitatea proceselor morfologice, fiziologice și biochimice care se desfășoară
într-o celulă de la o diviziune la alta.
29) Clonă – un grup de indivizi descendent dintr -un unic individ prin mitoză, fără fecundare. În
culturile de celule și țesuturi, cl ona este o populație descendentă dintr -o singură celulă prin
mitoze succesive. Operațiunea se numește clonare.
30) Colonie – agregat de celule înconjurate de o membrană sau care alcătuiesc o masă comună.
31) Cormofitoinocul – fragment (explant) prelevat de la pl antele superioare (cormofite) introdus și
cultivat în vitrocultură;
32) Creștere – mărirea cantitativă și ireversibilă a numărului de elemente care alcătuiesc un sistem,
a dimensiunii și ponderii sistemului sau organismului viu, în ultimă analiză. Procesul de creștere
este o condiție a dezvoltării; în desfășurarea lui se împletesc, armonic, o mulțime de structurări
și schimbări calitative și cantitative.
33) Cultivar – soi sau varietate cultivată, prezentând caractere distincte care se mențin atât pe calea
reprod ucerii sexuate cât și asexuate.
34) Cultură – totalitatea metodelor folosite pentru înmulțirea și creșterea organismelor, indiferent
de proveniența și dimensiunile lor. În domeniile microbiologiei și în cel al cultivării de celule și
țesuturi, prin termenul d e cultură se definește oricare mod de creștere a microorganismelor,
celulelor, țesuturilor și organelor, pe un mediu preparat artificial. După proveniența materialului
se pot distinge mai multe tipuri de culturi aseptice: culturi de plantule și plante; cul turi de
embrioni izolați (maturi sau nematuri); culturi de organe; culturi
35) de țesuturi (vezi și calus); culturi de celule sau de suspensii celulare; culturi de protoplaști.
36) Cultură de organe – cultura in vitro de organe izolate, în regim care să permită dezvoltarea sau
conservarea lor:
37) Cultură primară (cultură de ordinul întâi) – cultură de celule, țesuturi și organe obținută prin
prelevarea directă a materialului viu dintr -un organism.
38) Dediferențiere – anularea procesului de diferențiere și revenirea c elulelor la starea embrionară,
meristematică. Celulele dediferențiate pot să se înmulțească și să prolifereze într -un țesut
nediferențiat, în care, ulterior, poate să se petreacă o rediferențiere. Dediferențierea apare rar „in
situ”, dar este un fenomen ob ișnuit in vitro .
39) Densitate celulară – numărul de celule / unitate de volum.
40) Dezvoltare – la plante, semnifică parcurgerea unui ciclu de la sămânță la sămânță, sau a unui
organ de la formarea sa și până la senescență, ori schimbarea fomei plantei prin c reștere și
diferențiere, altfel spus, totalitatea modificărilor cantitative și calitative pe care le suferă un

59 organism din momentul conceperii sale și până la maturitate deplină. Dezvoltarea implică
creștere și diferențiere.
41) Diferențiere – pierderea prog resivă a caracterelor morfologice și citofiziologice, specifice
celulelor embrionare și dobândirea caracteristicilor celulare adulte, potrivite unei anumite
specializări funcționale. Diferențierea se realizează la nivel molecular (diferențiere biochimică ș i
aptitudini de noi sinteze), la nivel ultrastructural, diferențierea de țesuturi (de protecție, țesut
conducător, parenchim de asimilare de rezervă, etc.), diferențierea organelor ș.a.m.d. Celulele
diferențiate și -au pierdut capacitatea de a se divide, un eori pot avea o structură anumită,
particulară, dar, în general, prezintă vacuole mari iar raportul nucleoplasmic este redus.
42) Dihaploid – organism cu 2n = 2x cromozomi, care se formează dintr -un tetraploid 2n = 4x.
43) Embriogeneză – dezvoltarea embrionului dintr -un ou. În cazul culturilor de celule și țesuturi, se
înțelege procesul prin care se regenerează, în cultura in vitro , un embrion, prin organizarea
celulelor și țesuturilor în formațiuni similare embrionului rezultat dintr -un zigot. Astfel de
formaț iuni sunt numite „embrioni adventivi” sau „embrioni somatici”.
44) Embrioid – embrion nezigotic, generat în cultură. Structura sa este analogă cu aceea a
embrionului zigotic. Embrioizii pot deriva din celule diploide („embrioni somatici”) sau din
celule haplo ide (din polen = embrioni androgenetici sau din celulele haploide ale sacului
embrionar al ovulului = embrioni ginogenetici). Are totdeauna caracteristică structura bipolară,
deținând un pol corespunzător mugurașului, și unul opus rădăciniței.
45) Embrion – organism tânăr, în primele stadii ale dezvoltării sale, de exemplu plantula din
sămânță.
46) Embrion somatic – (termen similar cu cel de embrioid) – embrion rezultat în urma diviziunii
repetate a celulelor somatice, celule care se organizează morfo -structural după tipicul
embrionului zigotic.
47) Explant – fragment dintr -un organism (apex, organe, fragmente de organe) detașate de la locul
de origine, și – eventual – cultivat, constituind piesa care inițiază o nouă cultură; operațiunea de
deprindere a explantului s e numește explantare .
48) Friabilitate – tendința celulelor de a se separa unele de altele.
49) Giberelinele – fitohormoni (naturali sau de sinteză) implicați în procesele de creștere în
lungime, mai ales a
50) internodiilor (reprezentant: acid giberelic, abreviat: AG 3 gau GA 3, de la „gibberellic acid” din
limba engleză);
51) Habituație – capacitatea celulelor de a crește în absența unor fitohormoni (sau regulatori de
creștere), ori vitamine, după o cultură – mai mult sau mai puțin îndelungată – în prezența unor
astfel de substanțe.
52) Hibrid somatic – hibrid (celulă mononucleată) rezultată din contopirea celulelor somatice,
derivate din părinți diferiți din punct de vedere genetic.

60 53) Hiperhidrie – transparentizare a țesuturilor și organelor vitroplantulelor, acestea dobân dind un
aspect sticlos, de unde și denumirea de culturi vitroase , fiind considerat un proces patologic.
Sticlozitatea , transparența și vitrificarea sunt termenii care au mai fost utilizați pentru descrierea
aceleiași abateri fiziologice.
54) Hormon vegetal (f itohormon) – substanță organică produsă de plante care – în cantități mici –
induce, inhibă sau modifică cantitativ creșterea, anteza, coacerea, abscizia foliară ș.a., prezentă
fiind, frecvent, în altă parte a plantei decât la locul ei de origine.
55) Implant – fragment excizat dintr -un organism și introdus ori grefat într -un alt organism sau
țesut.
56) Implantare – operațiune prin care o celulă, un fragment de țesut, este inserat sau grefat în
interiorul unui organism. În cazul special al culturilor de celule și țesuturi, implantarea
subînțelege includerea celulelor și a țesuturilor într -un mediu de cultură.
57) Incubarea – în cazul culturilor de celule și țesuturi, incubarea este răstimpul scurs de la
inoculare până la sfârșitul perioadei de creștere in vitro .
58) Inducere – inițierea structurii unei plante, organ sau a unor procese in vitro altfel spus cauzarea
inițierii unor structuri sau procese.
59) Inocul – cantitatea de celule aflate sau introduse într -un mediu de cultură, pregătit în acest scop.
60) Inoculare – operațiunea de amplasare a unui corp – organism, fragment de organism, calus,
celule, sau porțiune dintr -o vitrocultură – în sau pe un mediu nutritiv.
61) Interval de subcultură – intervalul de timp dintre două transplantări ale unei subculturi.
62) in vitro – (literar semnifică „in sticlă”) – se utilizează pentru desemnarea oricăror procese care
se petrec în condiții sterile de cultură sau noțiunea poate fi definită și ca o cultivare în condiții de
mediu artificial, folosind recipiente de cultură din sticlă sau din material plastic, în condiții
aseptice.
63) „In vivo” – (literar semnifică „în viață”) – se utilizează pentru definirea oricăror procese care se
petrec în organismul întreg, integru.
64) Lăstar – ramură tânără sau tulpiniță care crește la nivelul inoculului (calus, nod, fragment de
pețiol etc.), din muguri normali sau adventivi.
65) Linie celulară – cultură derivată dintr -o singură celulă. O „linie celulară” se obține prin izolarea
unei singure celule care formează apoi o cultură primară. Din aceasta, ulterior, se pot preleva
explante pentru o cultură care va aparține aceleiași linii.
66) Mediu de bază – mediu de control al unei culturi (de regulă, compușii anorganici și organici, de
bază, lipsit de regulatori de creștere sau alți fitoefectori).
67) Meristem – masiv ce lular, cu celule în proliferare, din care ulterior rezultă toate celelalte
categorii de țesuturi.
68) Meristematic – celule având caracter de meristem.

61 69) Meristemoid – grup de celule meristematice cu caracterele respective a cărui potențială
transformare în me ristem radicular sau caulinar este imprevizibilă; astfel de cazuri apar, mai ales
la nivelul calusului sau sunt localizate în alte zone decât meristemele.
70) Microexplantele – explante de dimensiuni microscopice sau, în sens mai larg, cele cu care se
opereaz ă la culturile in vitro .
71) Micropropagare – propagarea pe calea asexuată sau vegetativă, a plantelor in vitro (sinonim cu
propagarea in vitro și microînmulțire).
72) Morfogeneză – (dezvoltarea formei) – diferențiere histologică, complexă, care are ca rez ultat
constituirea organelor și individualizarea organismelor cu tot ceea ce au caracteristic ca formă
sau structură. Altfel spus, este procesul de creștere și dezvoltare a structurilor diferențiate, sau
dezvoltarea organismului, a unei părți din organism sau a unui organ de la zigot sau de la celula
inițială. Morfogeneza se petrece în timp, ea este înscrisă în programul genetic al celulelor și în
decursul desfășurării ei este confruntată, permanent, cu condițiile de mediu.
73) Multiplicare vegetativă – termen sinonim cu reproducere sau înmulțire asexuată.
74) Neoformație – formarea de structuri noi: țesuturi, meristeme, embrioizi, etc. Neoformațiunile se
constituie după dediferențiere.
75) Organogeneză – formarea și dezvoltarea organelor. În cazul particular al cult urilor de celule și
țesuturi vegetale, formarea de rădăcini și muguri care pot, în final, să regenereze întreaga plantă.
76) Parasexualitate – fenomene care fac tranziția între reproducerea sexuată și multiplicarea
vegetativă. În această categorie intră: apog amia, apomixia, partenogeneza, pseudomixia.
77) Pasaj – transferul sau transferarea celulelor, cu sau fără diluarea acestora, dintr -un vas de cultură
în altul. Termenul este sinonim cu cel de „subcultură”.
78) Plantulă (în engleză „plantlet”) – tulpiniță generat ă in vitro și înrădăcinată, ori embrionul
germinat.
79) Poliploid – celulă sau organism conținând trei (triploid), patru (tetraploid) sau mai multe seturi
de cromozomi, într -un nucleu.
80) Prelevat – a lua o anumită cantitate (relativ mică), dintr -o cantitate totală (recoltare).
81) Primordiu – grup de celule care reprezintă primul stagiu de dezvoltare al unui organ.
82) Proembrion – structură embrionară care precede formare embrionului sau faza inițială de
diferențierea a celulelor, țesuturilor, într -o formațiune si milară embrionului.
83) Promeristem – stadiu de meristem tânăr, fie el de tulpină sau de rădăcină, fie cu structură încă
nediferențiată.
84) Propagul – în sens larg: structuri folosite în înmulțirea vegetativă.
85) Protocorm – entitate morfoanatomică prezentă la or hidee, semințele după germinare generează
o formă tuberiformă, de culoare verde, din care va lua naștere o plantă complet conformată. În
culturile in vitro – la numeroase orhidee – din meristemul caulinar se formează tot un

62 protocorm, care poate genera o plantă, sau el se poate multiplica pe medii aseptice, generând alți
protocormi.
86) Protoplast – celulă debarasată de peretele pectocelulozic, sau, altfel spus, întreaga masă vie a
celulei.
87) Regulatori de creștere – sunt substanțe sintetizate chimic, cu rol similar cu cel al
fitohormonilor, dar sunt de natură exogenă, de obicei adăugate în mediile de vitrocultură.
88) Repicare – procedeu prin care un explant este transplantat sau răsădit într -un alt mediu de
cultură.
89) Reproducere – generare de noi indivizi. Exist ă mai multe moduri de reproducere: sexuată (cu
participarea gameților masculi și femeli) și asexuată: diviziune celulară, înmugurire, formare de
spori, partenogeneză, înmulțire vegetativă, etc.
90) Rizogeneză – procesul de diferențiere și de dezvoltare a rădă cinii.
91) Somatic – referire la părți (sau procese) vegetative.
92) Subcultură (vezi pasaj) – în culturile de țesuturi este definit procesul în care cultura este
subdivizată și apoi este transferată pe mediu de cultură proaspăt.
93) Totipotențialitate – proprietat ea celulei de a produce un organism întreg ori, altfel spus, este
capacitatea unei celule de a forma toate tipurile de celule conținute într -un organism adult.
94) Transplant – sistemul viu care este supus operației de transplantare.
95) Transplantare – operațiu nea prin care o celulă, un țesut sau un organ luat din corp este grefat în
altă parte a corpului, pe un alt organism sau pe un mediu de cultură.
96) Tumoare – țesut care se dezvoltă într -un organism prin înmulțire continuă, anormală, a
celulelor. Tumorile pot să apară în urma unei infecții (virale sau bacteriene) sau a tulburării
echilibrului hormonal, ori pot să aibă o cauză genetică.
97) Vitroplantulă – plantulă generată și crescută in vitro .
98) Vitrocultură – cultură practicată în condiții artificiale, în vase d in sticlă sau material plastic, în
general în regim aseptic, având o nutriție fie heterotrofă – inoculi care cresc exclusiv pe baza
compușilor organici din mediul de cultură, fie – mixotrofă – cormofitoinoculi care utilizează, în
mare parte, ca sursă eherg etică, glucidele din mediu, dar care și fotosintetizeză, grație clorofilei
prezente în cloroplastele din celulele sau țesuturile verzi, fie fotoautotrofă – cormofitoinoculi
care trăiesc în regim de vitrocultură, în lipsa glucidelor din mediile de cultură, proces care se
realizează la nivelul inoculilor care dețin cloroplaste, într -o atmosferă îmbogățită în CO 2 și într –
un regim intensificat de iluminare.

63 10. Bibliografie recomandată
1) BADEA, E.M., 2003, Plantele transgenice în cultură, Teză de doct orat.
2) BOREM, A., SANTOS, F.R., BOWEN, D.E., 2003, Understanding Biotechnology, Pretince Hall PTR.
3) CACHIȚĂ, C.D., 1987, Metode in vitro la plantele de cultură. Baze teoretice și practice. Ed. Ceres, București.
4) CACHIȚĂ, C.D., SAND, C., 2001, Biotehnologie vegetală vol. I Baze teoretice și practice. Ed. Mira Design,
Sibiu.
5) CACHIȚĂ, C.D., RAICU, P., BADEA, E., 1984, Culturile de celule vegetale – aplicații în agricultură. Ed.
Ceres, București.
6) CACHIȚĂ, C.D., DELIU, C., RAKOSY – TICAN, L., ARDELEAN, A., 2004, Tratat de biotehnologie
vegetală, Vol 1, Editura Dacia, Cluj – Napoca.
7) CACHIȚĂ, C.D., ARDELEAN, A., 2009, Tratat de biotehnologie vegetală, Vol 2, Editura Dacia, Cluj –
Napoca.
8) DOYLE, A., GRIFFITHS, J.B., 1999, Cell Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology, John Wiley
& Sons Ltd, New York.
9) DUMITRU, F., CAMPEANU, G., 2002, Progrese în Biotehnologie, Ars Docenti.
10) ECONOMOU, A.S., READ, P.E., 2003, Proceedings of the first international symposium on acclimatization
and establishment of micropropaga ted plants, Acta Horticulturae, 616.
11) GUNNING, B.E.S., 1996, Plant Cell Biology Structure and Function, Jones and Bartlett Publishers.
12) JURCOANE, Ș., SĂSĂRMAN, E., LUPESCU, I., ROȘU, A., BEREHOIU TAMBA, R., BANU, A., RĂDOI,
F., 2004, Tratat de biotehnologie, vol.1. Editura Tehnică.
13) JURCOANE, Ș., CORNEA, P., STOICA I., VASSU, T., 2006, Tratat de biotehnologie, vol.2. Editura Tehnică.
14) MORRIS, P.C., BRYCE, J.H., 2000, Cereal biotechnology, Woodhead Publishing Limited Cambridge,
England.
15) NICU, M.D., DUȚĂ, M., 199 7, Bazele teoretice ale Bioingineriei și Biotehnologiei. Ed. Garamond, București.
16) OKSMAH -CALDENTEY, K.M., BARZ, W.H., 2002, Plant Biotechnology and Transgenic Plants, Marcel
Dekker, Inc.
17) ROȘU, A., 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicații în ame liorare, Editura Ametist – 92, București.
18) SCHEPER, T., 2000, History of Modern Biotechnology I si II, vol 69 si 70, Springer.
19) SORAN, V., RAKOSY, T.L., ARDELEAN, A., 1993, Elemente de biotehnologie. Ed. Mirton, Timișoara.
20) TAJI, A.M., WILLIAMS, R.R., 1996, T issue culture of Australian plants, University of England Armidale
NSW.

CĂRȚI – BIBLIOTECA UNIVERSITĂȚII DIN ORADEA
(cota/autor/anul apariției/titlu/editura)

1. II 29993 – CACHIȚĂ, C.D., DELIU, C., RAKOSY – TICAN, L., ARDELEAN, A., 2004, Tratat de
biotehn ologie vegetală, Vol 1, Editura Dacia, Cluj – Napoca
2. CACHIȚĂ, C.D., SAND, C., 2001, Biotehnologie vegetală vol. I Baze teoretice și practice. Ed. Mira Design,
Sibiu
3. II 26670 – Scripcaru, V., Astărăstoae, A., 1998, Bioetica, științele vieții și drepturile omului, Editura Polirom,
Iași
4. I 4739 – Nicu, M.D., 1988, Biotehnologia și bioingineria, Editura Științifică și Enciclopedică, București
5. III 5430 – Nicu, M.D., Oprița, N., 1980, Biotehnologie, Editura Didactică și Pedagogică București
6. II 18341 – Nicu, M.D., 1984, O aventură a științelor vieții – biotehnologia, Editura Albatros București
7. IV 1492 – Constantinovici, D., 1998, Studii privind micropropagarea și conservarea in vitro a unor specii
vegetale, Editura Universității din Oradea.
8. IV 14718 – Bălan, M., 1998, Studii privind micropropagarea in vitro la plantele furajere ( Dactylis glomerata L.
și Trifolium repens L. – Teză de doctorat
9. Cachiță și colaboratorii, toate Lucrările Simpozioanelor de Culturi de Țesuturi și Celule Vegetale, editiile: IV,
VII și VII I;
10. CACHIȚĂ, C.D., ARDELEAN, A., 2009, Tratat de biotehnologie vegetală, Vol 2, Editura Dacia, Cluj –
Napoca.
11. Vancea (Petrus) Adriana, 2007, Modificări morfoanatomice, fiziologice și biochimice apărute la nivelul
plantulelor cultivate in vitro , în momentu l aclimatizării lor la mediul septic de viață – Teză de doctorat
12. Turcuș, V., Cachiță, C.D., 2009, Particularități de micropropagare la Drosera rotundifolia , ”Vasile Goldiș”
University Press.
13. Petrus -Vancea, A., Cachita, D., Purcărea, C., 2013, Metode bioecoeconomice de multiplicar e și
conservare a plantelor. ”Vasile Goldis” University Press.